Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
І.І. Факторн, стимулирующие эритропоэз 9
1.2.Факторы, ингибирующие эритропоэз 23
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
2.1. Метод выделения эритроцитарных антикейлона и кейлона из плазмы, экстракта эритроцитов и эритролизата 38
2.2.Метод определения активности эритроцитарных антикейлона и кейлона с помощью авторадиографии 42
2.3.Метод получения лизата и стромы из эритроцитов 43
2.4.Методы изучения некоторых биологических и физико-химических, свойств эритроцитар
ных антикейлона и кейлона 44
2.5. Метод получения гипоксической гипоксии, и постгипоксической полицитемии 45
ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИКЕЙЛОНА И КЕЙЛОНА 47
З.І. Тестирование фракций на биологическую активноcть 47
3.2.Зависимость действия антикейлона и кейлона от их концентрации в культуре 51
З.З.Зависимость действия антикейлсша от вводимой дозы в условиях целостного организма 58
ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЩТАРНЫХ АНТЖЕЙЛОНА И НЕЙЛОНА 62
4*1. Определение активности лизата и стромы эритроцитов 62
4.2.Изучение динамики выхода антикейлона и кейлона из эритроцитов 63
4.3.0пределєние специфичности действия антикейлона и кейлона 63
4.4.Влияние предварительной совместной инкубации на активность, антик ейлона и кейлола 67
4.5.Исследование антикейлона на токсичность и пирогенноеть 67
4.6.Влияние антикейлона на созревание клеток эритроидного) ряда 69
ГЛАВА 5. СОПОСТАВЛЕНИЕ ЭРИГР0ЦШАРНОГО АНТИКЕЙЛОНА С ЭРИТРОПОЭТИНОМ ПО НЕКОТОРЫМ ПРИЗНАКАМ. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭРИТРОЦИТАРНЫХ АНТИКЕЙЛОНА И КЕЙЛОНА 75
5.1. Определение активности антикейлона на постгипоксических полицитемических мышах. 75
5.2.0пределение активности антикейлона и нейлона в крови у крыс с двусторонней нефр-
эктомией 76
5.3.Чувствительность антикейлона и; нейлона к тепловой обработке и стабильность их в
процессе хранения 77
5.4.Молекулярная масса антикейлона и кейлона и их белковые спектры 80
ГЛАВА 6. ЭРШЮЦШРНЫЕ АНТЙКЕЙЛОН И КЕЙЛОН ПРИ ГИПОКСЙЧЕСКОЙ ГИПОКСЖ Ж ПОСТГЙПОКСЙЧЕСКОЙ ПОЛИЦИ ТЕМИЯ 8%
6.1»Активность антикейлона и кейлона, выделенных из плазмы 85
6.2»Активность антикейлона и кейлона, выделенных из экстракта эритроцитов » 85
6.3,Активность антикейлона и кейлона, выделенных из эритролизата 88
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
ВЫВОДЫ 108
ВНЕДРЕНИЕ 109
ЛИТЕРАТУРА 110
- Факторн, стимулирующие эритропоэз
- Метод выделения эритроцитарных антикейлона и кейлона из плазмы, экстракта эритроцитов и эритролизата
- Тестирование фракций на биологическую активноcть
- Определение активности лизата и стромы эритроцитов
- Определение активности антикейлона на постгипоксических полицитемических мышах.
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших проблем современной гематологии является изучение механизмов регуляции пролиферации и дифференциации кроветворных клеток, закономерностей нормального! и патологического роста. Кроветворная ткань принадлежит к числу самообновляющихся систем организма, управляемым универсальными и специфическими законами регуляции и саморегуляции.
Нормальный эритропоэз как и весь гемопоэз в целом является строго сбалансированным процессом, в котором гибель элементов крови адекватно восполняется вновь образующимися клетками (Е.Н.Мэсягина, 1976а,б). Постоянство количественного и качественного состава красной крови поддерживается взаимодействием большого числа факторов, которые могут быть объеденены по своему конечному эффекту в две основные группы - стимуляторы и ингибиторы (В.Н.Черниговский и др., 1967; С.Ю.Шехтер, 1976; О.И.Моисеева, 1979). Многие стороны регуляции эритропоэза к настоящему времени уже достаточно* полно изучены. Так, накоплен значительный материал об основном стимуляторе - эритропоэтине (Н.А.Федоров, М.Г.Кахетелидзе, 1973; Kuratowaka , 1968; Eraiev et al. , 1971, и др.). Показана важная роль продуктов распада эритроцитов в стимуляции эритропоэза (Б.А.Серебряная, 1970; Я.Е.Ужанский и соавт., 1977; Н.М.Новиков и соавт., 1980).
Что касается ингибиторов эритропоэза, то, несмотря на то, что их исследования начались относительно недавно, сведения о них весьма обширны и зачастую трудно сопоставимы. Так, имеются данные об ингибиторах, действие которых сводится к нейтрализации стимулирующей активности эритропоэтина (О.И.Моисеева, 1976; Kuratowaka , 1968; Mori jama ,Shimotori,
- б -
1970). Исследования последних лет (Г.В.Heyстроев, 1983; Ьогй et al. , 1977; Bateman , Pollock , 1977) свидетельствуют о tomj что основную и наиболее специфическую роль в ингибиции эритропоэза играет эндогенный регулятор - эритроцитарный кейлон (ЭК).
В то же время совершенно отсутствуют сведения о биологиче
ском антагонисте эритроцитарного кейлона - эритроцитарном анти-
кейлоне (ЭАК), предположение о существовании которого вытекает
из факта обнаружения антикейлонов в гранулоцитах (Ю.М.Бала и
соавт., 1978, 1979; В.Н.Немых, Ю.М.Бала, 1983; Rytomaa ,
Kiviniemi , 1968а,б,в), фибробластах ( Salaa , Green ,
1971), печени (A.H.Пашков, Т.Д.Авдеева, 1981; П.А.Карманов и соавт., 1983) и некоторых других клетках и тканях.
В связи с вышеизложенным, для понимания механизмов эндогенной регуляции эритропоэза, представляется актуальным выделение и изучение нового стимулятора эритропоэза - эритроцитарного антикейлона, а также определение его взаимосвязи с эритроцитар-ным кейлонон в норме и при экспериментальной патологии системы эритрона.
Целью исследования явилось выделение и изучение свойств ЭАК и ЭК и определение их активности у человека и животных в норме, а также под влиянием возмущающих эритропоэз факторов.
Задачи работы: І.Разработать методику выделения ЭАК и ЭК. Получить препараты и определить их эффективные дозы.
2.Изучить биологические и физико-химические свойства ЭАК и ЭК.
3.Провести сравнительную характеристику ЭАК и эритропоэтина (ЗП).
4.Исследовать влияние гипоксической гипоксии и постгипокси-ческой полицитемии на активность ЭАК и ЭК в крови мышей.
5*0ценить значение кейлонно-антикейлоиной системы в общем механизме регуляции эритропоэза.
Методические подходы. Для выделения ЭАК и ЭК использованы методы спиртового фракционирования и гель^-фильтрации на сефа-дексе. Для оценки активности препаратов применяли метод авторадиографии (с использованием меченого по тритию тимидина) в культурах эмбриональной печени мышей и костного мозга крыс и мышей, а также в условиях in vivo на мышах. В работе использовались модели гипоксической гипоксии и постгипоксической поли-цитемии у мышей. Все исследования с животными проводились под эфирным наркозом.
Научная новизна. Впервые выделен и описан тканеспецифиче-ский, видонеспецифический стимулятор эритропоэза - ЭАК. Показано его отличие от ЭП по уровню действия, месту образования и некоторым физико-химическим свойствам. Расширены сведения об ЭК-эндогенном ингибиторе эритропоэза. Определена активность ЭАК и ЭК у животных в норме и при экспериментальной патологии системы эритрона (гипоксия, полицитемия), а также у здоровых доноров. Впервые выдвинуто экспериментально обоснованное положение о существовании наряду с ЭП кейлонно-антикейлонной системы регуляции, осуществляющей, вероятно, более тонкий контроль на уровне активно пролиферирующих, морфологически идентифицируемых, клеток эритроидного ряда.
Практическая значимость. Помимо теоретического аспекта работа имеет несомненную практическую ценность. Определение уровня ЭАК и ЭК в крови больных с различной патологией красного кроветворного ростка, а также чувствительности костномозговых элементов к этим факторам могут служить в качестве дополнительных и весьма чувствительных тестов для понимания патогенеза, оценки степени тяжести и эффективности лечения этих заболеваний,
целей дифференциальной диагностики, а также позволят обсуждать новые подходы к лечению некоторых из них.
Проводимые в настоящее время исследования (В.А.Белошевский, 1981, 1982) подтверждают это заключение.
Результаты работы внедрены в клиническую практику гематологического центра Воронежской областной клинической больницы и городского гематологического кабинета г.Воронежа с 1980г., кафедры детских болезней Томского медицинского института с 1982г., детской больницы № 2 г.Томска с 1983 г.
Публикации.. По материалам исследования опубликовано 12 научных работ, оформлено одно рационализаторское предложение.
Основные положения диссертации доложены:
І.На I Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов. Баку, 1979 г.
2.На I Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов. Ленинград, 1981 г.
3„На Ч Международном симпозиуме по кейлонам. Москва, 1982 г.
4*На научной конференции Воронежского государственного медицинского института, посвященной 20-летию ЦНИЛ. Воронеж, 1982 г.
_ 9 -
Факторн, стимулирующие эритропоэз
В настоящее время не вызывает сомнений, что основным гуморальным фактором в регуляции эритропоэза является ЭП. По современным представлениям это гормон гликопротеиновой природы с молекулярной массой (ММ) 40 000-46 000 Д, изоэлектрической точ -кой 4,5 и электрофоретической подвижностью Л j и сі, 2 глобу -линов, который участвует в регуляции эритропоэза путем воздействия на коммитированные стволовые клетки, направляя их дифференциацию в сторону эритроидного ряда ( Goldwaaser , 1976; Miyake et al. , 1977; Garcia et al. , 1979). В течение последних десятилетий ЭП были посвящены многочисленные исследования, результаты которых обобщены в ряде обзоров и монографий (Я.Г.Ужанский, 1968а,б; Н.А.Федоров, М.Г.Кахетелидзе, 1973; Е.Н.Мосягина и соавт., 1976а, б; Erslev et al. , 1971; Zuca-li , Mirand , 1975; Goii , 1974, 1976). ЭП - постоянно- действующий регулятор эритропоэза. Уровень его в нормальной плазме, определяемый различными методами, составляет В среднем 20-50 мЕд/мл (Lange , 1971; Napier et al. » 1977; Dunn et al. , 1979). Выявление гормона в условиях нормы имело большое значение, поскольку это свидетельствует в пользу его участия в регуляции эритропозза в физиологических условиях.
Образование ЭП стимулируется при гипоксиях различного происхождения: вследствие кровопотери, гемолитической фенилгидра-зиновой анемии, при пониженном атмосферном давлении. Причем, изучение динамики накопления ЭП показало, что, несмотря на различие методов исследования, данные авторов в основном совпадают: наибольшей эритропоэтической активностью обладает кровь через 20-24 ч после стимулирующего гипоксического воздействия (Н.А. Федоров, М.Г.Кахетелидзе, 1973; Stohlman et al. t 1968). Установлено, что колебание кислородного режима в условиях целостного организма осуществляет, свое влияние на кроветворение опосредованно) через органы, участвующие в образовании ЭП (КиЪапек et al. , 1968; Fisher et al. , 1971).
ГИПОКСИЯ - не единственная причина повышенной продукции ЭП. Стимуляторами его образования ЯВЛЯЮТСЯ также кобальт, андрогени, и продукты распада эритроцитов. Роль последних в регуляции эритропоэза будет подробно рассмотрена ниже (см. гл. І.Ів).
Основным органом, ответственным за продукцию ЭП в организме человека и животных, являются почки. После двусторонней нефрэктомии животные не реагировали на кровопускание и введение солей кобальта повышением эритропоэтической активности (В.Н. Черниговский и др., 1967; О.И.Моисеева, 1974, 1976; Е.Н.Мося-гина и соавт., 1976а; Kurtides et al. , 1965). Многочисленные экспериментальные и клинические исследования, демонстрирующие повышение содержания ЭП в плазме в условиях снижения оксигена-ции почек, также свидетельствуют в пользу его. почечного происхождения (Е.Ф.Морщакова, А.Д.Павлов, 1974; Л.Н.Катаева, Н.Н.Сперанский, 1978; Fisher et al. , 1975).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 38
Метод выделения эритроцитарных антикейлона и кейлона из плазмы, экстракта эритроцитов и эритролизата
Для выделения ЭАК и ЭК использовался метод, предложенный для получения эритроцитарного кейлона из экстракта эритроцитов (Kivilaalcao , Rytemaa » 1971) в нашей модификации. ЭАК и ЭК выделяли из плазмы, экстракта эритроцитов и из эритролизата.
Свежая кровь подвергалась центрифугированию в течение 15 мин при 2 тыс. об/мин. Плазма отсасывалась, а оставшиеся эритроциты дважды отмывались и инкубировались в солевом растворе Хэнкса (в соотношении 2:3) при 37С в течение I ч. Экстракт отделялся от клеток центрифугированием. Для получения эритролизата оставшиеся эритроциты подвергались осмотическому гемолизу дистиллированной водой (1:5) в течение 0,5 ч.
Дальнейшая очистка плазмы, экстракта эритроцитов или эритролизата включала в себя, наряду с предложенной финскими исследователями гельфильтрацией на сефадексе, предварительное спиртовое фракционирование.
К экстракту эритроцитов (эритролизату или плазме) приливался охлажденный 9б#-й этанол до конечной концентрации 70$. В течение 15 мин осадок формировался на магнитной мешалке. После центрифугирования (2 тыс.об/мин в течение 15 мин) надосадок вновь насы - 40 щался этанолом до. 87#-Й концентрации и помещался на магнитную мешалку. Все операции проводились при t +4 С. Полученный в результате центрифугирования осадок (0,7-0,87) растворялся в небольшом количестве элюента и подвергался гель-хроматографии,на сефадексе G-75 фирмы Pharmacia Fine Chemicals (Швеция).
Объем колонки составлял 60 мл (диаметр « 1,5 см, высота - 30 см), ее свободный объем - 19 мл, объем одной фракции - 1,6 мл, всего отбиралось 50 фракций. Скорость вытекания элюента - 1,9 мл/мин. В качестве элюента использовался раствор Хэнкса (если активность препаратов исследовалась сразу после выделения) или дистиллированная вода (если препараты хранились до использования в лиофи-лизированном состоянии). Элюирующая жидкость предварительно охлаждалась В случае необходимости получения большого количества препаратов ЭАК и ЭК применяли хроматографическую колонку объемом 180 мл (объем наносимого образца - 5-Ю мл, объем, одной фракции - 2 мл, количество отбираемых фракций - 100). Светопог-лощение каждой фракции регистрировалось на спектрофотометре СФ-І6 при длине волны 276 нм. Полученные значения представлялись в виде графика, на основании которого объединялись фракции, соответствующие активным зонам ЭАК и ЭК» Применение впоследствии спектрофотометра (СФ-4А) с проточной кюветой (А.Н.Пашков, 1974) значительно упростило и ускорило получение ЭАК и ЭК, выход которых регистрировался самописцем типа Н-39 в виде двух пиков (см. фото I). Элюаты, соответствующие активным зонам ЭАК и ЭК, собирались в отдельные колбы и,х либо сразу тестировались на активность, либо; в последующие дни, для чего они разливались в объеме, не превышающем 2,5 мл, во флаконы, замораживались в жидком азоте и подвергались лиофилизации. Собранная в нашей лаборатории, лио-фильная установка (В.М.Лифшиц) состояла из вакуумного сушильного шкафа, вакуумного, насоса РВН-20 и вакууметра типа ВТ-2.
Тестирование фракций на биологическую активноcть
Экстракт эритроцитов (от одной крысы) подвергался обработке по описанной ранее методике (см.гл.2Д), в результате чего получали 50 фракций. Измерялась экстинция каждой фракции при длине волны 276 нм и полученные значения представлялись в виде элюционной кривой (рис.1, кривая I). Как видно из рисунка профиль элюции состоит из двух отчетливых пиков. Поскольку "специфические по отношению к мишеням молекулы могут содержаться во фракциях, не совпадающих с пиками профиля элюции" (А.Балаж, И.Впажек, 1982), исследованию подвергались, все фракции. Их активность оценивалась в культурах клеток эмбриональной печени мышей по ИМ в процентах от контроля. При этом в каждую культуру вносилось 1/2 объема исследуемой фракции. Всего проведено б опытов.
Оказалось, что. биологической активностью обладают фракции., совпадающие с пиками профиля элюции. Так, фракции; с 10-й по 16-ю оказывают выраженный стимулирующий эффект, причем максимальное действие вызывают Н-я и 12-я фракции, которые увеличивают ИМ на 20,26$ от исходного (табл. 2). Величина vе / v0 , т.е. относительный элюционный объем содержащих стимулятор фракций находится в пределах 0,85-1,35. Фракции, с 37-й по 42-ю оказывают достоверный ингибирующий эффект, причем максимальное дей Таким образом, применение модифицированного метода обработки экстракта эритроцитов позволила выявить, две группы фракций, отличных как по своим элюционным параметрам, так и по характеру своего биологического действия. Фракции, содержащие стимулятор и совпадающие с первым пиком профиля элюции, объединялись и использовались в опытах в качестве ЭАК» Другая группа фракций, которая содержала ингибитор и совпадала со вторым пиком элюци-онной кривой, также объединялась и использовалась в качестве ЭК.
Определение активности лизата и стромы эритроцитов
Активность, лизата и стромы эритроцитов оценивалась авторадио-графически в культурах клеток эмбриональной печени мышей. Для получения данных компонентов использовались крысиные эритроциты до и после одночасовой экстракции их раствором Хэнкса.
Оказалось, что: строма клеток о.беих. групп не изменяет пролифе-ративнуа активность эритробластов (табл 9). В то, же время лизат достоверно, увеличивает ИМ эритробластов; причем, лизат эритроцитов до зкстракцииі оказался более активным, по сравнению с таковым после нее.: включение метки возрастает, соответственно, на 18,48% и, 6,37$ (табл.9).
Что касается ЭК, то предполагаемым местом его локализации является наружная поверхность, клеточной мембраны (Г.В.Неустроев, 1979).
Изучение динамики выхода антикейлона и кейлона из эритроцитов О динамике высвобождения ЭАК и ЭК в окружающую среду судили по их активности в трех последовательных экстрактах одних и тех же эритроцитов крысы. Время одной экстракции. I ч, инкубационный раствор - среда 199. Перед каждой повторной экстракцией клетки отмывались средой 199. Активность препаратов оценивалась авторадио графически; в культурах клеток эмбриональной печени мышей.
Оказалось, что ЭАК и ЭК выходят в инкубационную среду на протяжении всего времени исследования, на с разной интенсивностью. Наиболее активны препараты в первых двух экстрактах (табл.10). В третьем экстракте активность ЭАК все еще высока и составляет 15,89$ (р 0,01) от контроля, тогда как активность ингибитора уже значительно снижена: он уменьшает включение метки в эритробласты всего на 6,4%; р 0,05 (табл.10).
Определение активности антикейлона на постгипоксических полицитемических мышах
Известно, что- введение ЭП полицитемическим мышам на 3-й и 4-е сутки после прекращения действия гипоксической гипоксии вызывает специфическую ретикулоцитарную: реакцию в периферической крови через 72 ч после второго введения (Н.А.Федоров, М.Г»Кахетедидзе, 1973)» Действительно, число ретикулоцитов под влиянием ЭП (0,5 ед стандарта С на мышь, n = 5) возрастало в наших исследованиях с (0,8 0,36) %о в контрольной группе до (20,0 4,33) %& (р 0,001).
Введение ЭАК (І доза на I г массы) постгипоксическим полицитемическим мышам по схеме, предложенной для тестирования ЭП не привело к изменению числа ретикулоцитов и некоторых других показателей крови (эритроциты, гематокрит) через 24, 48 и 72 ч после второго введения (табл.17).
В качестве контроля служили мыши с введенным физиологическим раствором.
Полученные результаты позволяют предполагать, что ЭАК, в отличие от ЭП, не оказывает влияния на ЭЧК.Вероятно, точкой приложения его действия служат более зрелые клетки эритроиднога ряда: про/- и эритробласты.