Введение к работе
Актуальность проблемы. Промежуточные продукты восстановления молекулярного кислорода до воды, такие как супероксидный радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал, принимают участие в иммунных реакциях многих живых организмов в качестве цитотоксических частиц против патогенных организмов. В литературе обсуждается также возможность участия кислородных метаболитов в иммунных реакциях насекомых. Однако существующие на сегодняшний день исследования в этой области ограничиваются лишь единичными работами, которые не позволяют сделать однозначный вывод об образовании и участии этих частиц в защитных реакциях насекомых.
Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы. Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза (ФО), окисляет тирозин до 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и далее до соответствующего ДОФА-хинона. Цепь последующих превращений приводит к образованию нерастворимого полимера меланина. Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием потенциально токсичных семихиноновых радикалов, в частности ДОФА-семихинонового радикала. Однако до сих пор не существовало экспериментальных доказательств образования этих частиц в процессе меланизации у насекомых. Некоторые исследователи полагают, что гипотетические семихиноновые интермедиаты меланизации могут взаимодействовать с молекулярным кислородом, восстанавливая его до супероксидного радикала. Существует ряд работ, в которых сообщается об образовании супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых. В этих работах супероксидному радикалу приписывается роль цитотоксичной частицы, ответственной за разрушение чужеродного организма в процессе его инкапсуляции. Однако авторы этих работ для регистрации супероксидного радикала применили недостоверный метод, поэтому полученные ими результаты вызывают сомнения. С другой стороны существуют работы, в которых авторам не удалось зарегистрировать
образование супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых.
Таким образом, на сегодняшний день не существует достоверных доказательств образования и участия супероксидного радикала в иммунных реакциях насекомых, и механизмы, приводящие к разрушению чужеродного материала в процессе иммунного ответа, остаются недостаточно изученными.
Основной целью настоящей работы являлось определение природы частиц, образующихся в процессе меланизации, которые могли бы выступать в качестве цитотоксических против патогенных организмов в процессе иммунного ответа насекомых. Для успешного выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1. Выяснить, сопровождается ли процесс меланизации у насекомых
образованием супероксидного радикала.
Зарегистрировать образование семихиноновых радикалов в процессе меланизации у насекомых.
Изучить роль супероксидного и семихиноновых радикалов в иммунных реакциях насекомых.
Научная новизна. В настоящей работе впервые было показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. Была изучена роль ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.
Впервые было показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазои происходит образование перекиси водорода. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазои прямыми методами не удалось. Однако, учитывая обнаруженное влияние супероксид дисмутазы на выход перекиси в этом процессе, был сделан вывод, что процесс окисления ДОФА фенолоксидазои сопровождается образованием супероксидного радикала.
Было обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого происходит образование ДОФА-
семихинонового радикала и перекиси водорода. Определена константа скорости этого взаимодействия, к = (3.4 ± 0.6)*105 М^с"1.
Показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора. Было также показано, что генерация перекиси водорода в процессе меланизации у насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала.
На основании результатов, полученных в настоящей работе, а также анализа литературных данных, был предложен механизм уникального, направленного на патогенный организм, цитотоксического действия, согласно которому частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала при иммунном ответе насекомых, могут являться такие интермедиаты процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.
Практическая ценность. В работе проведено детальное исследование процессов, протекающих на ранних стадиях меланизации у насекомых, показано какие частицы, образующиеся в этом процессе, могут принимать участие в реализации цитотоксического действия по отношению к чужеродным организмам. Полученные результаты могут быть использованы при разработке способов защиты сельскохозяйственных популяций насекомых от различных инфекций, а также при поиске препаратов для регуляции численности насекомых-вредителей.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на российских и международных конференциях: VI международная конференция имени Воеводского «Физика и «химия элементарных химических процессов» (Новосибирск, Россия, 2002), VIII международная школа молодых ученых «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применения» (Казань, Россия, 2004), международная конференция «Современное достижения магнитного резонанса» (Казань, Россия, 2004), сибирской зоологической конференции (Новосибирск, Россия, 2004), объединенная международная конференция «ЭПР спиновых ловушек» и «ЭПР спектроскопия и томография в
биологических системах» (Коламбус, США, 2005), 4-ая международная конференция по нитроксильным радикалам «Синтез, свойства и применение нитроксидов» (Новосибирск, Россия, 2005).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 4 статьях, а также в 6 тезисах докладов на российских и международных симпозиумах и конференциях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трёх глав, заключения, выводов, благодарностей, списка цитируемой литературы, включающего 140 наименований, и двух приложений. Работа изложена на 88 страницах, содержит 2 таблицы и 30 рисунков.