Содержание к диссертации
Введение
1. Список использованных сокращений 7
2. Введение 8
2.1. Актуальность темы исследования 8
3. Цель исследования 11
4. Задачи исследования 11
5. Научная новизна работы 12
6. Теоретическая и практическая значимость 12
7. Объем и структура диссертации 14
8. Обзор литературы
8.1. Врождённый иммунный ответ на S. flexneri 2а 15
8.2. Адаптивный иммунный ответ на S. flexneri 2а
8.2.1. Клеточно-опосредованный адаптивный иммунный ответ 21
8.2.2. Гуморальный адаптивный иммунный ответ 23
8.3. Основные подходы к разработке вакцин против S. flexneri 2а 27
8.3.1. Химические шигеллёзные вакцины 28
8.3.2. Инактивированные шигеллёзные вакцины 30
8.3.3. Живые шигеллёзные вакцины
8.3.3.1. Неинвазивные живые вакцины 32
8.3.3.2. Инвазивные живые шигеллёзные вакцины
8.3.4. Векторные шигеллёзные вакцины 36
8.3.5. Стратегии по созданию ассоциированных (мультисеротипных) шигеллёзных вакцин 36
9. Материалы и методы исследования 41
9.1. Методы получения нативного ЛПС S. flexneri 2а и его производных 41
9.1.1. Штамм кишечной бактерии 41
9.1.2. Выделение и очистка ЛПС 41
9.2. Определение химической структуры нативного ЛПС S. flexneri 2а и его производных 41
9.3. Постановка метода непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа для определения специфичности нЛПС S. flexneri 2а и его производных 42
9.4. Методика определения пирогенности у кроликов на введение нЛПС S. flexneri 2а и его производных 43
9.5. Определение гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцами, содержащими нЛПС S. flexneri 2а с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций
9.5.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей и отбора биоматериала 44
9.5.2. Постановка нТИФА для определения IgG и IgM у мышей, иммунизированных образцами, содержащими нЛПС
S. flexneri 2а с преобладанием короткоцепных, длинноцепных фракций или без явного преобладания какой-либо из фракций 44
9.6. Определение гуморального ответа у мышей, иммунизированных образцами с пониженными показателями пирогенности, отличающихся по содержанию ЛПС с разной длиной ПС цепи 45
9.7. Определение антител у мышей, иммунизированных образцами, содержащими д/ц ЛПС S. flexneri 2а и отличающимися по строению липида А 45
9.8. Методы, используемые для характеристики гуморального иммунного ответа у мышей (CBA x C57 Bl/6) F1,
иммунизированных образцами, содержащими преимущественно длинноцепные 3-ацильные производные ЛПС S. flexneri 2а 45
9.8.1. Методика иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала 46
9.8.1.1. Методика интраперитонеальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала 46
9.8.1.2. Методика подкожной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала 46
9.8.1.3. Методика интраназальной иммунизации мышей образцом 3,4-ац д/ц мЛПС и отбора биоматериала 9.8.2. Определелие сывороточных агглютинивов методом РПГА 47
9.8.3. Постановка нТИФА для характеристики изотипов и субизотипов IgG сывороточных антител и антител на слизистой у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС 47
9.9. Определение протективной активности 3,4-ац д/ц мЛПС в опыте по экспериментальному заражению 48
9.9.1. Определение ИД50 и ИД100 вирулентного штамма S. flexneri 2a 1605 у морских свинок 48
9.9.2. Постановка кератоконъюнктивальной пробы 48
9.10. Определение перекрёстной активности сывороточных антител у мышей после иммунизации 3,4-ац д/ц мЛПС 49
9.10.1. Методика иммунизации мышей для определения перекрёстной активности сывороточных Ат 49
9.10.2. Оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток 49
9.11. Клиническое исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак» 50
9.11.1. Цель и задачи исследования кандидатной вакцины «Флексвак» 50
9.11.2. Состав исследуемого препарата 51
9.11.3. Дизайн исследования 51
9.11.4. Отбор участников исследования 52
9.11.5. График обследования и процедур у добровольцев, принявших участие в исследованиии препарата «Флексвак» 53
9.11.6. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» 56
9.11.7. Определение специфического иммунного ответа у добровольцев, иммунизированных препаратом «Флексвак» 57
9.11.7.1. Постановка РПГА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев 58
9.11.7.2. Постановка нТИФА для определения О-специфических анти-S. flexneri 2а антител в сыворотках добровольцев 58
9.12. Методы статистической обработки полученных результатов 58
10. Результаты исследований 59
10.1. Характеристика структур ЛПС S. flexneri 2а, используемых для формирования исследовательских панелей 59
10.2. Исследование влияния структурного полиморфизма ЛПС S. flexneri 2a на его О-специфическую антигенную активность с использованием моно- и поливалентных шигеллёзных сывороток 63
10.3. Изучение условий индукции пирогенной реакции у кроликов производными нЛПС S. flexneri 2а 66
10.4. Исследование гуморального ответа у мышей к пирогенным нЛПС S. flexneri 2а, отличающихся по длине О-ПС цепи 68
10.5. Исследование гуморального ответа у мышей к низкопирогенным и апирогенным ЛПС с различной длиной цепи О-ПС 73
10.6. Изучение влияния структуры липида А на иммуногенность длинноцепного ЛПС S. flexneri 2а у мышей 75
10.7. Системный гуморальный иммунный ответ и иммунный ответ на слизистых у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных длинноцепными 3-ацильные производными ЛПС S. flexneri 2а 77
10.8. Исследование протективной активности образца 3,4-ац д/ц
мЛПС S. flexneri 2а 81
10.9. Перекрёстная бактериолитическая активность сывороточных
антител мышей, полученных при иммунизации образцом
длинноцепного 3-ацильного производного ЛПС S. flexneri 2а 83
10.10. Исследование кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а с участием здоровых добровольцев, по результатам I фазы клинических исследований 85
10.10.1. Оценка безопасности кандидатной вакцины «Флексвак» 87
10.10.2. Оценка иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» для добровольцев 11. Обсуждение результатов 96
12. Выводы 114
13. Список литературы
- Цель исследования
- Инактивированные шигеллёзные вакцины
- Постановка метода непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа для определения специфичности нЛПС S. flexneri 2а и его производных
- Исследование влияния структурного полиморфизма ЛПС S. flexneri 2a на его О-специфическую антигенную активность с использованием моно- и поливалентных шигеллёзных сывороток
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Дизентерия является одной из самых распространенных острых кишечных инфекций. Ежегодно в мире регистрируется 164,7 млн. случаев заболевания (K.L. Kotloff et al., 1999).
В Российской Федерации наиболее эпидемически значимым возбудителем дизентерии является S. flexneri серогруппы 2a (А.Я. Миндлина и соавт., 2010).
В связи с появлением и широким распространением полирезистентных к антибиотикам штаммов шигелл, внедрение системы вакцинопрофилактики дизентерии приобретает особую актуальность (С.А. Егорова и соавт., 2006; А.Я. Миндлина и соавт., 2010). Однако живые и химические вакцины против S. flexneri 2a оказались недостаточно эффективными. Коммерческого вакцинного препарата против дизентерии Флекснера не разработано. Разработка такого препарата на основе современных технологических решений является актуальной задачей иммунопрофилактики, которая определена среди приоритетных направлений Всемирной Организации Здравоохранения (Всемирная организация здравоохранения, 2001).
Цель исследования
Доказать возможность применения модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a в качестве кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера.
Задачи исследования:
-
Исследовать влияние длины цепи О-полисахарида и количества остатков высших жирных кислот в липиде А нативного и модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a на пирогенную реакцию и гуморальный иммунный ответ у экспериментальных животных.
-
Определить наиболее иммуногенный апирогенный вариант модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a для включения в кандидатную вакцину против дизентерии Флекснера и провести его развернутое иммунологическое исследование.
-
Исследовать механизмы иммунной защиты на слизистых и перекрестную серологическую активность иммуногенного апирогенного модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a.
-
Провести I фазу клинических исследований кандидатной вакцины «Флексвак» на основе модифицированного липополисахарида S. flexneri 2a.
Научная новизна работы
Разработаны фундаментальные основы иммунопрофилактики дизентерии
Флекснера, заключающиеся в доказательстве возможности активации адаптивного
мукозального иммунного ответа при парентеральном введении
модифицированных липополисахаридов.
Выяснены механизмы иммунологического распознавания
модифицированных липополисахаридов. Показано, что увеличение длины цепи О-полисахарида повышает иммуногенность, а уменьшение количества остатков жирных кислот в липиде А до двух снижает иммуногенность липополисахарида S. flexneri 2а. Установлено формирование иммунной памяти в ответ на введение различных структурных вариантов модифицированных липополисахаридов.
Доказано, что апирогенный и иммуногенный липополисахарид S. flexneri 2а включает триацильный липид А и длинноцепной О-полисахарид.
Установлены особенности формирования иммунной защиты от
инфицирования вирулентным штаммом S. flexneri 2а при иммунизации триацильным длинноцепным модифицированным липополисахаридом.
Проведена I фаза клинических испытаний кандидатной вакцины «Флексвак». Впервые в клинических исследованиях доказана безопасность, хорошая переносимость и выраженная иммуногенность кандидатной вакцины «Флексвак», на основе модифицированного липополисахарида S. flexneri 2а.
Теоретическая и практическая значимость
Теоретическая значимость работы обоснована тем, что доказаны положения, вносящие значительный вклад в понимание молекулярных механизмов активации мукозального иммунитета с применением модифицированных апирогенных липополисахаридов S. flexneri 2а. Изложены доказательства возможности
модификации липополисахарида с сохранением его иммуногенности и достижением апирогенности. Изучено и установлено, что увеличение количества остатков жирных кислот в липиде А и/или длины цепи О-полисахарида S. flexneri 2а повышает способность к индукции адаптивного иммунного ответа. Раскрыта неизвестная ранее проблема появления иммуносупрессирующего эффекта модифицированного липополисахарида S. flexneri 2а при увеличении содержания в препарате фракции диацильных производных. Проведена модернизация экспериментальной модели для определения протективной активности препарата при кератоконъюнктивальном заражения животных S. flexneri 2а, заключающаяся в использовании парентерального способа иммунизации.
Основным имеющим значением для практики результатом работы является
создание нового вакцинного препарата против дизентерии Флекснера 2а
«Флексвак». Активным веществом препарата является модифицированный
липополисахарид S. flexneri 2а. Разработаны предложения по использованию
парентерального введения как эффективного способа применения
липополисахаридных дизентерийных вакцин. Результаты изучения безопасности препарата для парентерального введения «Флексвак» в I фазе клинических исследований с участием здоровых добровольцев свидетельствуют о хорошей переносимости, низкой реактогенности кандидатной вакцины при использовании выбранных доз. Определены перспективы клинического применения кандидатной вакцины «Флексвак» для профилактики дизентерии в группах риска.
Создан проект фармацевтической статьи предприятия для кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак».
Представлены рекомендации по получению липополисахаридов в качестве основы для создания вакцин.
Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе медицинских и биологических высших учебных заведений, а также в системе последипломного образования.
Апробация результатов работы
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на
Х международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии,
иммунологии и иммунофармакологии» (20-23 мая 2009г., Казань), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (25-27 ноября 2009г., Москва), международном симпозиуме «5th Baltic meeting on microbial carbohydrates» (2-6 сентября 2012г., Суздаль), международной конференции «Vaccines for enteric diseases» (6-8 ноября 2013г., Бангкок, Таиланд), 18 европейском симпозиуме «Eurocarb18th» (2-6 августа 2015г., Москва).
Публикации
Соискатель имеет 15 опубликованных работ, все по теме диссертации, общим объёмом 42 страницы, в том числе 5 работ, опубликованных в рецензируемых научных изданиях, включённых в перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук («Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», «Санитарный врач», «FEMS immunology and medical microbiology», «Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук», «Иммунология»), 1 патент и 9 работ в публикациях материалов конгрессов и конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, содержит 22 таблицы, 24 рисунка. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список литературы. Список литературы включает 171 источник, в том числе 23 отечественных и 148 зарубежных.
Цель исследования
Инактивированные цельноклеточные вакцины получают путем воздействия на микроорганизмы химическим путем или нагреванием. Такие вакцины являются достаточно стабильными и безопасными, так как не могут вызвать реверсию вирулентности. Они часто не требуют хранения в условиях холодовой цепи, что удобно в практическом использовании. Однако у этих вакцин имеется и ряд недостатков, в частности, они стимулируют более слабый иммунный ответ и требуют применения нескольких доз введения (бустерные иммунизации).
Первые попытки создания невосприимчивости к дизентерии были предприняты ещё в 1898г., когда Шига и Крузе ввели себе под кожу убитые нагреванием дизентерийную культуру. Этот опыт вызвал у обоих экспериментаторов настолько сильную общую и местную реакцию, что они вынуждены были сразу же отказаться от дальнейшего применения препарата. Вскоре Шига приготовил новую вакцину для специфической профилактики дизентерии, состоящую из убитых нагреванием дизентерийных бактерий (половина петли) в смеси с 0,5 мл. дизентерийной сыворотки. Реакция на введение сыворотки была менее выражена [158].
На протяжении всего двадцатого века предпринимались многочисленные попытки создать эффективную противошигеллёзную инактивированную цельноклеточную вакцину, но ни один препарат не получил всеобщего признания. Высокая реактогенность у добровольцев была отмечена практически всеми исследователями. Вызывали определенные сомнения незначительная эффективность некоторых препаратов, а также большая сложность и дороговизна их приготовления [4, 19, 92, 111, 146]. Более поздние исследования, проведённые на морских свинках показывают, что при многократном введении больших доз «убитых» штаммов S. flexneri 2a возможно добиться выработки протективных Ат [82, 134].
Живые вакцины получают путем искусственного аттенуирования (ослабления штамма), либо путём отбора естественных авирулентных штаммов. Бактерии, в составе таких вакцин не утрачивают способность размножаться в организме, вызывая вакцинальный процесс и формируя невосприимчивость.
Анализируя свойства живых вакцин, следует выделить как их положительные, так и отрицательные качества [8]. Положительные стороны: по механизму действия на организм напоминают "дикий" штамм, продуцируют достаточно эффективный клеточный и гуморальный иммунитет. Вакцинный штамм может приживаться в организме и длительно сохранять иммунитет, вытесняя "дикий" штамм. Для вакцинации используются небольшие дозы, и поэтому она является не дорогой.
Отрицательные стороны: живая вакцина является корпускулярной, поэтому содержит 99 % балласта. Такой препарат обычно бывает достаточно реактогенным, кроме того, он способен вызывать мутации клеток организма (хромосомные аберрации). Живые вакцины могут содержать вирусы-загрязнители (контаминанты). Нельзя исключить и реверсии вакцинных штаммов в вирулентную форму, что может стать причиной заболевания вакцинируемого. По этой причине живые вакцины должны быть тщательно контролируемы. Живые вакцины трудно дозируются и поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких температур и требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи. Пациентам с иммунодефицитами (получающим иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) противопоказано вакцинироваться такими вакцинами [18]. Среди S. flexneri 2a живых вакцин можно выделить неинвазивные и инвазивные живые вакцины.
Штаммы с практически любыми мутациями хромосом или плазмид вирулентности S. flexneri могут быть использованы для создания неинвазивных живых вакцинных штаммов [34].
Некоторые такие штаммы безопасны для людей и способны индуцировать протективные Ат (табл. 4). Например, S. flexneri 2а Istati T32-штамм на 100% безопасен для людей и эффективен на 85%. Однако, для формирования протективного иммунитета необходима реиммунизация каждые 6 месяцев большой дозой (1х1011 КОЕ) препарата, что дорого и сложно в организационном плане. Исследования на BALB/cJ мышах штаммов S. flexneri 2а msbB1 (WR10), msbB2 (WR20), msbB1и2 (WR30), с мутацией гена, кодирующего ацетилтрансферазу демонстрируют возможность стимулирования секреции ИЛ-5, ИНФ-, ИЛ-1, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-13 и ФНО- не хуже, чем вирулентный штамм 2457Т и значительно выше по сравнению с группой контроля, привитой физиологическим раствором. Мутантные msbB штаммы способны к индукции протективных антител не хуже чем вирулентный штамм [60].
Инактивированные шигеллёзные вакцины
Несмотря на то, что при инфицировании шигеллы, как правило, поражают слизистую оболочку кишечника человека, у переболевших людей были выявлены не только секреторный IgА, но и сывороточные IgА, IgG и IgМ, направленные, преимущественно, против О-ПС. Минорная фракция АТ, указанных классов, специфична к эффекторным протеинам шигелл [85, 105, 137]. Анти-О-ПС секреторные IgА были обнаружены также в материнском молоке и способны обеспечить защиту новорожденных от дизентерии [83]. Кроме того, у переболевших шигеллёзом людей были выявлены анти-О-ПС IgG, IgА антитело-секретирующие клетки [27, 38, 138].
Исследование роли секреторного IgА в противошигеллёзной защите были проведены на мышах с использованием лёгочной модели. Моноклональные секреторные анти-О-ПС IgА, продуцируемый из имплантированной в область спины BALB/c мышам подкожной гибридомы, обеспечивают защиту против заражения летальной дозой бактерий [58]. Также in vitro было показано, что ЛПС шигелл, может быть перенесён через поляризованный эпителий кишечника секреторными IgА, следовательно может быть презентирован в виде иммунологически активной формы [78]. Однако опыты in vivo ограничены тем фактом, что у мышей IgА ответ на шигеллы не выражен. Вместе с тем, мыши с дефицитом IgА демонстрируют высокую выживаемость при экспериментальном заражении, доказывая протективную эффективность сывороточных IgG и IgМ [73, 161].
В ряде экспериментов на мышах линии C57BL/6, у которых Т-клетки имели дефекты TCR по типу CD0 либо TCR-0 TCR-0 была зарегистрирована высокая выживаемость после инфицирования и элиминация бактерий, за счёт ЛПС специфичных IgМ [64, 72]. Имея Аг детерминанты кассетного типа, ЛПС способен непосредственно, без участия T-клеток, стимулировать пролиферацию В-лимфоцитов. То есть, ЛПС являются тимус - независимым антигеном 1 типа. Ат, продуцируемые активированными таким образом В-лимфоцитов, относятся преимущественно к IgM классу. В опытах на крысах было установлено, что тимус-независимые Аг 1 типа способны вызывать вторичный иммунный ответ [166].
Вплоть до третьей недели после инфицирования, IgM, секретируемые по Т-независимому механизму, способны обеспечить защиту мышей. Позднее на смену им приходят Т-зависимая секреция IgG и Тh 17- клетки памяти [64, 72, 73].
Гуморальный ответ является основным механизмом защиты против шигелл. Таким образом, шигеллезная кандидатная вакцина любого типа должна быть мощным индуктором карбогидрат - специфического иммунного ответа, направленного к О-Аг шигелл [1].
Конструирование шигеллёзных вакцин стало возможным благодаря новым методам тонкого химического изучения антигенных структур возбудителя, патогенеза и характера формирующегося иммунитета при естественном течении инфекции. Наблюдения за больными дизентерией людьми позволяют заключить, что после перенесённого заболевания вырабатывается непродолжительный типоспецифический иммунитет. Переболевшие однажды дизентерией при повторном заражении гомологичным штаммами болеют реже [20, 30, 41]. На основании этих данных было сделано предположение, что для формирования напряжённого иммунитета необходимо многократное повторное заражение гомологичным штаммом.
Задачей разработчиков вакцин должны стать разумное решение проблем и создание вакцинирующих препаратов, удовлетворяющих необходимым критериям [21]: вакцина не должна быть источником побочной биологической опасности, вакцина не должна индуцировать патологические иммунные процессы, вакцина должна эффективно индуцировать протективный иммунный ответ и обеспечивать продолжительную защиту,
Химические шигеллёзные вакцины содержат Аг компоненты, извлеченные из микробной клетки, т.е. они являются субмикробными вакцинами. Основными Аг, которые определяют иммуногенные характеристики S. flexneri, являются секретируемые ею эффекторные 1ра - протеины и эндотоксин клеточной стенки ЛПС.
В последние годы с участием добровольцев были исследованы конъюгированные с белками О-ПС и комплексная ЛПС - протеосомальная шигеллёзные вакцины. Эти препараты способны индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ. Реактогенность ЛПС вакцины многократно выше по сравнению с ПС вакцинами (табл. 3). Другие современные субмикробные дизентерийные кандидатные вакцины пока не прошли клинические исследования.
На лабораторных животных удалось добиться устойчивости к инфекции S. flexneri 2а при иммунизации Аг комплексом Invaplex (IpaB, IpaC, IpaD и ЛПС). Выживаемость мышей BALB/cByJ при лёгочной модели заражения через 3 недели после трёхкратной интраназальной иммунизации (0, 14, 28 дн.) двумя сериями данного препарата составила 64% и 80%, по сравнению с группой контроля - 12%. Концентрация специфических Ат, после трёхкратной иммунизации комплексом invaplex существенно увеличилась, причём, к ЛПС преобладают IgA, а к вирулентному штамму S. flexneri 2а - IgG [68]. Исследование адъювантной активности invaplex показало, что при введение мышам BALB/cByJ смеси invaplex с овальбумином, препарат способствует повышению титра Ат к овальбумину по сравнению с группой контроля привитых только овальбумином [112].
Рибосомальная шигеллёзная вакцина способна обеспечить протективный иммунитет на морских свинках и обезьянах [122]. Иммунный ответ, индуцированный подобной вакциной развивается, преимущественно к О-ПС (L-гаптену) [121]. В настоящее время ведутся разработки О-Аг рибосомальной вакцины (SRV). Двукратное интраназальное или подкожное введение препарата BALB/c мышам с двух недельным интервалом индуцирует 4-16 кратный прирост титра IgG и IgA в сыворотке и на слизистых (забор биоматериала через неделю после вторичной иммунизации). Подкожная иммунизация препаратом приводит к повышению титра IgG в сыворотке и незначительно в лёгочном смыве, уровень IgA повышен только в вагинальном смыве. При интраназальной иммунизации титр IgG, также повышен, в сыворотке и, незначительно, в лёгочном смыве. Уровни IgA достоверно выше в смыве из носа, вагины, в слюне и фекалиях, как при интраназальном введении SRV так и при введении аттенуированного штамма S. flexneri 2а SC602. Концентрация IgA антителобразующих клеток достоверно выше в селезёнке, лёгких, поднижнечелюстном лимфоузле мышей, иммунизированных интраназально SRV вакциной [65]. Существенными недостатками такой вакцины являются непостоянная, трудно контролируемая концентрация О-АГ в рибосомах и трудоёмкое производство [34].
Постановка метода непрямого твёрдофазного иммуноферментного анализа для определения специфичности нЛПС S. flexneri 2а и его производных
Интраназальная иммунизация осуществлялась под действием эфирной анестезии. Мыши были иммунизированы двукратно 50 мкг исследуемого образца, растворённого в 20 мкл физиологического раствора, с интервалом в 14 дней. Перед процедурой забора биоматериала мыши умервщлялись. Было проведено рассечение грудинно-рёберного сочленения по грудинной линии с последующим вскрытием грудной клетки и выделением бронхолёгочного аппарата. Бронхолёгочный аппарат измельчали и помещали в 2 мл охлаждённого физиологического раствора. Для определения Ат на слизистых мышей использовали бронхолёгочный лаваж. Контрольные смывы получали от не иммунизированных животных.
Для постановки реакции готовят двукратные разведения сывороток в 0,9 % растворе натрия хлорида в объеме 100 мкл, начиная с разведения сывороток 1:4 в полистироловых круглодонных планшетах. В каждую из лунок добавляют по 25 мкл эритроцитарного диагностикума против шигелл Флекснера 1-5 (Микроген серия № 101110). Планшеты встряхивают и оставляют на два часа при комнатной температуре. Агглютинины определяли в сыворотках мышей, иммунизированных интраперитонеально как однократно, так и двукратно.
Постановка нТИФА для характеристики изотипов и субизотипов IgG сывороточных антител и антител на слизистой у мышей (CBA x C57 B1/6) F1, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС
Были исследованы сывороточные антитела и антитела на слизистых у мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС. Протокол постановки нТИФА описан в пункте 9.5.2. На фазу адсорбировали 3-6-ац д/ц нЛПС. Для исследования первичного и вторичного системного гуморального ответа у мышей, иммунизированных 3,4-ац д/ц мЛПС, а также антител на слизистых использовали меченые пероксидазой хрена антитела козы против IgA, IgG, IgM мыши («Sigma - Aldrich» или «Merc»). Для определения субизотипов IgG Ат использовали конъюгированные с пероксидазой хрена антитела козы против IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 Ат мыши («Sigma - Aldrich»).
Для оценки протективных свойств производных ЛПС S. flexneri 2а была разработана кератоконъюнктивальная проба, которая является модифицированным тестом Sereny [157] для инфекции S. flexneri 2а (рис. 1). Иммунизация морских свинок осуществлялась дозами 25 мкг и 50 мкг подкожно в область спины двукратно с интервалом в 10 дней. На 10 день после повторной иммунизации проводили заражение в конъюнктиву глаза штаммом S. flexneri 2a 1605 дозами, соответствующими ИД50 и ИД100. Иммуногенность препарата оценивали на третьи сутки по количеству здоровых глаз.
Определение перекрёстной активности сывороточных антител у мышей после иммунизации 3,4-ац д/ц мЛПС Для определения перекрёстной активности антител мышей, иммунизированных образцом 3,4-ац д/ц мЛПС, была проведена оценка бактериолитических свойств мышиных сывороток по отношению к культурам гомологичной серогруппы S. flexneri 2а и гетерологичных серотипов и серогрупп S. flexneri 1a, 1b, 2b, 3a, 4a, 5a, 5b, X, Y.
Для выявления бактериологических свойств сывороток in vitro непрогретые сыворотки в разведения: 1:100 в объеме 0,1 мл вносили в лунки полистироловых пластинок для макрогемаглютинации. Затем в каждую лунку вносили 0,1 мл смыва 18-часовой агаровой культуры в концентрации 105 микробных клеток в 1 мл и помещали в термостат при 37 С на 1,5 часа. Выявление бактериолитических свойств, происходило для каждой мышиной сыворотки индивидуально. В качестве контроля служила сыворотка, взятая от интактных мышей. После инкубации в каждую лупку добавляли 1,8 мл физиологического раствора и по 0,1 мл высевали на 2 чашки с твердой питательной средой. Посевы культивировали при 37С и на следующие сутки регистрировали число колоний, выросших на чашках. Бактериолитический эффект оценивали по индексу эффективности (ИЭ): отношение числа колоний на контрольных чашках к числу колоний на опытных чашках. Считается, что сыворотка обладает выраженным бактсриолихическнм эффектом при индексе эффективности 2-3.
Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития было разрешено проведение I фазы клинических исследований (КИ) кандидатной вакцины против дизентерии Флекснера 2а «Флексвак» (разрешение № 04-16507/09 от 2009 года). Исследование проводилось как открытое на базе Федерального государственного учреждения здравоохранения «Центральная медико-санитарная часть №8 Федерального медико-биологического агенства», Калужская область, г. Обнинск. Главным исследователем была Хржановская И.Н.
Целью проведения клинических исследований было изучение безопасности и иммуногенности кандидатной вакцины «Флексвак» на ограниченном контингенте добровольцев.
Кандидатная В исследовании были поставлены следующие задачи: Выявить местные и общие реакции на введение препарата «Флексвак», Определение изменений в общих и биохимических показателей крови на введение препарата «Флексвак», Оценить продукцию специфического гуморального иммунного ответа на введение препарата «Флексвак».вакцина против дизентерии Флекснера 2а имеет торговое название «Флексвак». Активным веществом препарата «Флексвак» является длинноцепной 3,4- ацильный модифицированный ЛПС (мЛПС) S. flexneri 2a, полученный химическим путём. Структура активного вещества была установлена с помощью методов электрофореза и масс-спектрометрии.
В исследовании применялся препарат «Флексвак» в растворе для инъекций, содержащем 100, 50 или 25 мкг активного вещества в ампуле, растворённого в объёме 0,5 мл. Препарат предназначен для подкожных или внутримышечных инъекций.
Серия вакцины, используемая в испытаниях, была проконтролирована в ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора.
Было проведено простое слепое неконтролируемое рандомизированное исследование реактогенности и иммуногенности дизентерийной вакцины против шигелл Флекснера «Флексвак», 1 фаза. Всего в исследовании приняли участие 26 добровольцев от 18 до 55 лет, подошедшие под критерии включения, которые были распределены по 3 группам независимо от возраста и пола (табл. 7). Добровольцы в каждой группе были иммунизированы одной дозой препарата «ФЛЕКСВАК» подкожно в верхнюю треть плеча.
Исследование влияния структурного полиморфизма ЛПС S. flexneri 2a на его О-специфическую антигенную активность с использованием моно- и поливалентных шигеллёзных сывороток
Как показано на рис. 5 длинноцепные мЛПС: 3,4-ац д/ц мЛПС, 2,3-ац д/ц мЛПС, а также д/ц ПС активно связывают Ат гомологичных моновалентных сывороток 3,4; II и поливалентной сыворотки 1-5 в конечном титре не ниже 3200, что сравнимо с активностью длинноцепного нативного ЛПС – 3-6-ац д/ц нЛПС. Следовательно, применяемые методы химической модификации ЛПС S. flexneri 2а не повреждают антигенные детерминанты цепи О-ПС ЛПС S. flexneri 2а и они доступны для связывания с Ат.
Серологическая активность д/ц О-ПС и д/ц ЛПС как в нативной, так и в модифицированной форме, существенно не отличается. То есть, присутствие в молекуле ЛПС липида А не оказывает существенного влияния на специфическую активность длинноцепных ЛПС S. flexneri 2а. Кроме того влияние методов химической модификации ЛПС S. flexneri 2а, таких как частичное деацитилирование липида А, не приводит к изменению серологической активности д/ц мЛПС S. flexneri 2а. Однако серологическая активность к/ц нЛПС была существенно ниже по сравнению с д/ц нЛПС, и д/ц ПС (рис. 5 и 6), что, по-видимому, обусловлено существенно более низким удельным содержанием О-Аг детерминант в образце к/ц ЛПС.
Следует отметить, что в нЛПС S. flexneri 2а в положении 3 и 4 примерно в 60% и 25% случаев, соответственно, находится О-ацетильная группа [54, 56]. Методы химической модификации, способные повлиять на жирнокислотный состав липида А, приводят к её удалению. Вместе с тем, отсутствие О-ацетата в положении 3,4 не приводит к потере способности ЛПС S. flexneri 2а связывать гомологичные АТ из диагностических сывороток II, 3,4 и 1-5.
Все полученные образцы вне зависимости от длины цепи О-ПС, наличия или отсутствия липида А, количества остатков жирных кислот в липиде А, а также наличия или отсутствия О-ацетильной группы связывают Ат сывороток 3,4, II и 1-5 и не реагируют с сывороткой 7,8 и I (рис. 6). Таким образом, представленные образцы обладают О-Аг специфичностью, характерной для ЛПС S. flexneri серогруппы 2а. 10.3. Изучение условий индукции пирогенной реакции у кроликов производными нЛПС S. flexneri 2а
Пирогенная реакция является одним из наиболее чувствительных методов оценки эндотоксичности. Тест пирогенности на кроликах широко применяется для оценки эндотоксичности вакцин, прежде всего бактериальных и включен в целый ряд иммунологических и международных фармакопей.
Методика определения пирогенной реакции у кроликов была одинакова для всех исследованных образцов (пункт 2.4). Пирогенность определяли при внутривенном введении кроликам 25 нг. каждого исследуемого образца на килограмм веса кролика, растворённых в 1 мл изотонического раствора (табл. 11).
Исследуемые образцы, по результатам пирогенной реакции кроликов на их внутривенное введение (табл. 11), можно разделить на 3 группы: пирогенные -t 3 С; низкопирогенные – 1,2 С t 3 С и апирогенные – t 1,2 С. Апирогенные образцы оценивались в соответствии со стандартами фармакопеи РФ, где вещества признают апирогенными, если суммарное изменение температуры у 3 кроликов после инъекции не превышает 1,2 С и ни у одного из кроликов не было обнаружено повышения температуры больше 0,5 С [5].
Разделение опытных образцов на 3 группы позволяет выявить переходные закомонерности отличающие низкопирогенные образцы, как от пирогенных, так и от апирогенных образцов.
В группу пирогенных образцов были включены ЛПС S. flexneri 2a с неизменённым липидом А. В эту группу вошли образцы: 3-6-ац д/ц+к/ц нЛПС, 3-6-ац д/ц нЛПС, 3-6-ац к/ц нЛПС. Низкопирогенными были следующие образцы: 4,3-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац к/ц мЛПС. Главным отличием пирогенных от низкопирогенных образцов является наличие в составе пирогенных образцов пента- и гексаацильных производных ЛПС S. flexneri 2a. Длина цепи О-ПС, в данном случае, не влияет на степень пирогенной реакции, т.к. пирогенными являются и длинноцепной (3-6-ац д/ц нЛПС) и короткоцепной (3-6-ац к/ц нЛПС) образцы с одинаковыми липидами А.
В группу апирогенные были включены препараты, соответствующие критериям апирогенности, описанным в фармакопеи РФ [5]: 3,4-ац д/ц мЛПС, 3,4-ац д/ц нЛПС, 3-ац д/ц мЛПС, 2,3-ац д/ц мЛПС.
Апирогенные образцы могут содержать ди-, три- и тетраацильные производные ЛПС S. flexneri 2a так же как и низкопирогенные. Однако для апирогенных образцов присутствие тетраацильных производных допустимо в минимальных количествах и только в составе длинноцепных фракций ЛПС. Так, образцы 3,4-ац д/ц мЛПС и 3,4-ац к/ц мЛПС содержат примерно одинаковое соотношение три- и тетраацильных ЛПС S. flexneri 2a в составе, однако длинноцепной образец апирогенен для кроликов, а короткоцепной мЛПС может быть отнесён только к низкопирогенным (t = 1,4С).
Таким образом, на данном этапе изучения иммуногенности ЛПС S. flexneri 2a наиболее важным представляется факт получения апирогенных образцов ЛПС S. flexneri 2a вследствие химической модификации, удовлетворяющих по этому параметру требования Фармакопеи РФ XII.
Исследование гуморального ответа у мышей к пирогенным нЛПС S. flexneri 2а, отличающихся по длине О-ПС цепи Были проведены исследования продукции ЛПС-специфических сывороточных антител у мышей (CBAxC57B1/6)F1, иммунизированных препаратами д/ц, к/ц нЛПС с различной длиной О-ПС цепи и смесью д/ц+к/ц нЛПС (рис. 3 а, б, в). Исследуемые образцы нЛПС S. flexneri 2а содержат неизменённый, 3-6-ацильный, липид А (рис. 4 а, б, в), а потому являются классическими эндотоксинами. Внутривенное введение кроликам данных образцов приводило к возникновению сильной пирогенной реакции (табл. 11).
Специфичные IgG, IgM определяли у мышей опытных и контрольных групп, используя в качестве детектирующих антигенов, адсорбируемых на твёрдой фазе полистироловых планшетов, те же самые образцы нЛПС S. flexneri 2а, какими были иммунизированы мыши. Таким образом, были определены конечные титры Ат в сыворотках мышей как на Аг, используемый для иммунизации мышей данной группы так и параллельных групп (табл. 12).