Введение к работе
Многочисленные клинические и экспериментальные исследования последнего десятилетия свидетельствуют о важной" роли-системы комплемента (СК) в инициации и регуляїрш защитных реакций организма. Являясь частью иммунной системы, комплемент участвует в осуществлении иммунного надзора за собственными клзгками организма, в ответе на внешнюю агрессия, в реакциях воспаления и з клиренсе иммунных комплексов (Pesce and Dosecura, 1933; Sresrnan and Volanakis, 1986; Rother and Rother, 1985; Egwang and Befus, 1984; Lambris,- 1988; Gordon and Hostetter, 1986; Morgan et al., 1985; Cooper and Nemerow, 1S89; Becherer et al., 1989). Работы последних лет указывают на конкретное участие СК в развитии патологических изменений * при всех заболеваниях, ..связанных с активацией СК (Whaley, 1989; West, 1989).
Ключевую роль играет компонент СЗ, участвующий в активации СК как по классическому пути, так и по альтернативному как часть трєжмолекулярного фермента - С5-коквертазы. Компонент СЗ комплемента и его фрагменты, образующиеся в результате активации СК, реагируют с рядом сывороточных белков, мембранных-рецепторов, низкомолекулярных соединений;" чужеродных' белков, вы-' зывая различные биологические эффекты, объединяемые термином "воспаление" (Weiler, 1987, Lambris.1988). Это целый комплекс ответов организма, включащий анафилактические реации, участие простатландинов, интерлейкинов, интерферонов, системы свертывания крови, галшновой системы и т.д. (Weiler, 1987; Lambris, .. 1988). Полифункциональность СЗ обусловливает его наибольшую концентрацию в плазме крови по сравнению с другими компонентами комплемента, его концентрация сравнима с концентрацией иммуноглобулинов классов А и М. Вследствие этого количественный дефицит компонента СЗ и его гиперпродукция и входят в перечень причин развития аутоиммунных и опухолеродных процессов (Weiler, 1987).
Кроме компонента СЗ предстазляпг значительный интерес гомологичные ему компоненты С4 и С5. Компонент С4 является составной частью^ СЗ- и С5-конвертаз классического пути, а с
активации С5 начинает формироваться мембраноатаданций комплекс. Фрагменты всех трех белкоз, образующиеся при протеолити-ческом расщеплении в результате активации, обладают анафилак-тогенными свойствами. Ряд фрагментов СЗ и С4 имеют рецепторы на поверхности шмунокомпетентных клеток, участвуя в клеточной кооперации, олсонизащш и т.д. (Janatova et al.» 1989; Robbins. et al., _ 1987). Как и компонент СЗ, С4 является., белком острой фазы (Whicher and Dieppe, 1985).
Ряд тяжелых' инфекционных заболеваний обусловлен дефицитами - наследственными и приобретенными - указанных колшонен-, тов СК. К этим заболеваниям относятся рекуррентные инфекции , вызываемые Streptococcus pneumoniae, Haemophilus-influenzae, Neisseria meningitis,^-hemolytic streptococci, а также бруцед-. лез, токсоплазмоз (Gordon and Hotetter, 1986; Frank, 1987). Широко распространенные аутоиммунные патологии также связаны с наследственными в приобретенными дефицитами компонентов С4, СЗ и С5. Сюда относятся: системная красная волчанка и СКВ-подобные синдромы, гломерулонефрити, ревматоидный.артрит, васкулиты и др. (Frank, 1987).
Терапия, направленная на контроль и коррекцию СК, несомненно, является перспективней. Кроме того, мониторинг отдельных компонентов СК позволяет осуществлять подбор дозы ряда препаратов, применяемых при дачении и оказываниях' влияние на статус комплемента при ревматоидном артрите, инсулинзависимом сахарном диабете, системной красной "волчанки, атеросклерозе (Whaley, 1989, West, 1989; Whicher, 1978; Козлов, 1993,.1994).
Среди методов определения компонентов комплемента имму-нохнмические наиболее популярны в силу их высокой специфичности, относительной простоты в постановке и- учете результатов. Определение уровней кошонентов комплемента является рутинной процедурой в клинических иммунологических лабораториях sa .рубежом. Современная отечественная лабораторная практика распей, латает иммунохимическтш'наборами (ыоноспецифическими- .антисн-воротками и белковыми стандартами) для определения компонентов Clq, Сіинг и СЗ , а также.набором.реагентов для определения гемолитической активности компонентов Clq, СІ, С2, СЗ, С4, С5 и факторов В и D (Козлов, 1982; Козлов, 1985). Однако, например, " для решения ряда аадач клинической кошшементологии (оценки комплементарного статуса больных) и в зкеперименталь-
ных научных разработках имеется потребность в иммунохимических реагентах для определения количеств компонентов СЗ, С4 и С5.
В связи с вышесказанным, ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ являлось выделение иммунохимически чистых компонентов комплемента -- СЗ, С4 к С5 как антигенов, получение монослецифических'антисыворо-ток к ним и использование наборов иммунохимических реагентов' для определения концентраций указанных белков в сыворотке крови при некоторых заболеваниях.
Источником антигенов для получения антисывороток был помимо дорогостоящей плазмы крови бросовый осадок IV-1, являющийся отходом промышленного получения альбумина и иммуноглобулинов спиртовым методом Кона (Kistler and Friedll, 1980). Использование балластных белковых фракций как источника сырья оправдано для десятков белков крови, которые наряду с широко применяющимися альбумином и иммуноглобулинами могли бы также использоваться как диагностические и лечебные средства в силу присущей им биологической активности (ингибиторы протеиназ, гаптоглобкн, орозомукоид, травсферрин, церулошазмин, С-реак-тизный белок, белок S, карбоксилептидаза В и многие другие) (Drohan and William, 1938, Inoue, 1989). Применение бросового осадка IV-1 для выделения-3-х компонентов комплемента является частью исследований, направленных" на разработку безотходной технологші в производстве.препаратов крови,'проводимых в.лабог ратории медицинской биотехнологии МНИИЗМ им. Г.Н.Габричевского, что позволит более рационально использовать такое ценное биологическое сырье, каким является кровь человека.
-
разработать схемы выделения иммунохишчески чистых компонентов комплемента: СЗ, С4, С5 из плазмы крови человека и из бросового осадка IV-1 по Кону;
-
провести шмунохимический анализ компонентов комплемента, выделенных из различных источников сырья;
-
разработать методы получения моноспецифических антисывороток к выделенным компонентам комплемента и создать наборы иммунохимических реагентов для количественного и качественного ана-. лиза компонентов СЗ, С4, С5;
-
использовать полученные иммунохимические реагенты для характеристики комплементарного статуса при ревматоидном артрите и
- 4 -атеросклерозе.
предложена оригинальные способы выделения и очистки компонентов СЗ, С4, С5'из плазмы крови человека и из бросового осадка IV-1, получаемого при производстве препаратов крови спиртовым, фракционированием по методу Кона;
получены новые иммунохимические реагенты для качественной и количественной характеристики компонентов СЗ, С4, С5 в сыворотках крови и других биологических жидкостях человека (синовиальной жидкости, бронхо-альвеолярном секрете и др.): полик-лоналъные шноспещифические кроличьи антисыворотки и стандартные сыворотки крови;
определены уровни компонентов СЗ, С4, С5 в сыворотках кроЕИ здоровых доноров России;
показана возможность использования компонентов СЗ, С4, С5 как системы мониторинга при ангиосклерозе сетчатки глаза.
показана возможюсгь осуществления принципов безотходной технологии на некоторых этапах производства препаратов крови;
подучено положительное решение по заявке на патент "Способ выделения СЗ компонента комплемента" (М 5045791/14 (018006) ог 30.08.93г.) " " " ' ' 1 ' ' '
оформлены заявки на получение патентов и получены приоритетные справки на "Способ выделения С4 компонента комплемента" (N 94025651 от 25.07.94г.) ' и "Способ выделения С5 компонента комплемента" ( N 94025626 ог 25.07.94г.);
разработаны способы получения ковьк мовоспецифических антисы-. вороток к компонентам СЗ, С4 и С5, пригодных для количественного и качественного анализа указашшх компонентов комплемента в клинической практике и научно-исследовательской работе; проводится оформление НТД на "Антисыворогки диагностические против компонентов С4 и С5 , сухие, предшитирующие".
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена наЩ страницах машинописи, включает ?42страниц текста, 11 таблиц и 18 рисунков и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка- литературы, . включая ?? отечественных и 223. иностранных литературных источника.
АПРОБАЦИЯ работы проведена на заседании секции Ученого -Совета MHJMSai им. -Г.Н. Габричевского ."Иммунологии и медицине-
-5--кая биотехнология" в феврале 1995 г.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 6 пе
чатных работ. "