Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Рак толстого кишечника и его характеристики 10
1.2. Воспаление и онкогенный процесс 12
1.3. Цитокины как главные медиаторы воспаления, вызванного опухолевым процессом 16
Глава 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Реактивы и оборудование 29
2.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 35
2.4. Подготовка тканевых лизатов для изоляции РНК и белков 35
2.5. Выделение РНК, обратная транскрипция и количественная ПЦР в реальном времени 35
2.6. Выделение IEL и LPL из опухолей и эпителия толстого кишечника мыши 36
2.7. Иммунофлуоресцентный анализ и сортировка клеток на проточном 37
2.8. Внутриклеточное окрашивание цитокинов 38
2.9. Сортировка иммунных и эпителиальных клеток ткани толстого кишечника мыши на проточном цитофлуориметре 38
2.10. ИФА для измерения концентрации белка ИЛ-1а и ИЛ-1р 39
2.11. Обработка мышей препаратом «Анакинра» (рекомбинантный синтетический ингибитор рецептора интерлейкина-1) 40
2.12. Подготовка и иммуногистохимическое окрашивание образцов опухолей мышей 40
2.13. Получение образцов бактериальной ДНК для секвенирования 41
2.14. Секвенирование бактериальной рРНК 41
2.15. Выделение нейтрофилов из костного мозга, селезенки и перитонеальной полости 41
2.16. Стимулирование нейтрофилов рекомбинантным белком ИЛ-10 42
2.17. Функциональный анализ фагоцитирующей и антимикробной элиминирующей способности нейтрофилов 42
2.18. Исследование нейтрофилов с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии 43
2.20. Статистическая обработка данных 43
Глава 3. Результаты 44
3.1. Экспрессия мРНК ИЛ-1 и ИЛ-10 повышенна в популяции моноцитов в модели спонтанного РТК (рак толстого кишечника) в мышах APCdel/wt 44
3.2. Уровень цитокинов ИЛ-1а и ИЛ-10 повышен в опухолевой ткани СРТК 47
3.3. Изучения влияния ингибитора ИЛ-1R (“Анакинра») на экспрессию цитокина ИЛ-17А в иммунных фракциях опухолей толстого кишечника 48
3.4. Изучение влияние ИЛ-1 на воспаление по типу Th17 (TEI) в модели СРТК 50
3.5. Изучение влияния ИЛ-1 рецептора на развитие СРТК в модели APCflox/wt CDX2cre+ 52
3.6. Изучение влияния рецептора ИЛ-1, экспрессируемого эпителиальными клетками кишечника на развитие СРТК 55
3.7. Изучение роли сигнального пути ИЛ-1 в Т-клетках в модели СРТК 58
3.8. Изучение роли сигнального пути рецептора ИЛ-1 в клетках миелоидного ряда в модели СРТК 62
3.9. Изучение роли бактерии, ассоциированных с опухолью на развитие СРТК 66
3.10. Изучение роли ИЛ-Ж-сигнального пути в нейтрофилах в модели СРТК 78
3.11. Сигнальный путь ИЛ-1R регулирует антибактериальные функции в нейтрофилах в СРТК 83
Глава 4. Обсуждение результатов 90
Выводы 107
Список литературы 108
- Цитокины как главные медиаторы воспаления, вызванного опухолевым процессом
- Экспрессия мРНК ИЛ-1 и ИЛ-10 повышенна в популяции моноцитов в модели спонтанного РТК (рак толстого кишечника) в мышах APCdel/wt
- Изучение роли сигнального пути ИЛ-1 в Т-клетках в модели СРТК
- Сигнальный путь ИЛ-1R регулирует антибактериальные функции в нейтрофилах в СРТК
Цитокины как главные медиаторы воспаления, вызванного опухолевым процессом
ИЛ-1 является центральным медиатором воспаления, а также важным компонентом врожденного и приобретенного иммунитета. Семейство цитокинов ИЛ-1 включает 11 родственных и похожих по нуклеиновой и аминокислотной структуре молекул, из которых насчитывается по крайней мере 8 цитокинов-лигандов с различными активностями (ИЛ-1а и ИЛ-ір, ИЛ-18, ИЛ-33, ИЛ-36а, ИЛ-ЗбЬ, ИЛ-36g, ИЛ-37) и 3 рецептора-антагониста (ИЛ-lRa, ИЛ-ЗбЯа, ИЛ-38) (Garlanda, 2013). ИЛ-la и ИЛ-10 как у человека, так и у мыши кодируются отдельными близко сцепленными генами и имеют определенную степень белковой гомологии, а также связываются с одним и тем же рецептором ИЛ-lRl, имея похожие физиологические эффекты (Garlanda, 2013).
ИЛ-1 имеет два рецептора: ИЛ-1R1 (тип 1) и ИЛ-1R2 (тип 2) с молекулярной массой 80 кД и 68 кД соответственно. Рецепторы для ИЛ-1 экспрессируются на большинстве типов клеток в организме, включая Т-клетки, миелоидные клетки, фибробласты и эпителиальные/раковые клетки. ИЛ-1R1 является непосредственным сигнальным рецептором, в то время как рецептор типа 2 необходим для связывания растворимого цитокина и образования его комплекса с рецептором первого типа. Внеклеточная связывающая часть рецептора организованна в три иммуноглобулин-подобных домена, что позволяет отнести этот белок к иммуноглобулиновому суперсемейству. Для цитокинов семейства ИЛ-1 также часто характерно присутствие эндогенных регуляторов и ингибиторов передачи сигнала, таких как антагонист ИЛ-1Rа, который не способен активировать рецептор, но, связываясь с ним, затрудняет активацию рецептора агонистами, действуя как отрицательный регулятор биологической активности ИЛ-1.
Передача сигнала от ИЛ-1 через поверхностный ИЛ-1R представляет собой эволюционно консервативный механизм гомологичный Toll-подобному сигнальному пути (TLRs) (Carpenter, O Neill, 2007; Kawai, Akira, 2007) и осуществляется при помощи привлечения и димеризации молекулы-адаптера MyD88, который, в свою очередь, необходим для привлечения и активации протеинкиназы IRAK1 (Apte, Voronov, 2008). Активная IRAK1 служит для запуска последующих сигнальных путей, которые ведут к активации нескольких киназ семейства MAPK, а также к активации NF-B и индукции воспалительного ответа. Таким образом, ИЛ-І/ИЛ-1R сигнал изначально запускается при активации NF-B, так как NF-B необходим для экспрессии мРНК и незрелой формы белка ИЛ-1. В некоторых ситуациях благодаря тому, что микробные компоненты и продукты повреждения тканей, а также ИЛ-1R используют тот же самый внутриклеточный сигнальный путь, ИЛ-1R может также служить ключевым активатором NF-B, и замещать в этой функции Toll-подобные рецепторы (Apte, Voronov, 2008). В то время как в одних типах рака микробные компоненты для активации NF-B всегда присутствуют в избытке (РТК, рак желудка и кожи, а также рак печени, вызванный вирусами гепатита), другие, более «стерильные» виды рака, могут осуществлять активацию NF-B посредством секреции и действия таких цитокинов, как ИЛ-1.
Как уже отмечено выше, два лиганда для ИЛ-IR — это ИЛ-1а и ИЛ-1Р, которые при связывании с рецептором вызывают очень схожие последствия в плане передачи сигнала, активации внутриклеточных сигнальных путей и регуляции экспрессии генов. Различия между ИЛ-1а и ИЛ-ір в основном существуют на этапе синтеза этих цитокинов различными типами клеток, а также в механизме их активации. Например, белок ИЛ-1а локализуется в ядре или цитоплазме, в то время как ИЛ-ір никогда не детектировался в ядре. ИЛ-ір синтезируется в форме белка-предшественника и является активным только в секретируемой внеклеточной форме, которая образуется при протеолитическом расщеплении посредством каспазы-1, активированной компонентами белковых комплексов-инфламмасом (inflammasomes), или же другими протеазами, которые активны при гибели или повреждении клеток (например, катепсины).
ИЛ-1а в свою очередь, существует, как в мембрано-связанной, так и в зрелой секретируемой форме. Долгое время господствовала парадигма, что ИЛ-1а не имеет белка-предшественника и не требует протеолитической активации. Тем не менее опубликованные работы показывают, что обе формы цитокина способны регулироваться по-разному. Так, мембрано-связанная форма требует лишь активации NF-B, в то время как секретируемый цитокин ИЛ-1а нуждается в дополнительных стимулах активации от комплексов-инфламмасом и каспазы-1 (Fettelschoss et al, 2011; Rider et al., 2011). Также и биологическая активность, и продукция ИЛ-1а может регулироваться посредством различных протеолитических ферментов, таких как гранзим В, каплаин и эластаза нейтрофилов. Более того, при определенных условиях, ИЛ-1Р также может быть синтезирован и высвобожден без участия каспазы-1 и активации инфламмасомы (Gross et al., 2012).
Следует отметить, что профиль экспрессии ИЛ-1 весьма различен -он может продуцироваться как паракринно, так и аутокринно, а также другие цитокины могут стимулировать его продукцию. Например, ИЛ-17А в значительных количествах присутствует в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом и провоцирует синтез ИЛ-1 (Nakae et al, 2003). Как и множество процессов в биологии, данный механизм работает и в обратную сторону - ИЛ-1 р участвует в дифференцировке, активации и выживаемости ИЛ-17А-продуцирующих Т-хелперных клеток (Th17 клеток). Раковые клетки напрямую могут продуцировать ИЛ-1 или могут стимулировать клетки из микроокружения опухолей для его продукции (Carmi et al, 2011). В целом в микроокружении опухолей ИЛ-10 экспрессируется различными эпителиальными клетками, клетками, подверженными процессам старения и миелоидными клетками, такими как дендритные клетки, макрофаги, моноциты и нейтрофилы. ИЛ-1а экспрессируется в основном внутри эпителиальных и опухолевых клеток. Оба цитокина являются медиаторами воспаления, которое способствует канцерогенезу, инвазивности опухоли и локальной иммуносупрессии (Voronov et al., 2013), но в то же время могут играть и положительную роль, активируя противоопухолевый компонент иммунной системы и усиливая узнаваемость и иммуногенность опухолей, которые высвобождают ИЛ-1, ведя к активации противоопухолевого иммунного ответа (Voronov et al., 2003; Dinarello, 2006; Carmi et al, 2013; Voronov et al, 2013).
В ранних работах ИЛ-1 описывался только как важный медиатор острого и хронического воспаления (Finnegan, Doodes, 2008; Dinarello, 2011; Rider et al., 2011). Однако в последнее время началось активное изучение его роли на всех стадиях канцерогенеза (возникновение, прогрессия, малигнизация и инвазивность опухоли). Например, появляются данные об уровне экспрессии цитокина как биологического маркера для прогноза ремиссии болезни или устойчивости к терапии, а также проведены первые исследования о роли ИЛ-1 в подавлении или активации противоопухолевого иммунитета (Dinarello, 2006).
Важным потенциальным индикатором участия в онкогенном процессе является увеличение экспрессии мРНК и белковой формы как ИЛ-1а, так и ИЛ-1р в опухолях различной природы относительно нормальной ткани, а также усиление экспрессии этих цитокинов при воздействии на опухоль химио- или радиотерапией.
Известна и доказана как прямая, так и косвенная роль ИЛ-1 в развитии опухоли, но большинство информации о роли ИЛ-1 в канцерогенезе представлено эффектами ИЛ-1 на инвазивность уже существующих злокачественных клеток. Так, например, у онкологических больных чаще всего локальное повышение уровня ИЛ-1 коррелирует с высокой инвазивностью опухоли и негативным прогнозом (Apte et al., 2000), что зачастую обусловлено способностью ИЛ-1 ускорять процесс ангиогенеза или же просто регулировать выживание опухолевых клеток, находящихся под воздействием стандартных форм противоопухолевой терапии (Voronov et al., 2014).
Как один из главных воспалительных цитокинов, ИЛ-1 несомненно является важным компонентом микроокружения опухолей (Apte et al., 2006; Mantovani et al, 2008). ИЛ-1 служит одним из активирующих сигналов для продукции других провоспалительных цитокинов и привлечения воспалительных и цитокин-продуцирующих иммунных клеток в микроокружение опухолей, а также является стимулом для фагоцитов, эндотелиальных, стромальных и других инфильтрирующих в опухоль клеток к выработке потенциально токсичных веществ (активных форм кислорода (ROS) и азота (NO)), проонкогенных транскрипционных факторов (NF-кВ, STAT3), белков регуляторов клеточного деления и молекул адгезии (ICAM1) (Apte et al, 2006; Carmi et al, 2013; Voronov et al, 2013). Было показано, что мыши ИЛ-Іа имеют сниженный уровень некротического воспаления и менее выраженный колит, предшествующий развитию колит-ассоциированного рака кишечника, а также изменения в противоопухолевом иммунитете (Voronov et al, 2003). С другой стороны, ИЛ-1а является компонентом сигнальных путей, которые прямо связаны и регулируются онкогенными генетическими механизмами возникновения рака (например, мутацией онкогена Кras) (Salcedo et al, 2010). Другие работы также утверждают, что ИЛ-ір необходим для индукции опухолевого ангиогенеза, распространения и роста метастатических клеток (Apte et al, 2006). В тоже время известно, что ИЛ-ір способен усиливать секрецию цитокинов Th9-клетками, обладающими противораковой активностью (Vegran et al., 2014). Интересным фактом является то, что несмотря на свою общую природу, роль ИЛ-1а и ИЛ-ір в иммунитете, воспалении и раке может быть похожей, а может и существенно различаться.
Экспрессия мРНК ИЛ-1 и ИЛ-10 повышенна в популяции моноцитов в модели спонтанного РТК (рак толстого кишечника) в мышах APCdel/wt
При проведении работы в качестве модели спонтанного рака толстого кишечника (СРТК) использовалась линия мышей APCfl/wtCDX2cre+. В данной линии ген АРС содержит 2 аллели - одна из которых дикого типа (wt), а вторая - окружена loxp сайтами (flox-флоксированная аллель). Кроме того, у данных мышей ген сге-рекомбиназы находится под контролем промотора гена СDX2p9.5 человека. Как было показано (Hinoi et al, 2007) данный фрагмент обеспечивает активацию сге-рекомбиназы в эпителиальных клетках толстого кишечника трансгенной мыши. Активация сге-рекомбиназы приводит к потере одного аллеля. Затем происходит спонтанная потеря второго аллеля и развивается опухоль, причем - в дистальном отделе толстого кишечника, т.е. локализация опухоли аналогична положению опухоли у человека.
Чтобы ответить на вопрос - какие клетки продуцируют ИЛ-1 в опухолевом микроокружении мы сравнили различные клеточные популяции из нормальной ткани толстого кишечника и опухолей мышей генотипа APCfl/wtCDX2cre+.
Для получения IEL (innate epithelial lymphocytes) и LPL (lamina propria lymphocytes) клеток использовали протокол выделения, предложенный C.И.Гривенниковым и Wang Kepeng (см. материалы и методы). После получения пула IEL и LPL клеток, мы использовали проточный сортер-цитофлуориметр для сортировки различных типов клеток, присутствующих в опухолях и нормальной ткани. Моноциты, макрофаги, эпителиальные опухолевые клетки, Т-клетки и ILC (innate lymphoid cells - врожденные лимфоидные клетки), различаются профилем экспрессии специфичных антигенов, что позволяет разделить их. На рисунке 3 графически представлены этапы сортировки различных клеточных популяций из IEL и LPL фракций. Изначально пул клеток был отсортирован по размеру соответствующему примерному размеру лимфоцитов, по сравнению с эпителиальными клетками, и были отобраны только клетки, представляющие собой суспензию отдельных единичных клеток, избегая конгломератов слипнувшихся клеток, которые, скорее всего, являлись бы мертвыми клетками. Следующим шагом все клетки сортировались по двум маркерам: CD45 - маркер для всех гематопоэтических клеток и Live/Dead yellow - краситель ДНК, проникающий только в мертвые клетки, таким образом все клетки негативные для CD45 и Live/Dead yellow расценивались как живые эпителиальные клетки, с контаминацией фибробластами, а позитивные по CD45 и негативные по Live/Dead yellow обозначались как живые клетки гематопоэтического ряда и далее сортировались по специфичным для них маркерам на популяции миелоидных и Т-клеток.
Где клетки имели следующие характеристики поверхностных маркеров:
- воспалительные моноциты: CDllb+Ly6C+
- макрофаги: CD11b+ Ly6C-F4.80
- CD4 Т-клетки: TCRocP+CD90.2+CD4+
- Т-регуляторные клетки: TCRocP+CD90.2+CD4+Fr4+
- ILC: TCRaPCRy5-CD90.2+
- TCRyS клетки: TCRaP- CD90.2+
- нейтрофилы:С011Ь+Ьу6С-Ьу60+
На первом этапе, основываясь на данных прямого светорассеяния (FSC), производился отбор только одиночных клеток (Рисунок 3, левая часть, очерчены черным). Далее, по данным прямого светорассеяния (FSC) и бокового светорассеяния (SSC), целые клетки отделялись от клеточного дебриса (Рисунок 3, левая часть, второй график, очерчены черным). Затем, по маркеру мертвых клеток Qdot-live/dead yellow собирали только негативные клетки (популяции живых клеток), а все положительные клетки по гематопоэтичекому маркеру CD45 условно относили к «иммунным клеткам» (Рисунок 3, третий график слева, популяции р 13), а все негативные клетки (CD45") по этому маркеру к «эпителиальным» (Рисунок 3, третий график слева, популяции р12).
Далее из популяции «иммунных клеток» выделяли три других популяции. Т-клетки по маркерам TCRocP+CD90.2+ (Рисунок 3, нижняя часть, популяция р6), ILC по маркерам TCRaP" CD90.2+ (Рисунок 3, нижняя часть, популяция р5), миелоидные клетки негативные по двум маркерам TCRap- CD90.2" (Рисунок 3, нижняя часть, популяция р4). Затем из популяции «миелоидных клеток» дополнительно сортировали популяцию макрофагов по маркерам CD11b+Ly6c- и моноцитов по маркерам CDllb+Ly6c+ (Рисунок 2, верхняя часть, очерченная популяция р11 и р10 соответственно), а из популяции Т-клеток выделяли С04+Т-клетки (Рисунок 3, верхний правый угол, очерченная популяция р8) и Т-регуляторные клетки по маркерам CD4+ Fr4+ (Рисунок 3, верхний правый угол, очерченная популяция р9).
Все клеточные популяции были собраны в буфер лизирующий буфер RLT фирмы Qiagen для выделения РНК.
Анализ экспрессии мРНК гена ИЛ-1 в различных клеточных популяциях мы провели методом ПЦР в реальном времени. Для синтеза кДНК в пробы брали равное количество суммарной РНК. Нормализацию кДНК проб осуществляли с помощью гена RPL32. Контроль качества проводили по эффективности амплификации (Е 95%) и с помощью анализа кривых плавления. Каждый эксперимент повторяли 3 раза. Для проведения опытов использовали образцы, пуллированные из 5 мышей.
Как видно из рисунка 4 уровень экспрессии ИЛ-1а и ИЛ-ір, максимален во фракции моноцитов как в нормальной ткани толстого кишечника, так и в опухолевых образцах. Это позволяет нам сделать вывод – моноциты являются главным источником ИЛ-1 в толстом кишечнике. Следует подчеркнуть, что экспрессия ИЛ-1 в моноцитах, выделенных из опухолевой ткани выше, чем из нормальной ткани почти в 5 раз.
Изучение роли сигнального пути ИЛ-1 в Т-клетках в модели СРТК
Следующей задачей являлось объяснение полученных нами неожиданных результатов в тотальном и гемопоэтическом нокаутах рецептора ИЛ-1 в спонтанной модели РТК (см. Рис 10), где ИЛ-1 контролировал воспалительный ответ и продукцию ИЛ-17А, но не оказывал влияния на опухолевый рост и развитие. Так как CD4+ Th17 клетки являются главным источником ИЛ-17А внутри опухоли и ИЛ-1 способен контролировать их дифференцировку и продукцию в других воспалительных состояниях, мы создали специфический нокаут рецептора ИЛ-1 исключительно на Т-клетках: мыши с генотипом CD4Cre-Il1r1f/f (подробно данные мыши описаны в разделе («Материалы и методы»). В используемой нами мышиной модели СРТК (CDX2Cre-APC), CDX2Cre рекомбиназа специфически вырезает ген АРС из эпителиальных клеток кишечника, в тоже время, в мышах CD4Cre+Il1r1f/f, другая специфичная рекомбиназа CD4Cre удаляет ген рецептора ИЛ-1 в Т-клетках, по этим причинам мы не могли скрестить эти 2 модели без введения мутации гена рецептора ИЛ-1 в эпителий и мутации гена АРС в Т-клетки. Поэтому, чтобы получить чистый специфичный нокаут рецептора ИЛ-1 в Т-клетках на модели СРТК, мы использовали описанную ранее технологию создания химерных мышей с помощью трансплантации костного мозга. Таким образом, мы сравнивали группы мышей, получивших донорский костный мозг с генотипом CD4Cre+Il1r1f/f и контрольную группу без трансгена CD4Cre-Il1r1f/f. Мы обнаружили, что инактивация рецептора ИЛ-1 на Т-клетках ведет к уменьшению уровня мРНК для про-воспалительных цитокинов (Рисунок 15а), а также нарушает продукцию ИЛ-17А и ИЛ-22 из опухоли на уровне белка (Рисунок 15 б).
Одновременно с уменьшением воспалительного ответа, мы наблюдали уменьшение количества опухолей у мышей нокаутных по рецептору ИЛ-1 на Т-клетках (Рисунок 16а, б, в).
Интересно отметить, что в отличие от эпителиального нокаута рецептора ИЛ-1, мыши, с инактивированным рецептором ИЛ-1 на Т-клетках не показали сниженной экспрессии в маркере пролиферации Ki67 (рисунок 17а), тем не менее, мы обнаружили значительную разницу в экспрессии про-онкогена STAT3 в опухолевых клетках нокаутных мышей (Рисунок 17б, в).
Таким образом, сигнальный путь рецептора ИЛ-1 на Т-клетках необходим для экспрессии про-онкогенных и про-воспалительных TEI-цитокинов и развития СРТК.
Сигнальный путь ИЛ-1R регулирует антибактериальные функции в нейтрофилах в СРТК
Для объяснения повышенного уровня присутствия бактерий и изменений в бактериальной композиции кишечной микрофлоры в нейтрофильном нокауте рецептора ИЛ-1, мы рассмотрели несколько возможных причин. Одна из которых недостаточное количество нейтрофилов, привлекающихся в место развития опухоли. ИЛ-1 был показан как необходимый стимул для рекрутирования нейтрофилов в место инфекции, но непосредственная роль рецептора ИЛ-1 на нейтрофилах во время онкологического процесса не выяснена. Таким образом недостаточное количество привлеченных нейтрофилов могло бы объяснить повышенный бактериальный рост в опухолевом микроокружении. Тем не менее, при анализе иммунных клеток, выделенных из опухолей мышей Ly6GCre+IL1R, LysMCre+ и дикого типа, мы не обнаружили разницы в количественно-процентном соотношении нейтрофилов. На рисунке 35а,в представлены репрезентативные графики проточной цитометрии, где нейтрофилами являются клетки положительные по маркерам CD45, CD11b, Ly6G. На рисунке 35б, г представлены графики статистического анализа из трех экспериментов, содержащих 5-7 мышей в каждой группе.
Из полученных нами данных следует, что привлечение нейтрофилов в микроокружение опухоли не нарушено при отсутствии сигнала рецептора ИЛ-1 на нейтрофилах. Таким образом избыточный бактериальный рост должен быть обусловлен функциональными изменениями в нейтрофилах, вызванными отсутствием рецептора ИЛ-1. Антимикробные функции нейтрофилов могут быть изучены несколькими путями. Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET s), измерение внутриклеточного уровня бактерицидных реактивных форм кислорода (ROS) и измерение функциональной активности нейтрофилов в тесте поглощения и переваривания бактерий. Мы провели каждый из перечисленных тестов для более глубокого и детального изучения нарушения функций нейтрофилов в отсутствие рецептора ИЛ-1.
Мы не обнаружили разницы в образовании нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET s) между образцами опухолей из мышей LysMCre+ и дикого типа (Рисунок 36).
Для обнаружения бактерицидных реактивных форм кислорода (ROS) ex vivo мы окрашивали фракцию нейтрофилов, выделенных из опухоли красителем CM-H2DCFDA. Тем не менее, мы не нашли значительной разницы в интенсивности внутриклеточной окраски между нейтрофилами, полученными из LysMCre+ мышей и мышей дикого типа (Рисунок 37).
Для изучения функциональной антимикробной активности нейтрофилов, мы выделили не активированные нейтрофилы из костного мозга, а также из перитонеальной области через 6 часов после иньекции 4% тиогликолята в наивных мышах генотипа ILlRf/f LysMCre+ и дикого типа (см. материалы и методы). Также, для того чтобы сравнить функциональную активность нейтрофилов из канцерогенной модели мы сортировали клетки с фенотипом CDllb+Ly6G+ из селезенки химерных мышей APC-ERT с костным мозгом от IL1Rf/f LysMCre+, IL1Rf/f Ly6GCre+ и дикого типа.
Таким образом, способность поглощать и убивать бактерии была снижена в нейтрофилах (CD11b+Ly6G+) не имеющих рецептор ИЛ-1 в каждом из экспериментов (Рисунок 38а). Необходимо отметить, что нейтрофилы, полученные из различных источников, показали одинаковую сниженную активность уничтожения бактерий. Помимо классической модели с использованием бактерий E. coli, мы также протестировали бактерии, выделенные нами из фекалий канцерогенных мышей, в данном эксперименте, нейтрофилы с отсутствующим рецептором ИЛ-1 также не могли достаточно эффективно уничтожать бактерии (Рисунок 38б).
В свете полученных нами результатов по сниженной антимикробной активности нейтрофилов в отсутствии рецептора ИЛ-1, мы исследовали уровни экспрессии антимикробных белков (AMPs). Мы обнаружили сниженную экспрессию мРНК некоторых специфических АМPs как в тотальных опухолевых лизатах мышей IL1Rf/fLy6GCre+, так и сортированных фракциях нейтрофилов из опухолей мышей IL1Rf/f CD11Cre+ по сравнению с их контрольной группой (Рисунок 39).
Для дальнейшего анализа антимикробной активности нейтрофилов мы проанализировали функцию фагоцитирования в нейтрофилах дикого типа и нейтрофилах дефектных по рецептору ИЛ-1, полученных либо из селезенки мышей канцерогенной модели, либо из перитонеальной полости наивных мышей. Для этого мы инкубировали свежевыделенные нейтрофилы, предварительно активированные рекомбинантным белком ИЛ -ір в течении часа (см материалы и методы) в одном случае с бактерией Salmonella typhimurium, помеченной флуороформом GFP (Рисунок 40а, в), либо с биочастицами zymosan, коньюгированными с флуороформом AF564 (Рисунок 40б, г). После чего образцы фиксировались и анализировались на конфокальном микроскопе. В результате мы обнаружили, что нейтрофилы, нокаутные по рецептору ИЛ-1, имеют сниженную фагоцитарную функцию по сравнению с нейтрофилами контрольной группы дикого типа (рис. 40).
Таким образом, полученные нами данные доказывают, нейтрофилы с отсутствующим рецептором ИЛ-1 имеют дефектную антибактериальную функцию, выражающуюся в их неэффективности фагоцитировать и элиминировать бактерии, тем самым допуская избыточный бактериальный рост, повышенное привлечение иммунных клеток в опухолевое микроокружение, повышенную продукцию провоспалительных цитокинов, и как следствие усиленный рост и прогрессию опухоли.