Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам BRUCELLA ARORTUS 19 BA Михайлов, Леонид Михайлович

Введение к работе

Weynants V.C. et al, 1997).

r'

Современная лабораторная диагностика бруцеллеза осуществляется с прйменением бактериологических, биологических, серологических, аллергологических и молеку-лярно-генетических методов исследования. Эффективность выделения возбудителя из крови заболевших зависит от вида бруцелл и для В. meliiensis sоставляет 62-92, , аля В. abortus не превышает 5-15 %. Наибольший процент выделения культур бруцелл регистрируется из мнелопроб (56.8-100). Выделение возбудителя из другого материала не имеет существенного практического значения.

Исследование патологаческого материала с помощью бактериологического и биологического методов является сложным и трулоемким процессом, поэтому результаты - положительные или отрицатсльпыс - могут быть получены не ранее трех недель,

а, как правило, - через один - дьа месяца от начала анализа (Вершилова П.А., Драновская Е.А., 1976). В связи с этим широкое раснространенне получили серологические методы: реакции Хеддльсона, Райта, Кумбса, РИГА, РИАТ, РСК и другие. Однако, основанные на использовании поликлоиальных бруцеллезных иммуноглобулинов, они не могут гарантировать специфичности результатов из-за наличия антител к общим аптцгенным детерминантам бруцелл и ряда других микроорганизмов, в частности, Franci-setta tularensis, некоторых представителей рода Salmonella, Vibrio cholerae, Escherichia coli и особенно Y. enterocolitica 0:9 (Гонтарь ИЛ. с сравт.т 1980, 1984; Желудков ММ., 1981, 1983; Драновская Е.А. с соавт., 1991; Redmond J.W., 1975, J979; Bundle D.T. et al.,1984; Grieser-Wilke I. et al., 1985; Kocablyoglu C., 1990; Kittelberger R. et al., 1995, 1995).

Известно, Что аерекр«стие реакции между бруиелламн и кишечными иерсиния-ми обусловлены наличием общих антигенных детерминант в О-боковой цепи их лино-полисахаридов (ЛПС) (Соколова Е.С., 1984; Wilson G.S., Miles А. А., 1932; Bundle D.T. et al., 1984; Wu A.M. e( al., 1984; Douglas J.t., Palmer D.A., 1988; Palmer DA., Douglas J.T., 1988; Weynants V. et al, 1996, 1997). Считается, что ЛПС, содержащийся в клеточЧой стенке бруцелл, является их нммунодомштаитным антигеном (Драновская Е.А., 1972, 1978; Moreno Е.А. et al., 1979; Вешіап D.T., Kurts R.S., 1987). В последнее время уделяется большое внимание изоляции и изучению свойств специфических для возбу- ' дителя бруцеллеза белковых антшенов (Драновская Е А с соант, 1991; Маликов В.Ё. с. соавт., 1991; Чибисова В.Л. с соавт., 1992; Cloeckaerl А. et al., 1991, 1992, 1995, 1996; Denoel P.A. et al,, 1997). Aктуальность детального исследонания антнгенной структуры бруцелл определяйся необходимостью разработки высокоспецифичных диагносгическмх-препаратов. Однако решить эту проблему с помощью полтвалентных сывороток оказалось невозможным, так как они представляют собой смесь ИМ MVHOniOOV ТИПОв пішшчной специфичней! а споеооа р.шелешы ил и наскшцее время не емцееппст.

Решение этой задачи стало реальным благодаря внедрению в практику научных nсследований гибрЯдомной технологии получения моноклональных антител (МопАТ), впервые предложенной G. КоЫег, С. Milstein в 1975 г. Моноклональные антитела, про дуцируемые изолированным клоном, в отличие от поливалентных сывороток представляют собой достаточно чистое ЯМІР.9ЖОЄ вещество, а не неопределенную гетерогенную смесь иммуноглобулинов, которая изменяется с каждым иммунизированным животным и даже с каждой порцией крови одного и того же животного. Культуры'гиб-ридных клеток способны продуцировать в неограниченном количестве точно повторяющуюся химическую структуру иммуноглобулинов. Гйбридомная технология позволяет получать «чистые» антитела даже к неочищенным антегепам (Кеннет Р.Г., 1983).

Получение гибридом, продуцирующих бруцеллезные МонАТ, проводили с использованием различных антигенов и схем иммунизации животных (Будашей А.К. с соавт.,1990; Козловский В.Н. с соавт., 1993; Bundle D.T. et al., 1984; Quinn R. et at., 1.984; Greiscr-Wilke I. et al., 1985, 1987; Holman P.J. et al., 1985; Roop P.M. et al., 1987; Douglas J.T., Palmer DA., 1988; Cloeckaert A, et al., 1990, 1991. 1993, 1996). Полученные МонАТ использовали для изучения айтигенпой структуры бруцелл, их протективньгх свойств, дифференцирования бруцелл от близкородственных по антигенному строению микроорганизмов, для очистки антигенов, а также для определения родовых п вп-довых признаков бруцелл. Созданные на основе МонАТ лиагностичсскне препараты оказались весьма перспективными и имели преимущество перед поликлонапьнымн аналогами (Боровиков С.Н., Булашев А.К., 1991; Булашев А.К. с соавт., 1991; Каральник Б.В. с соавт., 1991; Студенцова В.К. с соавт., 1991).

Тем не менее, описанный в литературе набор бруцеллезных МокАТ является скорее всего далеко не полным,"в связи с чем проблема получения гибридных клонов, обладающих способностью к стабильному синтезу новых, уникальных по своей специфнчностн бруцеллезны> МонАТ, не теряет акгуальности и в настоящее премя.

Цель работы. Получение гибридом - нродуцентов моноклональных антител к антигенам В. abortus 19ВА, изучение с их помощью антигенной структуры бруцелл и коиструнровадие на их основе диагностических тест-систем.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальную схему иммунизации мышей бруцеллезным антигеном для получения максимального, количества специфнчески стимулированных сплсноци-тов. ' .

2. Модифицировать способ улучшения ростовых свойств коммерческой эмбриональной телячьей сыворотки. .

3. Получить {ибридрмы, стабильно продуцирующие бруцеллезные мояоклональ-ные антитела.

4. Изучить иммунологические свойства полученных моноклональных антигел.

5. Определить с помощью МонАТ антигенные детерминанты, отеетственные за перекрестную реакцию бруцелл и кишечных иерсцнийсеровара 0:9. . ' . .

6. Сконструировать на основе моноклональных антител бруцеллезную латексную тест-систему, усовершенствовать иммунофермеитный метод и изучить в лабораторных условиях их специфичность и чувствительность. '.,''.

Научная иовизна. Получен оригинальный набор гибридных клонов, синтезирующих моноклоцалыше антитела различной специфичности в отношении бруцелл и некоторых гетерогенных микроорганизмов. Выделен штамм гибридных клеток со стабильной продукцией моноклональных антител, специфичных к белкам бруцелл с молекулярной массой 18 и 3 8 кД;

Впервые с помощью моноклинальиых антител получены новые данные об антигенном строении бруцелл, свицттельеіВуюШие о юм, что перекрсстная реакция между бруцеллами и Y «„госоШіса0яможсі пронсходить не только за счет обшнх ангиген-'

ных детерминант, локализованных в 0-боковой цспн нх ЛПС, но и в области их поли
пептидов. ' -'

Получен патент Российской Федерации "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus muscuhs L. продуцент моноклональных антител, специфичных к. препарату белков бруцелл с молскуля;яым весом 18 и 38 кД", № 2113475 от 20 июня 1998 г. .'-...

Впервые установлено, что реакция лейкоцитолиза может служить объективным критерием эффективности 'проведенной антигенной стимуляции сплеиоцитов мышей BALB/c бруцеллезным антигеном, способствующей увеличению частоты гибридизации и выходу стабильных антителопродуцирующих гибридом.

Определена возможная причина невысокой эффективности гибридизации и слабой клонообразуюшей способности гибридом, обусловленная цптотоксическим действием перитонсальных макрофагов, добавляемых в среду культивирования в качестве клеток, продуцирующих ростовые факторы.

Практическая ценность работы н внедрение в практику.

- Создана коллекция гобридом, синтезнруюших моиоклинальные антитела к ан-

г

тигенам В. abortus 19ВА, которые могут быть использованы для изучения антигенной

s структуры возбудителя бруцеллеза и разработки диагностических препаратов.

На основе моноклональных антител 2АН10 сконструирована и испытана бру-целлезная латексная тест-система, усовершенствован иммуноферментный анализ для идентификации штаммов В. abortus и В. suis, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.

Модифицирован способ улучшения качества коммерческой эмбриональной те-лячьей сыворотки, являющейся одним из основных компонентов культурал ьных сред для выращивания клеток миеломных и гибридных линий.

І

- Подобрана оптимальная схема иммунизации мышей бруцеллезными антигенами, позволяющая с большей эффективностью получать стабильные антителопродуци-рующие габридомы, и усовершенствованы отдельные этапы гибридомной технологаи.

Составлены и утверждены "Методические рекомендации по использованию реакции лейкоцитолиза для определения иммунокомпетеитности лимфоцитов, используемых для получения гибридом к бруцеллезному антигену" (Протокол ученого совета №3 от 26 января 1995 г.).

Моноклональные антитела 2АН10 использовали в отделе микробиологии чумы с группой подготовки кадров Иркутского противочумного института при выполнении научно-исследовательской работы по теме: "Лабораторный контроль продовольствия па зараженность возбудителями особо опасных инфекций", №ГР 01930009493.

Основные положение, выносимые на защиту

7. Реакция лейкоцитолиза является объективным критерием выбора оптимальной схемы иммунизации мышей бруцеллезным антигеном, даюшей макримальиый эффект при последующей гибридизации родительских, клеток, '--,.:"

8. Качество отдельных серий коммерческих эмбриональных телячьих сывороток, используемых в гибридомной технологии, можно улучшить обработкой их раствором

пэг-6000. ' . ^л'^: '' "'.'-,_ .-.'' :-:.;;:.;'''..' :-.'

3. Эффект цитотоксичиости перитонеальных макрофагов, применяемьгх'в качестве подкормочных клеток, препятствует успешному проведению работ по получению . гибридом. ,' , - ^: -".',' ','. ,;.. -

4. На основе моноклональных антител 2АН10 сконструирована латексная и усовершенствована нммуноферментная тест-системы, способные с высокой специфичностью н чувствительностью дифференцировать В. abortus и В. suis or A melitwis н В. nmg&ri, а также ео Г. enterotolmca a:0:9 :

9 5. Серологическая перекрестная реакция между брунеллами и У.' enterocolitica 0:9

обусловлена общими антигенными детерминантами не только в области их липополн-

сахарпдов, но и белков с молекулярной массой 18 и 38 кД.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены па:

научно-практической конференцій "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиология и профилактика особо опасных инфскционных заболеваний", Омск, 1993 г.

научно-практической конференции "Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке", Чита, 1993 г.

Юбилейной научной конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных н природно-очаговых болезней", Иркутск, 1994 г.

Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997 г.

Юбилейной научно - практической конференции, посвященной 75-легию Государственной санитарно-эпидемиологической службы России. Иркутск, 1997 г.

- научных конференциях Иркутского научно-исследова гельского противочум
ного института Сі-бири и Дальнего Востока. Иркутск, 1991-1998 гг.

Публикации. Основное содержание материала диссертации отражено в заключитсльных отчётах о НИР; "Получение моноклоиальпых антител к поверхностным антигенам Brucella abortus 19 ВЛ",№ ГР 019IOO33784, нив. № 02. 97.0001801. "Лабораторный контроль продовольствия на зараженность- возбудителями особо опасных инфекций", № ГР 01930009493, инв. № 02.98.0005761. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения. )аключения, выполов н списка использованных литератур-

ных источников. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц и один рисунок. Список литературных источников содержит 197 наименований, втом числеІЗЗ зарубежных. .