Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
1.1. Фотосенсибилизированные реакции при окислении белков. 9
1.2. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетно-возбужденными 2,2 -дипиридилом и производными флавина 13
1.3. Фотосенсибилизированные реакции при повреждении ДНК. Фотосенсибилизация хромофорами экзогенного происхождения на примере производных бензофенона 18
1.4. Применение метода ХПЯ с временным разрешением для изучения фотоиндуцированных радикальных реакций. 25
Глава 2. Экспериментальная часть 31
2.1. Материалы и реактивы 31
2.2. Методы исследования
2.2.1. ХПЯ с временным разрешением 31
2.2.2. Наносекундный лазерный импульсный фотолиз 33
2.2.3. Измерение рН 34
2.2.3. Расчеты DFT 35
2.3. Математическая обработка экспериментальных данных 35
2.3.1. Зависимость наблюдаемой константы скорости реакции тушения kqobs от рН водного раствора 35
2.3.2. Зависимость амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора 39
2.3.3. Кинетика ХПЯ 39
Глава 3. Фотоиндуцированное окисление ароматических аминокислот триплетно возбужденным 3,3 ,4,4 -тетракарбоксибензофеноном (TCBP) 42
3.1. Определение значений рКа для TCBP, N-ацетилтирозина, дипептидов гистидил-гистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланил-гистидин 42
3.2. Реакции тушения триплетного состояния TCBP ароматическими аминокислотами
3.2.1. Триптофан и Nацетилтриптофан 49
3.2.2. Гистидин и Nацетилгистидин 50
3.2.3. Тирозин и Nацетилтирозин 52
3.3. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора 54
3.3.1. Триптофан и Nацетилтриптофан 55
3.3.2. Гистидин и Nацетилгистидин з
3.3.3. Тирозин и Nацетилтирозин 57
3.3.4. Гистидил-гистидин, гистидил-фенилаланин и фенилаланил-гистидин
3.4. Кинетический изотопный эффект в фотореакции гистидина с ТСВР 60
3.5. Механизмы реакций 62
3.6. Заключение 65
Глава 4. Кинетика и механизм фотоиндуцированного окисления дипептида триптофил триптофан (Trprp) триплетно-возбужденным 2,2 -дипиридилом (DP) 67
4.1. Определение рКа дипептида Trprp 67
4.2. Спектры ХПЯ в фотореакции дипептида Trprp с DP и механизм этой реакции 68
4.3. Кинетика ХПЯ в фотореакции дипептида Trprp с DP 71
4.4. Влияние реакции депротонирования короткоживущих радикалов на кинетику ХПЯ
4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала гуанозина 76
4.4.1 Депротонирование короткоживущего катион-радикала дипептида Trprp 80
4.5. Заключение 80
Глава 5. Окисление пуриновых нуклеотидов триплетно-возбужденным ТСВР 82
5.1. Реакции тушения триплетного состояния TCBP пуриновыми нуклеотидами 82
5.2. Зависимости амплитуды ХПЯ геминальных продуктов реакции от рН водного раствора 87
5.3. Механизмы реакций 93
5.4. Заключение 97
Основные результаты и выводы 99
Список используемых сокращений 100
Список литературы 101
- Фотосенсибилизированные реакции при повреждении ДНК. Фотосенсибилизация хромофорами экзогенного происхождения на примере производных бензофенона
- Наносекундный лазерный импульсный фотолиз
- Реакции тушения триплетного состояния TCBP ароматическими аминокислотами
- Влияние реакции депротонирования короткоживущих радикалов на кинетику ХПЯ
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Во многих биологических системах важные функциональные процессы происходят с участием промежуточных короткоживущих радикалов. Роль радикалов аминокислотных остатков в качестве промежуточных звеньев при передаче электрона или атома водорода вызывает растущий научный интерес. Установлено, что триптофан и тирозин участвуют в качестве промежуточных окислительно-восстановительных реагентов в многостадийных процессах внутримолекулярного переноса электрона (ВПЭ) на большие расстояния в белках [1,2]. Предполагается также, что гистидин может являться одним из промежуточных агентов в цепи передачи неспаренного электрона к конечному акцептору [3], а также напрямую участвовать в окислительных процессах в живой клетке [4, 5]. Для процессов одноэлектронного окисления некоторых белков и пептидов показано, что процессы переноса электрона протекают с локализацией неспаренного электрона на имидазольном кольце гистидина [6]. Из перечисленного выше следует, что радикалы триптофана, тирозина и гистидина играют важную роль в целом ряде биохимических процессов.
Наибольшее количество работ относятся к исследованию переноса
электрона между остатками триптофана и тирозина методами оптической
спектроскопии промежуточного поглощения и химической поляризации ядер
(ХПЯ) с временным разрешением. Комбинирование ХПЯ с временным
разрешением и лазерного импульсного фотолиза (ЛИФ) и применение этих
методов в сходных экспериментальных условиях (одна и та же длина волны для
возбуждения красителя, концентрация реагентов и т.д.) позволяет наиболее
полно характеризовать фотоиндуцированные радикальные реакции с участием
биологически значимых молекул. ХПЯ создается в результате спин-
селективной рекомбинации радикалов и наблюдается в виде аномальных
интенсивностей и фаз спектральных линий в спектрах ядерного магнитного
резонанса (ЯМР) диамагнитных продуктов радикальных реакций.
Преимущество метода ХПЯ с временным разрешением состоит в том, что он позволяет легко разделять вклады от геминальных и внеклеточных процессов и определять константы скорости радикальных химических реакций. Метод ХПЯ с временным разрешением позволяет изучать радикальные реакции, не сопровождающиеся изменениями в оптических спектрах поглощения, например, реакции вырожденного электронного обмена. Данный метод необходим также для установления структуры и реакционной способности радикальных интермедиатов, особенно в условиях, когда образующиеся в ходе реакции короткоживущие радикалы обладают низкими коэффициентами поглощения, либо их спектры поглощения перекрываются. Например, ХПЯ используется для изучения оптически недетектируемых радикалов, таких как радикалы гистидина. Тем не менее, при изучении реакций переноса электрона с участием радикала гистидила возникают трудности [7]: среди ароматических аминокислот реакционная способность гистидина по отношению к триплетам производных флавина и дипиридила намного ниже, чем тирозина и триптофана [8]. Таким образом, для изучения радикальных реакций с участием радикалов всех трех ароматических кислот методом ХПЯ с временным разрешением, актуальной является задача подобрать такой водорастворимый краситель, триплеты которого реагируют с гистидином, триптофаном и тирозином с примерно одинаковой эффективностью.
Что касается нуклеиновых кислот и их строительных блоков, они
оказываются вовлеченными в патологические процессы в результате отрыва
электрона от оснований ДНК [9]. Ионизирующее излучение, фотоионизация,
фотосенсибилизированное окисление эндо- и экзогенными хромофорами,
такими как флавины, порфирины, бензофеноны, которые могут находиться в
живой клетке, приводят к образованию короткоживущих радикалов легко
окисляемых нуклеотидов. Все это предопределяет важность изучения
короткоживущих радикалов нуклеотидов. Однако высокая реакционная
способность, короткие времена жизни и низкая концентрация радикальных
интермедиатов сильно осложняют их выявление и исследование.
Использование комбинации двух методов - лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением - дает возможность для детального исследования реакций фотоиндуцированного окисления пуриновых нуклеотидов. Информация о механизмах фотохимических реакций с участием структурных единиц нуклеиновых кислот является важной и актуальной задачей, так как является важным шагом для понимания механизмов фотопроцессов, протекающих в живой природе.
Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы было установление кинетики и механизма реакции фотоиндуцированного окисления ароматических аминокислот и пуриновых нуклеотидов 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофеноном (ТСВР), а также дипептида Тгр-Тгр 2,2'-дипиридилом (DP) в широком диапазоне рН водных растворов. Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:
подобрать водорастворимый фотосенсибилизатор для фотогенерации короткоживущих радикалов гистидина, триптофана и тирозина со сравнимой эффективностью;
измерить рН-зависимость константы скорости тушения триплетно-возбужденного ТСВР различными тушителями (ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами);
измерить рН-зависимость интенсивности сигналов ХПЯ геминальной рекомбинации продуктов, полученных в реакции тушения триплетно-возбужденного ТСВР различными ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами;
- получить кинетические данные ХПЯ в реакции фото-окисления
дипептида Trp-Тгр 2,2'-дипиридилом.
Научная новизна. Показано, что при использовании водорастворимого
фотосенсибилизатора 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенона (ТСВР)
фотогенерация короткоживущих радикалов гистидина, триптофана и тирозина происходит со сравнимой эффективностью, что открывает возможность изучать реакции с участием радикалов этих биологически значимых молекул методом
ХПЯ.
Впервые установлен механизм реакции окисления ароматических аминокислот Tip, Туг, His, и их N-ацетилпроизводных, а также пуриновых нуклеотидов АМР и GMP триплетно-возбужденным ТСВР в диапазоне рН от 2 до 12. Проведены кинетические измерения и установлен механизм радикальных реакций, протекающих при фотоиндуцированном окислении дипептида Тгр-Тгр триплетно-возбужденным 2,2'-дипиридилом в водных растворах в широком диапазоне значения рН. Выявлено влияние заряда аминогруппы на окисление дипептида, состоящего из двух ХПЯ-активных аминокислот.
Практическая значимость работы. Получены данные о том, что фотосенсибилизатор 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенон может быть использован для генерации радикалов гистидина, тирозина и триптофана со сравнимой эффективностью, что позволяет изучать методом ХПЯ реакции переноса электрона на радикал гистидина в пептидах и белках. Данные о константах скорости реакции тушения необходимы для точного определения начального соотношения радикалов тирозина, триптофана и гистидина, образовавшихся на геминальной стадии. Последнее позволяет исключить данный параметр из варьируемых величин в уравнениях, описывающих кинетику ХПЯ. В результате точность моделирования повышается.
Методы исследования. В работе были совместно использованы методы ХПЯ с временным разрешением и лазерного импульсного фотолиза. Методом ЛИФ были измерены наблюдаемые константы скорости тушения триплетно-возбужденного красителя ароматическими аминокислотами и пуриновыми нуклеотидами в широком диапазоне рН водных растворов; методом ХПЯ с временным разрешением были зарегистрированы спектры ХПЯ продуктов геминальной рекомбинации короткоживущих радикалов (геминальные спектры ХПЯ) в широком диапазоне рН водных растворов и получены рН зависимости амплитуды геминальной ХПЯ. Кинетика и механизм реакции фотоиндуцированного окисления ароматических аминокислот и пуриновых нуклеотидов триплетно-возбужденным фотосенсибилизатором был установлен
из совместного анализа рН зависимостей наблюдаемой константы скорости тушения и амплитуды геминальной ХПЯ.
Положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся:
-
рН-зависимости наблюдаемой константы скорости тушения и интенсивности геминальной ХПЯ, полученные в реакциях триплетно-возбужденного ТСВР с ароматическими аминокислотами (Trp, Tyr, His и их N-ацетилированными производными) и пуриновыми нуклеотидами (AMP и GMP);
-
заключение о влиянии протонированного состояния аминогруппы ароматических аминокислот (Trp, Tyr, His) и фосфатной группы AMP на эффективность тушения триплетно-возбужденного TCBP;
-
зависимость эффективности процесса тушения триплетно-возбужденного DP от положительного заряда аминогруппы дипептида Trp-Trp.
Степень достоверности полученных результатов. Достоверность выводов и результатов работы обеспечена применением хорошо известных и апробированных экспериментальных методов. Вновь полученные результаты находятся в согласии с имеющимися в литературе данными.
Апробация результатов. Результаты, представленные в
диссертационной работе, докладывались и обсуждались на конференциях: XLIX
Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-
технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2010); X Encuentro
Latiniamericano de Fotochmica y Fotobiologa (Ля Серена, Чили, 2010); Central
European conference on photochemistry (Бад Хофгастайн, Австрия, 2010, 2012);
EMBO Practical Course «Multidimensional NMR in structural biology»
(Йоахимсталь, Германия, 2012); Всероссийской молодежной школе с
международным участием «Магнитный резонанс в химической и
биологической физике» (Новосибирск, Россия, 2012); VIII International
Voevodsky Conference «Physics and chemistry of elementary chemical processes»
(Новосибирск, Россия, 2012); 13th International Symposium on Spin and Magnetic
Field Effects in Chemistry and Related Phenomena (Бад Хофгастайн, Австрия,
2013); School for Young Scientists «Magnetic Resonance and Magnetic Phenomena
in Chemical and Biological Physics» (Новосибирск, Россия, 2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК. Материалы диссертации полностью изложены в опубликованных работах.
Личный вклад соискателя. Весь объем экспериментальных данных получен лично, либо при непосредственном участии соискателя. Автор также участвовал в разработке плана исследований, обсуждении результатов, формулировке выводов и написании публикаций по теме диссертационной работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, списка используемых сокращений, формулировки основных результатов и выводов и списка литературы. Полный объем диссертации составляет 116 страниц с 41 рисунком и 9 таблицами. Список литературы содержит 157 наименований.
Фотосенсибилизированные реакции при повреждении ДНК. Фотосенсибилизация хромофорами экзогенного происхождения на примере производных бензофенона
Вызываемое УФ-излучением окисление остатков фенилаланина протекает относительно просто по сравнению с другими ароматическими аминокислотами. Возбуждение фенилаланина в первое триплетное состояние приводит к реакции фотодиссоциации, продуктом которой является бензильный радикал [39]. При прямой фотодиссоциации Phе образуется катион-радикал, который быстро гидратируется с образованием o-, m-, pyr. Однако, данные процессы имеют значение лишь при облучении Рhe коротковолновым УФ-светом [38].
Гистидин не имеет хромофорных групп, поэтому для гистидина поглощение УФ или видимого света не является основным механизмом фотоиндуцированных повреждений, а большинство реакций с участием His, приводящих к повреждениям, происходят посредством фотосенсибилизированных процессов [4, 18]. Исследования модельных соединений гистидина в присутствии флавинов, а также других фотосенсибилизаторов, показали формирование короткоживущих радикалов с радикальным центром на имидазолиле. Методом ЭПР с применением спиновых ловушек было показано, что взаимодействие (по механизму фотосенсибилизации I типа) триплетно-возбужденного флавина и His сильно зависит от рН, а именно было выявлено влияние протонированных состояний иминогруппы His на скорость реакции с триплетно возбужденным флавином [4, 18]. Окисление гистидина как в свободном состоянии, так и в составе пептидов синглетным кислородом происходит через формирование эндопероксидов, разложение которых при комнатной температуре в органических растворителях ведет к образованию аспарагиновой кислоты, аспарагина, мочевины и других продуктов. В водных растворах свободный гистидин также дает бицикличные продукты [12].
Таким образом, повреждения белков, инициированные УФ-А и видимым светом, возникают в реакциях фотосенсибилизации, а также с синглетным кислородом и другими активными формами кислорода. Синглетный кислород реагирует с остатками Trp, His, Tyr, Met, Cys в основном с образованием эндопероксидов и цвиттерионных частиц. Образующиеся интермедиаты подвергаются дальнейшим превращениям, в том числе и по радикальному механизму, что ведет к нарушению белковой структуры. В дополнение к фотосенсибилизированным реакциям, также могут происходить прямые реакции фотоокисления некоторых аминокислотных остатков (например, Trp), что приводит к образованию возбужденных состояний и радикальных частиц, которые также важны в фотоиндуцированной деградации белка.
Для изучения методом ХПЯ фотоиндуцированных реакций биологически важных молекул – аминокислот, пептидов и нуклеотидов – наиболее часто используются красители 2,2 -дипиридил и водорастворимые производные флавина: люмофлавин, рибофлавин, флавин мононуклеотид (FMN). Совместное применение ХПЯ с временным разрешением и лазерного импульсного фотолиза дает возможность для наиболее полной характеризации фотоиндуцированных радикальных реакций с участием биологически значимых молекул. В работах [8, 40-47] методом лазерного импульсного фотолиза изучены механизмы фотоиндуцированных реакций с участием триплетно-возбужденного флавина и ароматических аминокислот: триптофана, тирозина и гистидина. При облучении импульсами лазера (=308 нм) раствора, содержащего флавин мононуклеотид и аминокислоту (триптофан, тирозин или гистидин), происходит образование триплетно возбужденного красителя 3FMN (max=370 нм), который затем реагирует с аминокислотой с образованием короткоживущих радикалов FMN– (max=360 нм) либо FMNН (max=340 нм) [41, 47]. На рисунке 1 приведена зависимость константы скорости тушения триплетного флавина kq тремя аминокислотами, N-ацетилтирозином, N ацетилтриптофаном и N-ацетилгистидином, от рН раствора [8, 41]. Тушение триплетно-возбужденного флавина N-ацетилтирозином и N-ацетилтриптофаном происходит с постоянной во всем диапазоне рН константой скорости kq, близкой к диффузионно-контролируемому пределу. Этот факт, а также наблюдение семихинонового анион-радикала показывают, что первичным актом реакции в данном случае является перенос электрона.
В отличие от N-ацетилтирозина и N-ацетилтриптофана, в случае N-ацетилгистидина константа скорости тушения триплетно-возбужденного флавина сильно зависит от рН среды (см. рисунок 1). В сильнокислотной среде (рН 3) тушение не наблюдается, потому что в этой среде оба исходных реагента, триплетно-возбужденный флавин и N-ацетилгистидин, протонированы и заряжены положительно. Реакция, по-видимому, является энергетически невыгодной, так как отрыв электрона привел бы к формированию высоко нестабильного дважды заряженного катион-радикала гистидина, а в случае переноса атома водорода образовался бы положительно заряженный радикал флавина. При увеличении рН в диапазоне от 3 до 7 наблюдается рост константы скорости тушения kq. При дальнейшем повышении рН наблюдается некоторое уменьшение константы скорости kq в области рН 10, а при рН 11 константа скорости резко возрастает. Уменьшение значения kq в области рН 10 связано с депротонированием исходного флавина [48]. В сильнощелочных растворах происходит депротонирование гистидина HisHHis +Н+ (символ «Н» обозначает лабильный протон имидазольного фрагмента гистидина, рКа=14.3). Анион гистидина реагирует с триплетно-возбужденным флавином по механизму переноса электрона с диффузионными скоростями [8, 41]. Первичным актом тушения триплетно-возбужденного 3FMN как протонированным HisH2+, так и HisH является перенос атома водорода, хотя константы скоростей для этих тушителей и различаются на два порядка: ql=3.0xl06 М-с1 для HisH2+ и q2=2.5xl08 М с1 для HisH [8, 41].
Зависимость константы скорости тушения триплетного флавина от рН раствора. Тушители: N-AcTrp (кружки), N-AcTyr (треугольники), N-AcHis (квадраты) [8]. Фотофизика и фотохимия 2,2 -дипиридила изучены довольно подробно, также как и фотохимические реакции дипиридила с ароматическими аминокислотами триптофаном, тирозином и гистидином, в которых были зарегистрированы значительные эффекты ХПЯ. В зависимости от рН раствора, 2,2 -дипиридил может находиться либо в протонированном (DPН+) или депротонированном (DP) состояниях (р К а=4.3) [49]. Максимум поглощения DP приходится на 281 нм с макс=14.600 M см1 и 308=1.200 M cм1, тогда как для протонированного DPН+ /Ц=301 нм, зо8=12.900 M cм1 [42]. Таким образом, для облучения растворов дипиридила на длине волны 308 нм при рН 4.3, основным ( 90%) светопоглощающим компонентом является DPН+, который в результате интеркомбинационной конверсии дает триплетно-возбужденный ТDPН+ [50, 51]. При рН 6.3 образуются нейтральный триплетно-возбужденный ТDP. При промежуточных значениях рН, 4.3 pH 6.3, свет могут поглощать как протонированные, так и депротонированные молекулы DP [50, 51].
В работе [42] методами лазерного импульсного фотолиза и ХПЯ с временным разрешением была изучена фотореакция между триплетно-возбужденным 2,2-дипиридилом и N-ацетилтриптофаном. Было показано, что первичным фотохимическим актом в реакции триплетно-возбужденного DP с N-ацетилтриптофаном является реакция переноса электрона (q=4xl09 M-с1). Константа скорости kq близка к диффузионно контролируемому пределу и немного снижается с повышением рН (см. рисунок 2). Авторы предполагают, что снижение происходит из-за увеличения разности зарядов реагирующих веществ. При высоких значениях рН DP присутствует в нейтральном состоянии, тогда как при pH 4.3 триплетный 3DPH+ заряжен положительно, N-ацетилтриптофан - отрицательно (pКа=2А) и кулоновские взаимодействия ускоряют бимолекулярную реакцию. В нейтральной или основной среде, образующийся в результате тушения триплетов красителя катион-радикал триптофан депротонирует (р а=4.3) с образованием нейтрального радикала триптофана. Эта реакция играет ключевую роль зависимости ХПЯ от времени: вырожденный электронный обмен между протонированным катион-радикалом триптофана и триптофаном в основном состоянии приводит к значительному уменьшению сигнала ХПЯ, в то время как для нейтральных радикалов электронный обмен не эффективен.
Наносекундный лазерный импульсный фотолиз
Для описания зависимости интенсивности геминальной ХПЯ от рН водного раствора был использован тот же подход, что и для рН-зависимости kqohs: рН-зависимости ХПЯ также были разделены на интервалы рН с границами на значениях pКа исходных реагентов [132]. В общем случае, на амплитуду геминальной ХПЯ влияют два фактора: концентрация образующихся радикалов (другими словами, насколько эффективно происходит реакция тушения триплетов красителя) и магнитные взаимодействия в радикальной паре. Эффективность тушения ( /;) зависит от концентрации тушителя в определенном протонированном состоянии (cq), собственного времени жизни триплетов красителя (г) и от константы скорости тушения для пары реагентов (&q;), и описывается уравнением Штерна-Фольмера: ЯІ= (Ю) Помимо константы скорости тушения (&q;), каждая пара реагентов характеризуется также значением поляризации (р{), сформированной в данной паре. Таким образом, суммарная интенсивность / геминальной ХПЯ, которая возникает в результате фотореакции, может моделироваться в виде суммы интенсивностей ХПЯ, сформированной в каждой паре реагентов, Ii=qi pi, умноженных на молярные доли (а) тушителя и красителя: / = JV. х a(quencher) х a(dye). (11)
Моделирование рН-зависимости интенсивности геминальной ХПЯ по уравнению (11) позволило определить значения I, определяющие интенсивность геминальной ХПЯ, возникающей для реакционных пар в определенном протонированном состоянии.
Моделирование кинетики ХПЯ было проведено согласно модели, предложенной Фишером с соавторами [134], и успешно используемой в работах Морозовой с соавторами [135] при моделировании кинетики ХПЯ для фотоциклических реакций, в которых продукты геминальной и гомогенной рекомбинации совпадают с исходными реагентами: TD + Q T (D +Q ) ИКК S (D +Q )—S- D + Q Приведем краткую выдержку из этих работ. Моделирование кинетики ХПЯ производится с помощью системы связанных дифференциальных уравнений, описывающих концентрацию радикалов R(f) и ядерную поляризацию радикалов P(R) и диамагнитных продуктов фотоциклической реакции Р(Рг) [134]: R(t) = —, (12) 1 + ktR0t = - kP(R)R - kjBR 2 - - kCP(R), (13) dP Prl = ktP(R)R + ktj3R 2 + kexCP(R). (14) Предполагается, что образование радикалов происходит мгновенно на временной шкале радикальных реакций. Для того, чтобы выполнить это условие, необходимо использовать такие концентрации реагентов, чтобы характерное время тушения триплетного возбужденного состояния красителя было заведомо меньше, чем длительность регистрирующего радиочастотного импульса, т.е. произведение (kqxCy 300 нс, где kq - константа скорости тушения триплетно-возбужденного красителя, С -концентрация молекул тушителя. Значение Р измеряется в эксперименте; Ro– начальная концентрация радикалов; kt - константа скорости бимолекулярной реакции гибели радикалов; Тх - время ядерной парамагнитной релаксации; р - параметр, который представляет собой поляризацию, созданную в F-парах. В случае триплетного предшественника /?= G/Ro, где Р–геминальная поляризация при ґ=0, у - постоянная, которая характеризует соотношение ХПЯ в геминальных парах и парах в объеме. В случае триплетного предшественника предел у равен 3. Для описания экспериментальных данных обычно используется 7=2.8 [40, 42].
Первые члены в правой части уравнений (13) и (14) описывают перенос поляризации от радикалов к диамагнитным молекулам в бимолекулярной реакции гибели радикалов; вторые члены представляют формирование поляризации в F-парах. Третий член в правой части уравнения (13) соответствует потере поляризации в радикалах из-за ядерной парамагнитной релаксации. Последние слагаемые в правых частях уравнений (13) и (14) описывают перенос поляризации от радикалов к диамагнитным молекулам (с концентрацией С) в реакции вырожденного электронного обмена с константой скорости кех (ШҐ + RH RH + RH+), где звездочкой отмечена ядерная поляризация.
Предполагается, что выход радикалов, избежавших геминальной рекомбинации и вышедших в объем, намного больше, чем выход геминальной рекомбинации, а также что радикалы гибнут только рекомбинируя друг с другом (с константой скорости kt). Начальные поляризации принимаются равными: что согласуется со спин сортирующей природой механизма интеркомбинационной S0 конверсии в радикальных парах [104]. Стационарное значение геминальной ХПЯ зависит от соотношения параметров Roxkt и Tf: чем больше время жизни радикалов, тем быстрее поляризация, противоположная по знаку геминальной, разрушается за счет парамагнитной ядерной релаксации.
Реакции тушения триплетного состояния TCBP ароматическими аминокислотами
Спад триплетного поглощения регистрировали на длине волны =590 нм (рН р а2тсвр=4.9) и =550 нм (рН р а2тсвр=4.9) [91], в условиях, когда триплетно-возбужденный краситель имеет максимум поглощения. Облучение импульсами лазера (=308 нм) раствора, содержащего 110-4 М ТСВР в отсутствие тушителя, приводит к образованию 3ТСВР, которые гибнут с константой скорости первого порядка d=(5.5-8)105 с-1 [91, 139] (триплет-триплетной аннигиляцией можно пренебречь). В присутствии тушителя, 3ТСВР реагирует с ним с константой скорости &0bs (см. рисунок 15). В результате из зависимости триплетного поглощения от времени с помощью зависимости Штерна-Фольмера (см. уравнения (2) и (3)) была получена наблюдаемая константа скорости тушения kq s. Рисунок 15. Спад сигнала промежуточного поглощения (obs=550 nm) триплетов ТСВР (110-4M) в присутствии His (концентрация увеличивается снизу вверх от 0 до 6.610-4 M) в водном растворе при рН=6.5. Вставка: график, полученный с помощью уравнения (3) (зависимость Штерна-Фольмера).
На длине волны 308 нм при выбранных концентрациях реагентов, поглощение Trp и N-AcTrp намного меньше, чем поглощение ТСВР. Поэтому облучение раствора, содержащего TCBP и Trp (или N-AcTrp), приводит сначала к образованию триплетно-возбужденного TCBP и затем к реакции тушения. Зависимости наблюдаемой константы тушения kqobs от рН представлены на рисунке 16. Полученные зависимости были описаны с использованием уравнений (9) (для Trp) и (19) (для N-AcTrp). В таблице 2 содержатся основные пары реагирующих частиц для каждого диапазона рН, определяемого значениями рКа реагентов, а также соответствующие константы скорости kqi, полученные при моделировании зависимостей kqobs от рН (сплошные линии, рисунок 16). Константа скорости тушения максимальна в кислотных рН и уменьшается при депротонировании 3ТСВР с увеличением рН. Более того, Trp с протонированной аминогруппой в 3 раза более реакционноспособен, чем Trp с нейтральной аминогруппой и N-AcTrp в нейтральном растворе. В щелочных растворах реакционная способность по отношению к 3ТСВР триптофана и N-ацетил-триптофана одинакова. к obs =к х
Зависимости наблюдаемой константы скорости тушения от рН: черные квадраты – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с Trp, белые квадраты – для реакции триплетно-возбужденного ТСВР с N-AcTrp. Сплошные линии – моделирование с использованием уравнений (9) и (19).
Поскольку гистидин не поглощает свет в УФ и видимой областях, облучение раствора, содержащего TCBP и His либо N-AcHis, приводит к образованию только триплетно-возбужденного TCBP со спектром промежуточного поглощения близким к опубликованному ранее [91, 139]. Соответствующие пары реагентов при различных значениях рН приведены в таблице 2. Полученные зависимости наблюдаемой константы скорости тушения (kqobs) 3ТСВР аминокислотами His и N-AcHis от рН водного раствора показаны на рисунке 17. Моделирование представленных зависимостей проводилось в соответствии с уравнениями (20) для His и (21) для N-AcHis (см. таблицы 1 и 2 для параметров). Полученные из моделирования значения kqi приведены в таблице 2.
Протонированные состояния реагентов сильно влияют на скорость реакции тушения 3ТСВР аминокислотой His и ее N-ацетилпроизводной N-AcHis (см. рисунок 17). В кислых растворах (pH 2.9) не наблюдается тушения триплетов 3TCBPH4 тушителями NH3+HisH2+ и N-AcHisH2+. В диапазоне значений рН от 2 до 7.6 (для His) и от 2 до 8.1 (для N-AcHis) наблюдается увеличение значения kqohs, что связано с последовательным депротонированием 3ТСВР (pКл1=2.9, рКа2=4.9), а также с депротонированием имидазольного кольца His (pКа=6.0) и N-AcHis (pKa=7.0), которое становится нейтральным. Более того, стоить отметить, что константы скорости реакции тушения триплетов 3ТСВРН22 тушителями NH3+HisH2+ и N-AcHisH2+ выше, чем для соответствующих пар с триплетами ТСВР . Для гистидина с нейтральным имидазолом (ра=6.0) и положительно заряженной аминогруппой (pХа=9.2) константа скорости тушения триплетов 3ТСВР4 составляет что намного выше, чем характерное значение константы скорости тушения по механизму переноса атома водорода (около 10 M с1 и ниже). Депротонирование аминогруппы гистидина при pH 7.6 уменьшает значение в 5 раз. В случае N-AcHis значение константы скорости тушения остается неизменным в диапазоне рН от 8.1 до 12.
Влияние реакции депротонирования короткоживущих радикалов на кинетику ХПЯ
Депротонирование TCBPH4 и TCBPH22– с увеличением рН не влияет на константу скорости тушения 3TCBP аденозин-5 -монофосфатом. В отличие от GMP депротонирование фосфата АМР (pKa=6.5) уменьшает константу скорости тушения в 5 раз. По сравнению с фотореакцией между триплетно-возбужденным ТСВР и Ado, изученной в работе [91], можно отметить, что присутствие отрицательно заряженного фосфата уменьшает константу скорости тушения kqobs в 4-6 раз во всем диапазоне рН.
Несмотря на тот факт, что аденозин обычно считается менее реакционноспособным по сравнению с гуанозином, так как последний имеет более низкий редокс-потенциал [75], наши результаты показывают, что AMP легко окисляется в реакции с 3TCBP в диапазоне pH от 2 до 12. Более того реакционная способность AMP примерно в 3 выше, чем реакционная способность GMP при 4.0 pH 4.9 и при pH 9.4.
Применение метода ЭПР для изучения радикалов пуриновых оснований в водном растворе при комнатной температуре ограничено низкой концентрацией и коротким временем жизни данных радикалов. В растворах радикалы аденозина и гуанозина могут быть зарегистрированы с использованием промежуточного оптического поглощения [92, 94]. Однако при этом трудно различить катионную, нейтральную и анионную формы радикалов нуклеотидов из-за перекрывания спектров промежуточного поглощения различных протонированных форм этих радикалов. Поэтому в данной работе использовался метод ХПЯ с временным разрешением, чтобы охарактеризовать радикальные интермедиаты, формирующиеся в реакции тушения триплетно-возбужденного ТСВР пуриновыми нуклеотидами аденозин-5 -монофосфатом и гуанозин-5 -монофосфатом, а также аденозином, для того чтобы подтвердить влияние протонированного состояния фосфата на константу скорости реакции тушения.
Описание радикальных интермедиатов важно с точки зрения механизма реакции тушения триплетно-возбужденного ТСРВ пуриновыми нуклеотидами; механизм данной реакции не может быть определен из данных ЛИФ. Реакция тушения триплетно-возбужденного ТСВР GMP или AMP (Ado) приводит к образованию спин-коррелированной радикальной пары в триплетном состоянии. Структура радикалов аденозина и гуанозина, формирующихся в реакции тушения зависит от рН водного раствора (рисунок 36). В данной работе символы G+и A+ использованы для обозначения катион-радикалов гуанозина и аденозина, соответственно, G(-H) и A(-H) – нейтральной формы этих радикалов, G(-2H)– – анион-радикал гуанозина. Эти обозначения относятся только к протонированному состоянию пуринового основания и не включают протонированное состояние фосфатной группы.
Спектры ХПЯ, полученные сразу после лазерного импульса, в фотореакции ТСВР и тушителя (GMP или AMP) при различных значениях рН показаны на рисунке 37. Видно, что амплитуда и знак геминальной поляризации изменяется при варьировании рН. Знак интегральной ХПЯ, , определяется с помощью правил Каптейна [113]: =sgn(g)sgn(A) для продуктов геминальной рекомбинации и триплетного предшественника радикальной пары. Здесь g=g1-g2 – разница g-факторов радикалов в радикальной паре и А – константа СТВ для рассматриваемого протона.
В спектрах ХПЯ GMP поляризован только протон Н8. Для протонов рибозы поляризации не наблюдалось. Отрицательная поляризация протона Н8 наблюдалась в кислотных и сильнощелочных растворах, положительная – в нейтральных и щелочных растворах. Последовательное изменение знака ХПЯ наблюдалось также для сигналов протонов ТСВР. Знак константы СТВ, заявленный для протона Н8 катион-, нейтрального и анион-радикалов, отрицателен [98, 132]. Значения g-фактора для радикалов гуанозина, измеренные в замороженном водном растворе при 77 К, составляют 2.0037 (катион-радикал гуанозина), 2.0034 (нейтральный радикал гуанозина), и 2.0036 (анион-радикал гуанозина) [98]. Значение g-фактора для анион-радикала ТСВР составляет 2.0035 [102]. Исходя из этого мы заключаем, что инверсия знака поляризации при изменении рН объясняется изменением знака разности g-фактора в парах радикала красителя и радикала гуанозина. Знаки поляризации соответствуют катион-радикалу гуанозина при pH 4.8, нейтральному радикало гуанозина G(-H) при 4.9 pH 13, и анион-радикалу гуанозина G(-2Н) в сильно-щелочных растворах (pH 13) (рисунок 36). В работе [132] в качестве красителя был использован 2,2 -дипиридил (g=2.0030 для нейтрального радикала дипиридила [153]), с депротонированием катион-радикала гуанозина не происходит изменения знака разности значений g-факторов, и поэтому инверсия знака ХПЯ не наблюдалась. В литературе также упоминается дикатион-радикал гуанозина GН++\ Однако данные о значениях g-фактора и констант СТВ для этого радикала не известны. Метод ХПЯ с временным разрешением позволяет различить катион- и дикатион-радикалы гуанозина, т.к. они участвуют в реакции вырожденного электронного обмена с диамагнитными молекулами (катион гуанозина для дикатион-радикала и нейтральный гуанозин для катион-радикала), и эта реакция протекает с различной эффективностью для двух пар реагентов, GH++7GH+ и G+7G, что отражается в кинетике ХПЯ. При моделировании рН-зависимости ХПЯ в данной работе мы учли оба радикала GMP (катион- и дикатион-) с соответствующим значением p а =2.1, в противном случае невозможно было получить хорошее согласие эксперимента и моделирования рН-зависимости ХПЯ для TCBP (пунктирная линия на рисунке 37).
Для аденозина известно два радикала, нейтральный и катион-радикал (см. рисунок 36). Значение g-фактора для катион-радикала аденозина в замороженном водном растворе при 77 К составляет 2.0034, для нейтрального радикала аденозина - 2.0037 [97]. Катион-радикал имеет отрицательные константы СТВ для протонов Н8 и Н2, нейтральный радикал А(-Н) имеет отрицательную константу СТВ для протона Н8 и положительную для протона Н2 [97, 156]. Поляризация на протоне Н8 AМР положительна (усиленная абсорбция) в кислотных растворах и отрицательная (эмиссия) в нейтральных и щелочных растворах. Соответствующее изменение знака поляризации наблюдалось для протонов ТСВР. Знак поляризации протона Н2 AMP остается положительным во всем изученном диапазоне рН. Данные наблюдения согласуются с тем, что ХПЯ возникает в реакции между радикалом красителя и катион-радикалом A+ при pH 4.9, и между радикалом красителя и нейтральным радикалом A(-Н) при pH 4.9. Изменение знака Ag, вызванное замещением катион-радикала аденозина на нейтральный радикал, приводит к инверсии знака поляризации протона Н8 АМР и протонов ТСВР, и сохранению знака поляризации протона Н2 АМР, для которого знаки константы СТВ и Ag изменяются одновременно.