Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 12
Глава I. Клинико-функциональное состояние почек у больных бруцеллезом 12
Глава II. Состояние антиоксидантной системы при различных инфекционных заболеваниях 14
Глава III. Состояние цитокинового статуса у больных бруцеллезом 17
Глава IV. Современные аспекты лечения больных бруцеллезом 21
Часть II. Собственные исследования 26
Глава I. Материалы и методы 26
1.2. Методы исследования, примененные в работе 35
1.2.1. Амперометрический метод определения низкомолекулярных и белковых сульфгидрильных групп в крови 37
1.2.2. Количественное определение дисульфидных связей в белках и низкомолекулярных соединениях крови 38
1.2.3. Определение перекисного окисления липидов в плазме крови 39
1.2.4. Определение общей антиокислительной активности плазмы крови 39
1.2.5. Статистическая обработка данных 41
Глава II. Клинико-лабораторная оценка состояния почек у больных бруцеллезом 42
Глава III. Состояние иммунной системы у больных бруцеллезом 50
Глава IV. Состояние антиоксидантной системы у больных бруцеллезом 57
Глава V. Клинико-лабораторная оценка состояния мочевыделительной, антиоксидантной систем и цитокинового статуса у больных бруцеллезом, на фоне различных методов лечения 63
5.1. Клиническая эффективность различных методов лечения больных бруцеллезом 64
5.2. Состояние цитокинового статуса у больных бруцеллезом, на фоне различных методов лечения 85
5.3. Состояние антиоксидантной системы у больных бруцеллезом, на фоне различных методов лечения 92
Заключение 98
Выводы 110
Практические рекомендации 111
Литература 112
- Состояние цитокинового статуса у больных бруцеллезом
- Состояние иммунной системы у больных бруцеллезом
- Клиническая эффективность различных методов лечения больных бруцеллезом
- Состояние антиоксидантной системы у больных бруцеллезом, на фоне различных методов лечения
Состояние цитокинового статуса у больных бруцеллезом
Бактерии, вирусы и другие инфекционные агенты имеют различные способы выживать и размножаться в макроорганизме. В иммунном ответе на внедрение бруцелл отражаются уникальные особенности возбудителя. Гладкая липополисахаридная оболочка бруцелл (S-формы) не способна активировать альтернативный путь системы комплемента. Бруцеллы резистентны к действию полиморфноядерных лейкоцитов за счет супрессии миелопероси-дазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы. Играют роль и ингибиторы АМФ- и ГМФ-опосредованных внутриклеточных реакций. При бруцеллезе выявлены нарушения активности естественных киллеров и снижение образования свободных радикалов макрофагами, сужение спектра функций гамма-интерферона, подавление апоптоза фагоцитов и экспрессии цитокинов, обеспечивающих адекватный иммунный ответ [35, 104, 110, 133, 134].
Важную роль на ранней стадии инфицирования играют V9V-Т-лимфоциты. В крови содержание этих клеток значительно увеличивается. Показано, что V9V-Т-лимфоциты могут быть специфически активированы низкомолекулярными соединениями небелковой природы, полученными из лизата B. suis, или факторами, продуцируемыми инфицированными макрофагами. Стимулированные V9V-Т-лимфоциты секретируют гамма-интерферон (-ИФ) и ФНО- и уменьшают размножение бруцелл в фагосо-мах, в том числе за счет цитотоксической активности [133].
Функция CD4 лимфоцитов имеет лимитирующее значение и складывается из непосредственного воздействия на инфицированные макрофаги, а также стимулирования клонального размножения цитолитических CD8 клеток. В этих процессах отводится значение V9V-клеточным рецепторам. Увеличение количества /-CD4 и CD8 лимфоцитов является характерным для бруцеллеза [13, 35, 62, 63, 104, 133].
Исследования ряда авторов показали, что главная роль при бруцеллезе придается эффектам -ИФ, который стимулирует продукцию активных форм кислорода и NO макрофагами, индукцию апоптоза, усиливает дифференци-ровку лимфоидных клеток и синтез цитокинов, обеспечивает превалирование IgG подкласса 2a, увеличивает экспрессию молекул major histocompatibility complex (МНС – главный комплекс гистосовместимости). Обнаружено, что выраженность эффектов -ИФ зависит от полиморфизма его гена. Оказалось, что люди, гомозиготные по аллелю +874А, более склонны к возникновению бруцеллеза и туберкулеза. Обычно при бруцеллезе уровень -ИФ в крови повышен [62, 63, 66, 104].
Проведенные исследования выявили у больных бруцеллезом нарушения различных звеньев иммунной системы, а именно: Т- и В-клеточных звеньев, мононуклеарно-фагоцитарного звена, а также цитокинового статуса. Изучение Т- и В-клеточных звеньев иммунитета у больных бруцеллезом выявили значительное снижение содержания в периферической крови абсолютного количества СД3, СД4- и СД8-лимфоцитов в сравнении с контрольной группой. Более значимое снижение указанных клеток выявлялось у больных с острой формой бруцеллеза. Количество CD20–лимфоцитов снижалось в группе больных хроническим и увеличивалось у больных острым бруцеллезом [13].
При изучении состояния клеточного иммунитета, содержания циркулирующих иммунных комплексов, сывороточных иммуноглобулинов и специфических антител, активности фагоцитоза у больных бруцеллезом К.Б. Курмановой было выявлено наличие дисбаланса во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов и их регуляторных субпопуляций, снижение фагоцитоза [63].
Павловой О.М. [100] была проведена комплексная, сравнительная оценка субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток в периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом. Сравнительное исследование in vitro спонтанной и стимулированной продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови больных острым и хроническим бруцеллезом, показало характерную динамику изменений иммунологических показателей в процессе хронизации бруцеллезной инфекции. Работами ряда авторов было показано, что у больных острым бруцеллезом наблюдается повышение в крови количества СД 16-лимфоцитов, увеличение активности нейтрофилов по данным НСТ-теста и активности макрофагов за счет увеличения продукции ими ИЛ1 и ФНО. В процессе хронизации бруцеллеза наблюдается уменьшение абсолютного количества нейтрофилов в периферической крови и снижение активности макрофагов за счет низкого уровня продукции ИЛ1 и ФНО. При остром бруцеллезе наблюдается увеличение активности плазматических клеток, на что указывает повышение уровня иммуноглобулинов всех классов в сыворотке крови. Однако финальные процессы дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки у этих пациентов нарушены, на что указывает низкий уровень продукции ИЛ6 и увеличение содержания в крови CD21-лимфоцитов. У больных хроническим бруцеллезом активность плазматических клеток снижается, на что указывает низкий уровень продукции IgM. Дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки нарушается на всех этапах, подтверждением чего является низкий уровень продукции ИЛ6 и ИЛ4.
Активность клеточного звена иммунитета при остром бруцеллезе снижена о чем свидетельствует уменьшение количества CD3 и CD4-лимфоцитов и низкая продукция ИЛ2. У больных хроническим бруцеллезом нарушение клеточного иммунитета прогрессирует, что подтверждается снижением у них количества не только CD3 и CD4, но и СD8-лимфоцитов, а также низким уровнем продукции ИЛ2 и ИЛ4. Уменьшение абсолютного количества нейтрофилов, моноцитов, CD4, CD8, CD21-лимфоцитов и Ig M в периферической крови, а также снижение спонтанной и стимулированной продукции ИЛ1Р, ИЛ4, ИЛ6 и ФНОа в смешанной культуре мононуклеарных клеток in vitro можно расценивать как неблагоприятный прогноз в отношении хрони-зации бруцеллеза [100].
В исследовании на добровольцах, вакцинированных Rev 1 против B. melitensis, описана динамика гуморального иммунного ответа. Ig M и Ig G появляются на первой и второй неделе инфекционного процесса, соответственно. Их уровень достигает пика на 4 неделе. Титры иммуноглобулинов М в сыворотке остаются в течение первых 6 месяцев выше, чем уровень Ig G. В целом, иммуноглобулины М и G присутствуют в крови вакцинированных почти год. Секреция Ig A совпадает с появлением Ig G и продолжается в течение 6 месяцев, что говорит о хроническом процессе [62, 89, 97, 104]. Гуморальный ответ при бруцеллезе, хотя и не представляет сложностей в диагностике, имеет ограниченное значение в иммунной реакции организма [104]. Имеются также работы, в которых оценивалась возможность использования данных об иммунологических сдвигах в прогнозировании течения бруцеллеза [13, 45, 46, 126].
Таким образом, открытие биологически активных веществ - цитокинов, регулирующих пролиферацию и уровень функциональной активности клеток как в норме, так и при патологии, позволяет с новых позиций оценить механизм формирования воспалительных реакций, аллергических и иммунных состояний и разработать новые методы прогнозирования характера инфекционного заболевания. Между тем, в доступной литературе роль нарушений обмена цитокинов при бруцеллезе не получила достаточного освещения, что и определяет актуальность исследований, проводимых в этом направлении.
Состояние иммунной системы у больных бруцеллезом
У наблюдаемых нами женщин, больных различными клиническими формами бруцеллеза, был проведён анализ цитокинового статуса каждой группы обследованных женщин.
Снижение уровня гемоглобина при бруцеллезе может быть результатом воздействия на организм провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, интер-ферона-, ФНО, неоптерина), так как они подавляют высвобождение железа из клеток макрофагов, разрастание эритроидного ростка за счет угнетения выработки эритропоэтина в почках. Доказательством этого является наличие обратной связи между уровнем гемоглобина и концентрацией ИЛ-1 (Rxy -0,164; P = 0,05 при k = 178), ИЛ-6 (Rxy -0,044; P 0,05) и ФНО (Rxy -0,190; P 0,05).
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) служат показателем активности аутоиммунного заболевания. Так, титр ЦИК находится в тесной прямой связи с СОЭ (Rxy 0,262; P 0,01 при k = 178), концентрацией ревмо-фактора (Rxy 0,507; P 0,001) и С-РБ (Rxy 0,522; P 0,001). Оценивая активность воспаления по ЦИК можно утверждать, что наибольшая активность заболевания наблюдается при остром и хроническом бруцеллезе (табл. 24).
Проведенный анализ результатов определения значений ИЛ-6 показал, что амплитуда колебаний уровня ИЛ-6 в крови при бруцеллезе значительная по сравнению с группой здоровых. Однако, разница между уровнем ИЛ-6 в крови у больных бруцеллезом различных форм статистически не отличалась достоверно от референсных значений. Медианные значения ИЛ-6 при остром и хроническом бруцеллезе в 4-4,5 раза превышали норму (рис. 4).
Сравнительный анализ уровня ФНО- в группах больных бруцеллезом и здоровых женщин показал, что на фоне бруцеллезной инфекции у женщин отмечается 3-кратное превышение медианы уровня провоспалительного ци-токина ФНО- относительно медианы в норме (рис. 5).
Результаты сравнительного анализа уровня ЦИК в группах больных бруцеллезом и без него показали, что медиана ЦИК у женщин с острым и хроническим бруцеллезом в 3 раза выше, чем у здоровых женщин, а при по-достром бруцеллезе – в 1,5 раза выше. При этом разница уровней ЦИК в крови у больных женщин была достоверной по отношению к нормальному уровню (рис. 6).
Данные биохимического анализа крови показали, что уровень ревматоидного фактора значительно повышен при бруцеллезе, особенно при хроническом течении. Аналогичная картина наблюдается и с уровнем СРБ (табл. 23).
Сравнительный анализ уровня ревматоидного фактора у больных бруцеллезом различных клинических форм показал, что наибольший уровень ревмофактора наблюдался при хроническом бруцеллезе (Ме 25; Р25 21 и Р75 25 МЕ/мл) по сравнению с подострым бруцеллезом (Ме 13; Р25 12 и Р75 18 МЕ/мл), в то время как для всех форм бруцеллеза (Ме 19; Р25 15 и Р75 22 МЕ/мл) характерно значительное повышение уровня ревмофактора по отношению к нормальным значениям у здоровых женщин (Ме 2; Р25 1 и Р75 5 МЕ/мл) (рис. 7).
Соотношение концентрации СРБ в группах больных женщин с различными формами бруцеллеза было аналогичным соотношениям ревмофактора (рис. 8).
Сравнительный анализ показателей иммунного статуса у женщин, больных бруцеллезом с поражением почек и без такового показал, что в группе больных с поражением почек отмечаются более выраженные отклонения от показателей группы здоровых лиц (табл. 26).
Выявленные нарушения иммунного статуса у больных бруцеллезом с поражением почек свидетельствуют о значительной роли иммуноопосредо-ванных реакций в развитии органопатологии при бруцеллезной инфекции.
Показатели уровней ревматоидного фактора и С-реактивного белка у женщин, больных бруцеллезом с поражением почек, являющихся индикаторами аутоиммунных реакций в организме, также превышали аналогичные показатели группы больных бруцеллезом без поражения почек и здоровых лиц (табл. 27).
Таким образом, результаты проведенного сравнительного анализа показателей иммунитета свидетельствуют о том, что течение бруцеллезной инфекции у женщин с поражением почек имеет связь с иммунным статусом больных. Данный факт может служить обоснованием для применения показателей иммунитета с целью оценки эффективности терапии бруцеллеза и его осложнений.
Клиническая эффективность различных методов лечения больных бруцеллезом
Эффективность лечебной схемы [19, 58], включающей антибактериальные, противовоспалительные и десенсибилизирующие средства (в контрольной группе 77 больных получали стандартное лечение; в основной группе 73 больной бруцеллезом женщины получали галавит в комбинации со стандартной терапией).
Как видно из таблицы 33, длительность стационарного лечения и сроки исчезновения симптомов бруцеллеза у больных женщин, пролеченных гала-витом в комбинации с общеклинической схемой имели тенденцию к уменьшению по сравнению с стандартным лечением. Отмечается клинически значимое сокращение сроков лечения и улучшения самочувствия больных бруцеллезом при комбинации с галавитом. При этом наиболее выраженного сокращения сроков исчезновения удалось достигнуть по ознобу и общей слабости.
Таким образом, динамика симптомокомплекса интоксикации при бруцеллезе показала лучший результат при комбинации с галавитом, чем в группе без этого препарата, особенно по отношению к ознобу и слабости.
Проведенный анализ эффективности лечения в группе с применением галавита свидетельствует о снижении числа лейкоцитов при пробе Нечипо-ренко у больных различными формами бруцеллеза. Так, доля больных, у которых число лейкоцитов при пробе Нечипоренко после лечения нормализовалось ( 2000/мл), в среднем составляет 90%. Высокие значения числа лейкоцитов ( 4000/мл) были отмечены до лечения галавитом у 27 (37%) женщин, больных бруцеллезом, только у 9 (12%) больных показатель не нормализовался, но снизился до уровня 2000-3500/мл.
Как видно из таблицы 34, эффективность галавита при пробе по Нечи-поренко у больных с острым бруцеллезом выше, чем в группе женщин с хро ническим бруцеллезом, но разница между группами статистически не достоверная.
В группе больных, получавших общую терапию, лечение было более эффективным при подостром и хроническом бруцеллезе, чем в группе больных острым бруцеллезом, но разница между эффективностью лечения в группах различной формой бруцеллеза была незначительной.
Результаты исследования картины гемограммы больных до и после общей терапии бруцеллеза с поражением почек представлены в таблице 35. В общем анализе крови у этих больных женщин не претерпели изменений такие показатели как гемоглобин, число нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов, тогда как СОЭ, общее число лейкоцитов, эритроцитов и эозинофилов достоверно уменьшилось после лечения по сравнению с исходным уровнем до лечения. Следует отметить, что снижение СОЭ после общей терапии бруцеллеза составило 28% по сравнению со значением до лечения, снижение числа лейкоцитов – на 13%, числа эозинофилов – на 17%, эритроцитов – на 5%.
Изменения показателей гемограммы в группе галавита несколько отличались от группы общей терапии. Так, отмечено значительное снижение СОЭ (на 76%) и числа лимфоцитов (на 17%), в то время как уровень гемоглобина повысился на 5% относительно исходного уровня (табл. 36).
Изучение показателей биохимического анализа крови больных бруцеллезом в группе общей терапии показало, что на фоне неизменной скорости суточного выведения мочевины мочой наблюдается достоверное повышение суточного выведения креатинина после лечения по сравнению с исходным уровнем, хотя у них одновременно незначимо повышается клубочковая фильтрация (табл. 39).
Неоднозначные изменения в анализах крови и мочи, вероятно, объясняются различным влиянием лечения на показатели крови и мочи при остром, подостром и хроническом бруцеллезе, что требует раздельной оценки эффективности терапии в каждой группе клинических форм бруцеллеза.
В группе больных острым бруцеллезом общая терапия способствует значительному снижению СОЭ и числа лейкоцитов крови (табл. 41).
Влияние галавита на показатели гемограммы у больных острым бруцеллезом носит иной характер, нежели влияние общей терапии. Галавит достоверно повышает уровень гемоглобина в крови, незначительно - число эритроцитов. При лечении галавитом больных острым бруцеллезом СОЭ снижается в 3,5 раза и наблюдается незначительное уменьшение числа лейкоцитов, в основном за счет нейтрофилов и лимфоцитов (табл. 42).
Состояние антиоксидантной системы у больных бруцеллезом, на фоне различных методов лечения
Оценка антиоксидантного действия галавита у женщин, больных бруцеллезом, имеет фундаментальное и прикладное значение. Для сравнительного анализа антиоксидантной эффективности галавита у всех больных, включенных в исследование, определяли уровень ПОЛ, SH- и SS-групп, а также ТДК до и после лечения (табл. 66).
Комплексная терапия с включением галавита больных бруцеллезом женщин сопровождался достоверным снижением ПОЛ в 2,3 раза (Р=0,003) при остром бруцеллезе, в 1,3 раза (P=0,061) – при подостром и в 1,6 раза (Р=0,002) – при хроническом. Динамические изменения концентрации SH-групп в крови характеризуются тенденцией к повышению, тогда как концентрация SS-групп имеет свойственные ей особенности, то есть при остром и подостром бруцеллезе показатель после лечения галавитом повышается, а при хроническом бруцеллезе – снижается. Сравнительный анализ динамики ТДК показывает, что лечение галавитом больных острым и хроническим бруцеллезом сопровождается повышением, подострого – снижением показателя (табл. 66).
Следует обратить внимание на достоверные изменения показателей АОС после лечения галавитом женщин, больных острым бруцеллёзом. Так, на фоне значительного снижения ПОЛ и концентрации SS-групп отмечалось достоверное повышение содержания SH-групп в крови и ТДК при остром бруцеллезе (рис. 9).
Особенность динамики АОС при лечении галавитом больных подост-рым бруцеллезом, характеризуется наличием незначительной динамики показателей. На фоне незначимого снижения ПОЛ и ТДК отмечается значительное повышение уровня SH-групп, а также SS-групп (рис. 10).
Направленность изменений показателей АОС после лечения галавитом больных хроническим бруцеллёзом была аналогична таковой при остром бруцеллезе. При этом достоверное снижение ПОЛ (в 1,6 раза, Р=0,002) и SS-групп (в 1,2 раза, Р=0,001) сопровождается повышением уровня SH-групп (в 1,3 раза, Р=0,042) и ТДК (в 1,9 раза, Р=0,037) (рис. 11).
Следовательно, комплексное лечение с включением галавита больных острым и хроническим бруцеллезом, оказывает благоприятное влияние на АОС, тогда как при подостром бруцеллезе эффективность препарата не столь демонстративна по сравнению с другими формами бруцеллеза.
Анализ эффективности применения галавита в комплексной терапии женщин, больных бруцеллезом с поражением почек, показал более выраженные изменения показателей АОС в группе больных с поражением почек по сравнению с таковыми без поражения почек (табл. 67).
Значения активности АОС в группах больных статистически не отличались между собой.
Анализ результатов исследования показал, что снижение буферной емкости тиолдисульфидного звена АОС, повышение уровня малонового диаль-дегида, являющегося маркером оксидативного стресса, и глутатион пероксидазы - катализатора реакции восстановления перекисных липидов, наблюдаемое у женщин, больных бруцеллезом, до начала лечения, имели тенденцию к нормализации, при этом у больных с поражением почек и у больных без поражения почек в группе галавита достоверной разницы указанных показателей между группами после лечения не выявлено.
Таким образом, галавит при лечении бруцеллеза у женщин проявляет значительный антиоксидантный эффект, что объясняет не только его иммуностимулирующее действие, но и выраженную клиническую эффективность препарата.
Результаты исследования клинической, иммунотропной и антиокси-дантной активности галавита позволяют рекомендовать препарат в качестве дополнительного средства для повышения эффективности лечения всех форм бруцеллеза.