Проточная ДНК-цитометрия костного мозга у больных острыми лейкозами Кучма, Юрий Мирославович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Современные программы противоопухолевой химиотерапии (XT) базируются в основном на эмпирическом анализе результатов лечения в многоцентровых исследованиях. Несмотря на постоянное совершенствование протоколов XT острых лейкозов на основе эмпирического подхода, в значительном числе случаев ремиссии достигнуть не удается, особенно при рецидивах заболеваний. Изыскание новых подходов к применению цитостатических средств, увеличение избирательности и эффективности их действия связано с углубленным изучением процессов клеточной кинетики при лейкозах. Различия в чувствительности клеток к действию цитостатиков обусловлены особенностями их пролиферации. Вместе с тем, такое классическое понятие онкологии, как величина ростовой фракции опухоли до настоящего времени не получило должного распространения в лейкозологии. По-видимому, это связано с трудностями применения методов исследования клеточного цикла в клинической практике. В период ремиссии заболевания в организме остается около 100 миллионов лейкозных клеток. Однако реальная возможность контроля опухолевого клона весьма ограничена. Для мониторинга минимальной остаточной болезни необходимы дополнительные методы исследования. С появлением метода проточной ДНК-цитометрии представилась возможность быстрого и информативного анализа распределения клеток по содержанию ядерной ДНК с высокой разрешающей способностью. Это позволяет определять параметры клеточного цикла и выявлять анеуплоидные клеточные клоны. Исходя из этого, внедрение проточной ДНК-цитометрии костного мозга в клиническую практику представляется актуальной задачей.

Цель работы: оценка пролиферации и плоидности клеток костного мозга у больных острыми лейкозами до и после XT методом проточной ДНК-цитометрии, использование полученных данных в гематологической практике.

Основные задачи исследования

1. Методом проточной ДНК-цитометрии у больных с острыми миелоидными
лейкозами исследовать распределение миелокариоцитов по фазам
клеточного цикла до и после XT и установить его влияние на показатели
миелограммы и крови.

1. Изучить влияние стандартной XT на пролиферацию миелокариоцитов больных острыми миелоидными лейкозами.

2. Установить различия в пролиферации клеток костного мозга больных, достигших и не достигших ремиссии заболевания.

4. Исследовать ДНК-плоидность клеток костного мозга при острых лейкозах
в динамике заболевания и возможность использования её для контроля
минимальной остаточной болезни.

Научная новизна. Показано, что метод проточной ДНК-цитометрии позволяет достоверно оценивать пролиферативную активность миелокариоцитов и выявлять анеуплоидные клеточные клоны у больных острыми лейкозами. Установлено, что фракция покоя костного мозга прямо коррелирует с величиной опухолевой массы, а пролиферирующая фракция зависит от сохранности нормальных ростков кроветворения. Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) в активной фазе характеризуются снижением фракции роста костного мозга по сравнению с нормой. При выходе заболевания в ремиссию после курса XT наблюдается значительное повышение пролиферативной активности кроветворных клеток, связанное с регенерацией нормального кроветворения. ДНК-анеушюидия выявляется у 21% пациентов с острыми лейкозами и может быть использована для мониторинга минимальной остаточной болезни в фазе ремиссии заболевания.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют современные представления о пролиферации клеток костного мозга при острых лейкозах. Метод проточной ДНК-цитометрии можно применять для оценки гемопоэза до и в процессе XT острых лейкозов, разработки новых программ XT.

Апробация диссертации. Материалы работы докладывались и обсуждались на: научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н.Бурденко "Возможности и перспективы диагностики и лечения в клинической практике" (Москва, 1992); международном симпозиуме "Новые направления в развитии гематологии" (Санкт-Петербург, 1992, 1994); V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995); гематологической секции Московского научного общества терапевтов (Москва, 1996); научно-практической конференции "Клиническая лабораторная диагностика -состояние и перспективы" (Санкт-Петербург, 1996); конференции "Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее" (Москва, 1996); симпозиуме "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1997).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, включающего 54 отечественных и 147 зарубежных источников. Изложена на 118 страницах, содержит 7 таблиц и 43 рисунка.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проточная ДНК-цитометрия костного мозга даёт возможность исследовать распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла и использовать эти данные в повседневной клинической практике.

2. С увеличением опухолевой массы при ОМЛ происходит снижение доли миелокариоцитов, вступающих в клеточный цикл.

3. Восстановление нормального кроветворения после курса XT сопровождается выраженным увеличением пролиферативной активности миелокариоцитов, что является признаком выхода острого лейкоза в ремиссию.

4. У больных острыми лейкозами проточная Д НК-цитометрия костного мозга позволяет выявлять анеуплоидные клоны клеток и в отдельных случаях

контролировать минимальную остаточную болезнь.

В основу настоящей работы были включены результаты 304 исследований клеточного цикла миелокариоцитов у 122 больных острыми лейкозами. 172 исследования проведено у 62 больных ОМЛ и 132 исследования у 60 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). В группу больных ОМЛ вошли 51 мужчина и 11 женщин в возрасте от 18 до 82 лет на момент развития заболевания, средний возраст - 33 года. Для индукции и консолидации ремиссии у больных ОМЛ использовались цитозин-арабинозид, даунорубицин и 6-меркапгопурин по программам XT "7+3" и "TAD-9". Поддерживающая XT проводилась ежемесячными ротирующими 5-дневными курсами, в которых цитозин-арабинозид последовательно комбинировался с рубомицином, 6-меркаптопурином, винкристином и циклофосфаном в течение 3 лет. Среди больных ОЛЛ было 52 мужчин и 8 женщин в возрасте от 17 до 63 лет, средний возраст - 29 лет. Больные ОЛЛ получали XT по протоколу немецкой группы исследования острых лейкозов 04/89. Протокол предусматривал 8-недельную индукцию ремиссии, включавшую винкристин, рубомицин, L-аспарагиназу, преднизолон, циклофосфан, 6-меркаптопурин, цитозар. Далее проводились две 5-дневные консолидации цитозаром и вепезидом, 6-недельная реиндукция и поддерживающая XT 6-меркаптопурином и метотрексатом в течение 3 лет.

Анализ показателей пролиферативной активности костного мозга проводился только в группе ОМЛ. Это связано с тем, что основная масса исследований была выполнена у больных в процессе проведения XT, и с самого начала существовал вопрос, как отделить изменения пролиферации, обусловленные заболеванием, от изменений, обусловленных цитостатическим воздействием. Часть больных получили цитостатики или преднизолон до поступления в госпиталь. Поэтому после сбора анамнеза и анализа всей медицинской документации в группу больных, достоверно не получивших лекарственных препаратов до первичного исследования пролиферации, вошло только 20 человек. Длительность заболевания от первых клинических проявлений до первой ДНК-цитометрии костного мозга составляла от 6 до 66 дней. На основании данных, полученных от этих больных, были сделаны выводы о влиянии заболевания на пролиферацию клеток костного мозга.

152 исследования у 53 больных ОМЛ было проведено в различные сроки после окончания курсов XT. Поскольку лечение больных с ОМЛ проводилось прерывистыми курсами, период восстановления кроветворения, прошедший от окончания цитостатического воздействия до момента исследования, имел

решающее влияние на показатели пролиферации. Поэтому все исследования, проведенные после XT, были сгруппированы по недельным интервалам от + 1 до + 50 дня (от 0 до 7 недель соответственно) таким образом, чтобы отклонения по срокам не превышали 3 дней. Была определена динамика изменений пролиферации костного мозга в зависимости от срока, прошедшего с момента окончания курса XT. Основная часть исследований после курсов XT выполнена через 3-4 недели после их завершения, перед началом очередного курса. Однако по различным причинам, как правило, связанным с осложнениями химиотерапии, перерывы между очередными курсами лечения были значительно увеличены и пункции костного мозга выполнялись через 5, 6 и 7 недель после завершения курса. Часть исследований были выполнены непосредственно в момент окончания XT, а также через 1 и 2 недели после окончания курса. Таким образом, были получены данные о зависимости пролиферативной активности миелокариоцитов от времени, прошедшего с момента цитостатнческого воздействия. Корреляционный анализ между показателями ДНК-гистограммы и миелограммы проводился в точках, стандартизированных по недельным интервалам после воздействия стандартных по интенсивности курсов XT. Период наблюдения за больными с проведением ДНК-цитометрии костного мозга составлял от 1 до 43 месяцев. Учитывалось также общее число проведенных курсов XT, которое составляло у разных больных от 1 до 29. Исследование пролиферативной активности костного мозга в динамике при ОЛЛ требовало принципиально иного подхода в связи с другим характером химиотерапии и в данном исследовании не проводилось. Изучение частоты ДНК-анеуплоидии проведено в группах ОМЛ и ОЛЛ. Клеточный состав костного мозга (миелограмму) и периферической крови анализировали в препаратах, окрашенных по Романовскому.

Распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла (G_W1, S, G₂M) производили методом проточной ДНК-цитометрии. Для окраски клеточной ДНК использовали одновременно два красителя - бромистый этидий и хромомицин А₃. Клетки костного мозга получали пункцией грудины или подвздошной кости. После того как игла со шприцем вынута из кости и содержимое помещено на предметное стекло, в опорожненный шприц набирали 0,5 мл раствора, содержащего цитрат натрия в концентрации I г/л и флуоресцентный краситель бромистый этидий (0,05 г/л). Получившийся смыв клеток со стенок иглы и шприца помещали в пробирку. Раствор цитрата натрия вызывал лизис эритроцитов и способствовал хорошему связыванию флуоресцентных зондов с ядерной ДНК. Концентрация клеток получалась оптимальной для последующих проточно-цитометрических измерений. К полученной взвеси добавляли равный объём раствора хромомицина А₃. При совместном использовании двух флуоресцентных зондов значительно возрастает интенсивность реакции и повышается точность измерений. Непосредственно перед измерением полученную взвесь инкубировали с рибонуклеазой.

Работа выполнена на проточном цитофлуориметре - анализаторе и сортировщике клеток EPICS-C (Coulter Electronics, США). Для возбуждения флуоресценции применяли длину волны 457,9 нм от аргонового лазера "Argon-Innova 90-6" ("Coherent", США) с выходной мощностью 6 Вт. Эмиссионным объективом световые сигналы углового светорассеяния и флуоресценции фокусировались на соответствующих детекторах, которые преобразовывали их в электрические импульсы и регистрировались компьютером прибора. В процессе прохождения образца прибор обеспечивал одновременное измерение до 6 параметров клетки с представлением результатов в виде четырех одно- и двухпараметровых гистограмм. Установка оборудована компьютером для обработки данных, сопряженным с процессором самого прибора. В одном образце анализировали, как правило, 30 тысяч клеток. Комплексное тестирование аппаратуры проводили при помощи стандартных калибровочных частиц, которые применяли как для оценки точности работы приборов, так и для их ежедневной настройки. Для анализа ДНК-гистограмм использовалась специальная компьютерная программа распределения клеток по содержанию ДНК. В отношении клеток костного мозга больных острыми лейкозами метод флуоресцентной окраски и проточной ДНК-цитометрии обладал достаточно высокой точностью и воспроизводимостью результатов. При измерении отдельных образцов отношение пиков G,M/G_0/| составляло 1,95-2,04, что свидетельствовало о хорошей линейности измерений. Основным параметром, характеризующим разрешающую способность метода, является коэффициент вариации, который рассчитывали по ширине пика G_n/1. Этот показатель в большинстве случаев не превышал 3,5%. Значения коэффициентов вариации использовали в качестве критерия для определения принадлежности популяции определенному клеточному клону. Обнаружение ДНК-анеуплоидного клона подтверждалось его регистрацией в двух разных образцах костного мозга при условии совпадения индексов ДНК. Статистическая обработка результатов исследований выполнена с помощью пакета компьютерных программ Statistica и Stat View. Диаграммы получены при помощи программ Statistica и Microsoft Excel.

Фрагменты работы выполнены в соавторстве с к.б.н. О.Н.Поповой, Е.А.Белоусовым, Н.М.Щербаковым, к..ф.-м..н. С.М.Куликовым.