Роль системы комплемента в патогенезе менингококковой инфекции Платонов, Александр Евгеньевич

Введение к работе

Менингококковая инфекция, описанная как отдельное инфекционное заболевание в начале 19 века [Viesseux, 1806], остается актуальной проблемой как для фундаментальной, так и для практической медицины.. Согласно российским демографическим исследованиям, социально-экономические потери (человеческих жизней и трудового потенциала) от менингококковой инфекции (МИ) занимают второе место среди потерь, вызываемых инфекционными болезнями, несколько уступая туберкулезу [Ермаков, 1995]. Это обусловлено тремя причинами: высокой летальностью МИ (10-15%); тем, что более 70% заболевающих - дети до 14 лет; отсутствием в настоящей момент в России массовой вакцинопрофилактики МИ. Следует подчеркнуть, что несмотря на очевидный прогресс медицинских знаний, технологий и фармакологии за последние 50 лет, летальность менингококковой инфекции осталась практически той же, равняясь в различных, в том числе развитых, странах 5-20% [Noah, 1996; Cartwright, 1995].

Экспериментальное исследование патогенеза менингококковой инфекции крайне затруднено отсутствием адекватной модели заболевания, пригодной для изучения на лабораторных животных. Данное обстоятельство вынудило нас предложить подход, при котором особенности патогенеза изучаются в группах лиц, генетически отличающихся по функционированию тех или иных механизмов резистентности. Сравнительный анализ возникновения и течения менингококковой инфекции в подобных группах лиц, дополненный опытами с тканевыми клетками человека в контролируемых условиях in vitro, должен был позволить оценить относительный вклад и принципы взаимодействия различных механизмов антименингококковой резистентности в норме и патологии.

Сама природа менингококковой инфекции, возбудитель которой широко циркулирует в здоровой популяции (до 10% и более носителей патогенных менингококков в коллективах), изредка, неожиданно и непредсказуемо приводящей к тяжелым генерализованным формам заболевания (порядка 3 случаев /100000 человек/год в Европе и России), которые нередко, опять же по неясным причинам, отягчаются фульминантным инфекционно-токсическим шоком и полиорганной недостаточностью, указывает на ключевую роль специфической и неспецифической резистентности человеческого организма в возникновении и развитии генерализованных форм менингококковой инфекции. Согласно современным представлениям, против менингококков .организм использует практически все известные способы антимикробной защиты; если

же оборона прорвана и менингококковый липополисахарид (МЛПС) -эндотоксин проникает в кровь, гиперактивация всех защитных систем становится дополнительным, и возможно, решающим патологическим фактором. Однако, одна из защитных систем привлекла наибольшее внимание. В 1984 году Ross и Densen [260] опубликовали обзор, из которого следовало, что люди с врожденным дефицитом одного из терминальных компонентов комплемента (ДТКК) в тысячи раз более подвержены менингококковой инфекции, чем люди с полноценной системой комплемента. К тому времени в мире было идентифицировано около 40 лиц с ДТКК, половина из них перенесли хотя бы один эпизод менингококковой инфекции, многие болели по несколько раз. На основе ограниченного числа наблюдений упоминалось, что летальность МИ у лиц с ДТКК была ниже (3%), чем у лиц с полноценной системой комплемента (около 20%).

В России (СССР) связь МИ и системы комплемента не исследовалась, люди с ДТКК не выявлялись, число их среди больных МИ не было известно. Таким образом, первой задачей стал широкий поиск лиц сДТККсреди больных МИ для последующего изучения роли системы комплемента в патогенезе МИ, взаимоотношений ее с другими механизмами иммунной защиты и т.д. С самого начала мы исходили из гипотезы о том, что, помимо основной протективной бактерицидной функции комплемента, при МИ, осложненной эндотоксическим шоком, активация системы комплемента может играть патологическую аутоагрессивную роль, гиперактивируя и повреждая собственные клетки и ткани. Отсутствие подобной аутоагрессивной составляющей могло бы объяснить сниженную летальность МИ у лиц с ДТКК.

Цель и задачи исследования. Целью работы было выяснение участия системы комплемента в патогенезе менингококковой инфекции и механизме токсического действия МЛПС. Для достижения данной цели были поставлены и выполнены следующие конкретные задачи:

1. Провести широкий поиск лиц с ДТКК среди больных МИ в Москве и России: выяснить, дефициты каких компонентов комплемента распространены в изучаемой популяции, каковы первичные генетические причины этих дефицитов; изучить взаимосвязь генетических дефектов и их фенотипических проявлений у лиц с ДТКК.

2. Оценить вклад лиц с ДТКК в общую заболеваемость МИ и сравнить восприимчивость к МИ у лиц с ДТКК и лиц с нормальной системой комплемента, а также лиц, имеющих ДТКК в гетерозиготном состоянии.

3. Изучить возрастные закономерности и клинические особенности заболеваний МИ, в том числе повторных, у лиц с ДТКК в сопоставлении с характеристиками МИ улиц с нормальной системой комплемента.

4. Определить концентрацию менингококкового эндотоксина (МЛПС) и степень активации/ потребления комплемента в крови больных МИ с нормальной системой комплемента и с ДТКК в сопоставлении с тяжестью, осложнениями и исходом заболевания.

5. Исследовать общий иммунный статус лиц с ДТКК; провести вакцинацию лиц с ДТКК полисахаридной менингококковой вакциной, изучить иммунный ответ на вакцинацию, оценить ее протективную эффективность, изучить возможные механизмы протективного действия вакцинации лиц с ДТКК.

6. Изучить заболеваемость МИ в группах пациентов (с ДТКК и с нормальной системой комплемента), отличающихся аллотипом Fcy-рецептороз (более эффективные или менее эффективные при фагоцитозе).

7. В опытах in vitro продемонстрировать возможность совместного цитолитического и активирующего действия МЛПС и системы комплемента на клетки крови человека, изучить роль мембраноатакующих комплексов комплемента, мембранных ингибиторов комплемента и изменения внутриклеточной концентрации ионов Са** в этом процессе.

8. На основании литературных данных, собственных иммунологических и генетических исследований, клинических и эпидемиологических наблюдений, а также клеточных экспериментов in vitro сформулировать представление о роли системы комплемента в патогенезе менингококковой инфекции.

Научная новизна. Выявление нами большой группы лиц с дефицитами С8 и С7 компонентов комплемента (около трети всех лиц с дефицитами С8 и С7, идентифицированных в мире) позволило впервые ответить на ряд фундаментальных вопросов о встречаемости лиц с ДТКК в российской популяции, степени их предрасположенности к менингококковой инфекции и особенностях возникновения и течения менингококковой инфекции у лиц с ДТКК, состоянии их иммунной системы, генетических причинах и фенотипических проявлениях ДТКК, иммунном ответе лиц с ДТКК на вакцинацию тетравалентной полисахаридной менингококковой вакциной, протективной эффективности вакцинации и фагоцитарных основах протективности. Впервые продемонстрировано влияние аллотипа рецепторов иммуноглобулинов класса FcyRlla, экспрессируемых на фагоцитах человека, на возникновение и тяжесть течения менингококковой инфекции у лиц с ДТКК и нормальной системой комплемента. Также впервые для достаточно большой

группы пациентов тяжесть течения и исход менингококковой инфекции были сопоставлены с концентрацией эндотоксина (менингококкового пипополисахарида) и степенью активации и потребления комплемента в крови больного. Впервые было обнаружено и изучено активирующее и цитотоксическое действие менингококкового пипополисахарида на клетки крови человека, опосредованное мембраноатакующими комплексами комплемента. На основание полученных данных сформулировано цельное представление об основах резистентности человеческого организма к менингококковой инфекции, об удельном вкладе, последовательности и последствиях реакций, связанных с антименингококковым действием специфических антител, системы комплемента и фагоцитарной системы.

Практическая значимость работы и использование полученных результатов. К практическим результатам работы следует отнести проведенную нами диагностику состояния системы комплемента у более чем тысячи больных, перенесших менингококковую инфекцию; выявление среди них более 50 лиц с врожденными и приобретенными серьезными дефектами системы комплемента, в том числе 49 лиц с ДТКК; проведенную вакцинацию лиц с ДТКК, позволившую предотвратить их повторную заболеваемость менингококковой инфекцией. На основании наших исследований дефицит терминальных компонентов комплемента внесен в "Расписание болезней", обуславливающих негодность к военной службе. Выдвинуто предложение, согласно которому поиск ДТКК должен проводиться среди лиц с повторными эпизодами менингококковой инфекции (данный пункт вносится в пересматриваемые в настоящий момент "Методические указания по клинике, диагностике и лечению менингококковой инфекции), а также, по мере развития социоэкономических возможностей, среди всех лиц, болеющих генерализованными формами менингококковой инфекции. Сформулированные в ходе настоящего исследования принципы поиска и изучения лиц с ДТКК были использованы и используются в аналогичных работах, проводимых в Голландии, Великобритании и Ирландии.

Финансирование работы. Проведение исследований было возможным благодаря средствам ЦНИИ эпидемиологии, Государственной научной стипендии Правительства РФ, гранту № 1010-СТ93-0011 от INTAS, грантам N44000 и N44300 от Международного научного фонда (МНФ), а также разовой финансовой поддержке со стороны Британского Совета, Медицинского Исследовательского Совета и Общества иммунологов Великобритании, МНФ, Общества исследований биологии лейкоцитов, Международного общества исследований эндотоксина, Европейской Группы мониторинга менингококков,

Европейского общества микробиологии и инфекционных болезней, университетов Амстердама, Утрехта, Лунда, Кардиффа, Канзаса, Айовы, Национального института здравоохранения Финляндии. Автор благодарен также администрации и сотрудникам Клинической инфекционной больницы № 2 г. Москвы (2^я КИБ), в которой была выполнена существенная часть исследований.

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования были представлены и обсуждены на следующих отечественных и международных конференциях: Всесоюзный симпозиум "Иммуногенетические аспекты аутоиммунных заболеваний и вторичных иммунодефицитов человека" (Новосибирск 1989); 2^я Всесоюзная конференция по бактериальным токсинам (Юрмала 1989); Конференция "Молекулярные механизмы патогенеза инфекционных болезней" (Звенигород 1990), Всесоюзная конференция по сепсису (Тбилиси 1990); III Всесоюзная конференция "Менингококковая инфекция и гнойные менингиты" (Новосибирск 1990), Constituent Congress of International Society for Pathophysiology (Moscow 1991); European Research Conference "Molecular pathogenesis of infectious disease; bacterial meningitis" (Eurovillage 1992); IV International Conference on Endotoxins (Amsterdam 1993); IV Всероссийский съезд инфекционистов (Суздаль 1993); 14^th & 15^th International Complement Workshops (Cambridge 1991, Kyoto 1993); 4^th meeting of the International Endotoxin Society (Helsinki 1994); IV Всероссийский съезд анестезиологов и реаниматологов (Москва 1994); 3^rd, 4^lh & 5^th European Meetings on Complement in Human Diseases (Cardiff 1991, Leiden 1992, Les Diableret 1994); 8^th & 9^th International Congresses of Immunology (Budapest 1992, San Francisco, 1995); 7^m & 8^th European Congresses of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Vienna 1995, Lausanne 1997); 5^й Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике (Москва 1995); 7^th, 8^th, 9^!h & 10^th International Pathogenic Neisseria Conferences (Berlin 1990, Mexico 1992, Winchester 1994, Baltimore 1996); Vll съезд Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва 1997) и др., а также на научно-практических конференциях ЦНИИ эпидемиологии, кафедр инфекционных болезней московских медицинских вузов и 2^ой КИБ (1989-95 гг). Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 научных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах, включает 53 рисунка и 23 таблицы, состоит из обзора проблемы, 8 глав, содержащих результаты собственных исследований, выводов и списка литературы (345 наименований).

Многопрофильный характер исследования потребовал применения комплекса разнообразных методик, которые здесь могут быть перечислены коротко. Использованные методы включали:

Сбор и анализ медицинской информации, создание активной системы поиска и выявления пациентов с ДТКК.

Биохимические и иммунохимические методы: а) гемолитические методы для оценки общей активности системы комплемента (СК) по классическому и альтернативному пути, а также активности отдельных компонентов СК и поиска лиц с ДТКК; б) гель-электрофорез, двойная иммунодиффузия и т.д. для точной идентификации, определения концентрации и оценки структурной и функциональной целостности компонентов СК и их комплексов; в) иммуноферментный анализ (ИФА) для определения концентрации антител к менингококковым полисахаридам и липополисахариду и некоторых компонентов СК.

Генетические методы: аллель-специфическая полимеразная цепная реакция для определения мутаций генов компонентов комплемента и аллотипов клеточных рецепторов IgG, рестрикционный анализ, прямое секвенирование по Сенгеру, и т.д.

Методы классической иммунологии: набор тестов для оценки иммунного статуса (лазерная нефелометрия - для определения концентрации иммуноглобулинов, проточная цитофлуориметрия для идентификации субпопуляций лимфоцитов, НСТ-тест для оценки ответа нейтрофипов на ЛПС); вакцинация пациентов с ДТКК и ее последующее изучение.

Микробиологические методы: совместное культивирование менингококков и неитрофилов человека с последующим определением жизнеспособности бактерий путем подсчета числа колониеобразующих единиц.

Цитофизиологические методы: а) культуры клеток; б) оптическая микроскопия (фазовый контраст, флуоресценция) для оценки повреждения клеток; в) проточная цитофлуориметрия и иммунохимия для выявления мембраноатакующих комплексов комплемента и ингибиторов комплемента на клетках крови; г) изучение пюминол-зависимой хемилюминесценции для выявления активации неитрофилов; д) использование селективных флуоресцентных красителей (Fura-2AM) для измерения концентрации внутриклеточного кальция.

Статистический анализ и математическое моделирование: хранение, обработка и математический анализ полученных данных с помощью

коммерческих пакетов программ RBASE, ACCESS, Harvard Graphics, Statgraph, SPSS на персональном компьютере; стандартный набор тестов непараметрической и параметрической статистики для описания заболевания лиц с ДТКК и анализа экспериментальных данных (критерии Манна-Уитни, хи-квадрат, Фишера, ANOVA, Каплан-Мейера и др., вычисление относительных рисков, коэффициентов асимметрии и т.п., кластерный анализ, пошаговый отбор независимых факторов); использование биномиальных распределений и процесса Пуассона, решение систем дифференциальных уравнений для анализа и моделирования заболеваемости МИ и развития патологического процесса.