Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОВШЫ. Сап и мелиовдоз - тяжелые инфекционные заболевания человека и животных с прогрессирующим течением и высокой летальностью, чаще всего протекающие в виде пневмоний и септикопиемий.
На территории России случаи заболеваемости сапом и мелиои-дозом в настоящее время не регистрируются. Однако, в связи с развитием межгосударственных экономических и политических связей существует потенциальная угроза завоза мелиоидозной инфекции из эндемичных районов юго-восточной Азии, северных провинций Австралии, Африки, Центральной Америки. Единичные случаи заболевания сапом животных и людей, регистририруемые в странах Центральной Азии, Латинской Америки, также могут явиться причиной распространения этого заболевания в другие регионы. Научные изыскания по сапу и мелтоидозу проводятся сотрудниками Волгоградского противочумного института как раздел федеральной целевой программы по охране территории Российской Федерации от завоза и распространения особо опасных инфекционных заболеваний людей, животных и растений, а также токсических веществ.
Возбудители сапа и мелиоидоза (P.mallei и P.pseudomallel) являются бактериями II группы патогенности и требуют к себе пристального внимания специалистов службы санитарно-эпидемиологического надзора и здравоохранения. Своевременная этиологическая диагностика клинических случаев заболеваний сапом и ме-лшидозом, а также обнаружение и идентификация указанных возбудителей с неизвестным патогенным потенциалом в пробах из различных объектов предусматривают использование, наряду с традиционным бактериологическим методом исследования, современных высокочувствительных методов иммуноанализа.
Основными лабораторными диагностическими приемами, обеспечивающими быстрое и достоверное обнаружение P.mallei и P.pseudomallel в пробах из объектов внешней среды, в клиническом и секционном материале, являются метод флуоресцирующих антител (MSA) и реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) ( Ширяев Д.Т. и др.,1976. Рыбкин B.C. и др.,1982). Для выявления и иденткфи-
кации патогенных псевдомонад разработаны также высокочувствительные методы: твердофазный иммуноферментный метод (ТШО, радиоиммунный анализ, хемилшинесцевтный иммуноаналиа (Яковлев А. Т. и др.,1991, Манолов Д.Д. и др.,1994, Коваленко А.А. и Др.,1990).
Диагностические препараты для экспресс-методов (fcffiA и РИГА) до недавнего времени изготавливали на основе поликло-нальных иммуноглобулинов специфических сывороток различных видов животных. Технологические особенности производства таких препаратов осложняют получение стандартных по свойствам диагностических средств. Кроме того, установлено, что создание ви-доспецифических препаратов на поликлональной основе представляет определенные трудности ввиду близкого антигенного родства возбудителей сапа и мелиоидоза (Алексеев В.В. и др.,1984).
Развитие новейшей технологии получения специфических МКА (Kochler 6., Milsteln С.,1975) расширило возможности иммунодиагностики инфекционных заболеваний, в том числе сапа и мелиоидоза.
Принципиально новый подход к усовершенствованию диагностических средств был.успешно реализован в ВолгНИПЧИ Н.П.Храповоі с соавт.(1989). Авторами были использованы сапные моноклональ-ные антитела (МКА) в качестве основы специфических лшияесци-рующих иммуноглобулинов для ША. иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сапные моноклональкые сухие по показателя! активности и специфичности превосходили поликлональный аналої в отношении бактерий сапа и были включены в перечень кошер ческих диагностических средств, рекомендуемых для применена на этапе обнаружения возбудителя сапа в различных объекта исследования. .
Наряду с эффективным использованием МКА в производстве ди агностических препаратов весьма перспективно применение неме ченых МКА в качестве ингредиентов серологических реакций (ре акции иммунодиффузии (РИД) и реакции агглютинации (РА) для по иска антигенов патогенных псевдомонад. Исследования , прове денные Яковлевой И.В. с соавт.(І994), показали возможное! применения ЫКА в РИД, а также для конструирования' иммунофер ментных тест-систем.
Настоящая работа посвящена получении коллекции гибридом- продуцентов разнообразных сапных и мелиоидозных МКА, включает в себя новые подходы к целенаправленному отбору монокло-нальных иммуноглобулинов, пригодньк для их использования в различных серологических методах.
Замена традиционного поликлонального сырья на МКА при изготовлении табельных иымунодиагностических средств для выявления патогенных псевдомонад, возможность получения видоспецифи-ческих сапных и мелиоидозных антител, взаимодействующих с антигенными детерминантами одного из видов бактерий, являются определяющими факторами в решении такой актуальной проблемы, как своевременное обнаружение и идентификация возбудителей сапа и медиоидоза.
Цель работа заключалась в получении коллекции гибри-дом-продуцентов МКА к антигенным детерминантам воабудителей сапа и мелиовдоза и оценке эффективности использования МКА в качестве ингредиентов серологических реакций и основы иммунодиагностических препаратов для индикации и идентификации патогенных псевдомонад.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оптимизировать технологию получения гибридом, стабильно продуцирующих антитела, создать коллекцию гибридом-продуцентов моноклональных иммуноглобулинов, "узнающих" эпитопы возбудителей сапа и мелиоидоза;
-
изучить свойства МКА различных типов в традиционных серологических методах (ШМ.МФА.РНГА.РИД.РА), произвести отбор типов МКА для последующего их использования в каждом методе;
-
оценить стабильность роста и антителопродукции гибридом при их культивировании in vivo и in vitro;
-
произвести эпитопный анализ антигенных детерминант P.mallel и P.pseudomallei, выявляемых МКА, с помощью конкурентного ШШ;
-
разработать технологию изготовления иммунодиагностических препаратов на основе моноклональных иммуноглобулинов для обнаружения и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью РИГА и МФА, оценить параметры качества препаратов (ак-
тивность, чувствительность, специфі»чность) и сравнить их свойства с коммерческими иммунодиагностическими средствами;
-
оценить эффективность использования МКА в РИД и РА на этапе идентификации чистых культур P.mallei и P.pseudomallel;
-
разработать иммуноферментную тест-систему с МКА для обнаружения антигенов возбудителей сапа и мелиовдоза.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате выполнения работы был создан уникальный набор МКА различной зпитопной направленности в отношении детерминант диагностически 'значимых биополимеров возбудителя мелиовдоза и сапа. Установлено, что использование серологических реакций с МКА, выявляющих консервативные антигенные детерминанты, зкспрессированные с высокой плотностью на термостабильных компонентах антигенов, повышают эффективность исследований по обнаружению и идентификации возбудителей сапа и мелиовдоза.
Оптимизированы условия получения гибридом-продуцентов сапных и мелиоидозных МКА: разработаны рациональные схемы иммунизации животных с использованием внутриселегеночной бустирующей инъекции антигена, позволяющие увеличить эффективность гибридизации до 622, а также осуществлен отбор гибридом, стабильно продуцирующих МКА заданной специфичности.
Представлены доказательства того, что иммуноглобулиновые препараты нового типа по показателям активности и чувствительности не уступают коммерческим поликлональным препаратам (сапному иммуноглобулиновому эритроцитарному диагностикуму и мели-оидозным видоспецифическим и группоспецифическим ЛИГ).
Разработаны новые способы выделения АГ6 и АГ8 возбудителей сапа и мелиовдоза методом аффинной хроматографии на колонках с моноклональным иммуносорбентом.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИЮСГЬ: Получена коллекция гибридных клеточных культур, продуцирующих МКА к поверхностным и растворимым антигенам P.mallei и P.pseudomallel. Штаммы гибридных культивируемых клеток MVd-2(lF4), GVd-3(2G8), MVd-4(2A6) депонированы в специализированной коллекции клеточных культур института цитологии Российской АН (г.Санкт-Петербург), с присвоением регистрационных номеров ВСКК(П) 648Д, 650Д, 649Д.
-V-
Разработаны и испытаны моноклональкые флуоресцирующие препараты для М5А и иммуноглобудиновый эритроцитарный диагности-кум на основе МКА для РИГА. Определена эффективность их применения в соответствующем методе.
Установлена эффективность применения РИД и РА с МКА на этапе идентификации чистых культур P.mallei и P.pseudomallei.
Разработана иммукоферментная тест- система на основе МКА (2А6), предназначенная для выявления АГ8 P.pseudomallei и P.mallei в различных объектах исследования.
На полученные иммуноглобулиновые препараты оформлены:
-
"Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных видоспецифических моноклональных мышиных сухих" и "Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных видоспецифических моноклональных мышиных сухих", которые одобрены ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол N 10) 25.09.96г. и утверждены зам.директора по научной работе А.В.Липницким;
-
"Инструкция по изготовлению и контролю иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных общих моноклональных мышиных сухих" и "Инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных обеих моноклональных мышиных сухих", которые одобрены ученым советом ВолгНйПЧИ (протокол N 10) 25.09.96г.и утверждены зам.директора по научной работе А.В.Липницким;
-
"Инструкция по изготовлению и контролю диагностикума зритроцитарного иммуноглобулиновогс сапного моноклонального сухого" и "Инструкция по применению диагностикума эритрсцитлр-ного иммуяоглобулинового сапного моноклонального сухого", которые одобрены ученым советом ВолгНИПЧИ (протокол N 12) 21.12.95г. и утверждены директором ВолгНИПЧИ Н.Г.Тихоновым;
Испытания новых диагностических препаратов на основе МКА для МФА к РИГА проведены на базе ВолгНИПЧИ в мае 1996г. Налажено экспериментальное мелкосерийное производство иммуноглобу-линового сапкого моноклонального зритроцитарного диагностикума и иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих мелиоидозных видоспецифических и общих моноклональных.
Методические приемы по обнаружению возбудителей сапа и ме-лиовдоза с помощью МКА в серологических методах используются при проведении научных исследований в лабораториях иммунодиаг-
ностики и биотехнологии, иммунохимии, экспериментальной биохимии ВолгНИПЧИ.
-
Доказательства целесообразности использования сапных и мелиоидозных МКА к термостабильнш антигенным детерминантам P.mallei и P.pseudomallei в качестве ингредиентов серологических реакций (РА и РИД), а также основы при изготовлении диагностических препаратов (зритроцитарного диагностикума, ЛИГ, ЛПК).
-
Новые данные о более высокой эффективности сапных и мелиоидозных МКА в серологических исследованиях, направленных на выявление и идентификацию возбудителей сапа и мелиоидоза.
-
Новые иммунодиагностические препараты: диагностикум эритроцитарный иммуноглобулиновый сапной моноклональный , иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие мелиоидозные ви-доспецифические и общие моноклонадьные мышиные.
-
Доказательства параметров качества (активность, специфичность, чувствительность) моноклональных иммунодиагностичес-ких препаратов, не уступающих соответствующим коммерческим по-ликлональным препаратам для РИГА и MSA.
-
Сведения о способности разработанной на основе МКА им-муноферментной тест-системы обеспечивать обнаружение минимальных ( 0,5-5 нг/мл белка по Лоури, 0,37-3,7 нг/мл ПС антроновым методом) концентраций АГ8, одного из основных факторов пато-генности P.mallei и P.pseudomallei.
Материалы, изложенные в диссертации, обсуждены на Всероссийской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград,1992); юбилейной конференции, посвященной 25-летию со дня основания НИИ военной медицины "Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава вооруженнх сил" (Санкт-Петербург,1994); научной конференции, посвященной 25-летию ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995); международной научной конференции, посвященной 150-дети» со дня рождения И.И.Мечникова "Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания" (Харьков, 1995).
-9'
ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЇІССХЕДОВАННЯ:
Основные положения диссертации отражены в 14 печатных работах, в том числе в 2 патентах на изобретение.
СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИЯ: диссертация изложена на 182 страницах, иллюстрирована 4 рисунками и 27 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов.
Библиографический указатель включает 75 отечественных и 109 зарубежных источников.
агамии микроорганизмов. В работе были использованы 61 штамм возбудителя мелиоидоза (P.pseudomallel), 16 штаммов возбудителя сапа (P.mallei), 20 штаммов P.aeruginosa, P.cepacia, P.fluorescens, P.putida, 17 штаммов 14 видов представителей семейств Enterobacteriaceae и Vibrionaceae. Все культуры микроорганизмов получены из лаборатории поддержания живых культур ВолгНИПЧИ. На всех этапах исследований в качестве референтных использовали штаммы P.mallei 10230 и P.pseudomallel 56830 с типичными культурально-морфологическими, тинкториальными, биохимическими и антигенными свойствами.
Клеточные линия. При воспроизведении гибридсмной технологии в качестве опухолевого партнера использована мышиная мие-ломная клеточная линия P3-X63/Ag.653, полученная из Института цитологии Российской АН (г.Санкт-Петербург).
Лабораторний животные. При выполнении различных этапов работы использованы инбредные мыши BALB/c, аутбредные белые мыши, золотистые хомячки, кролики породы шинвилла, морские свинки.
Антигены. В качестве антигенов применяли: 1) взвеси клеток возбудителей сапа и мелиоидоза, обеззараженные физическими и химическими методами стерилизации (ацетоном, 4Х нейтральным формалином, автоклавированием при 120 С); 2) ультразвуковые дезинтеграты клеток бактерий; 3) водно-солевые экстракты ; 4) зкстрацеллшярный антиген; 5) аффинно очищенные с помошью мо-ноклональных иммуносорбентов фракции антигенных комплексов б (АГб) и 8 (АГ8), выделенные из штаммов P.pseudomallel 563Э0,
56576, 100 и P-mallei 10230. Для обозначения антигенных комп-лексов использована классификация антигенов P.pseudomallei, предложенная Н.Н.Пивнем и Б.И.Илюхиным (1981г). Аффиино очищенный АГб состоял иг 16Х белка, 142 липидов и 70Х полисахаридов, АГа включал 102 белка и 90Х полисахаридов.
Гибрцдозацкн иммунных спленоцитов и мышиной миелоыы проводили на основе "Методических рекомендаций по получению гибри-дом-продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам" (Москва, 1986) с привнесением ряда модификаций на этапах подготовки иммунных спленоцитов к слиянию и подборе компонентов для сред культивирования.
Для выращивания гибридом-ородуцентов МКА использовали среды RPMI-1640 ("Gibco", "Flow") с добавлением ингредиентов, соответствующих каждому этапу данной технологии. Отбор клонов-продуцентов МКА производили по результатам скрининга в ТИ1 и НМФА. Накопление МКА осуществляли in vitro и in vivo в виде трансплантируемых асцитных опухолей в организме мышей BALB/c. Выделение моноклональных иммуноглобулинов осуществляли методом осалдения сульфатом аммония С при 502 насыщения раствора). Концентрацию бедка (МКА) в пробах определяла спектрофотометри-чески. Индивидуальные образцы моноклональных иммуноглобулинов ампулировали и хранили при -20 С.
Специфическую активность всех типов МКА изучали с помощью ЮШ,ТИЗМ,РИД,РА. Оценена гемосеисибилизирующая активность МКА как основы иммуноглобулинового аритроцитарного диагностикума для РИГА.
Изотины МКА определяли с помощью иммуноферментных наборов фирмы "Calbipchem" (США) и "Изотим" (г.Санкт-Петербург).
Конкурентную реакцию пар МКА для определения индекса аддитивности проводили согласно методике, предложенной Friqult В. с соавт.(1983).
Различные типы МКА использовали в качестве ингредиентов серологических реакций (РА, РИД), а также основы при изготовлении иммунодиагносткческих препаратов для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза.
Конызгирование МКА с флуоресцеинизотиацианагом <ШД) осуществляли по методу Sodin? J.W. с соавт.(1986). Очистку конъ-югата от несвязавшегося флуорохрома проводили на колонках с сефадексом Г-25 злюирующим буфером 0.01М ФБР, рН 7,2. В прямом
МВА оценивали рабочее разведение, специфическую активность и специфичность полученных моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов.
Для изготовления диагностикума эритроцитарного иммуногло-булинового сапного моноклонального использовали методику, разработанную для коммерческого иммуноглобулинового сапного по-ликлонального диагностикума ( Кулаков М.Я. и др., 1984). В РИГА определяли показатели чувствительности и специфичности диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сапного на основе МКА.
Экспериментальные серии моноклональных иммунодиагностичес-ких препаратов для экспресс-методов обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза (РНГА, ШО оценивали в экспериментах по выявлению патогенных псевдомонад в пробах из объектов внешней среды и материале от зараженных животных в сравнении с коммерческими поликлональными аналогами.
С помощью TJBM с МКА осуществляли поиск антигена 8 , одного из основных факторов патогенности P.mallei и P.pseudomal-lei, в экстрацеллюлярных фракциях, антигенных смесях и средах культивирования микроорганизмов, используя методику Voller А. с.соавт.(1976). ШІК на основе МКА (2А6) получали по методу Mathiesen L.R. с соавт.(1987). По результатам сэндвич-вариач-та ТЖМ с МКА рассчитывали концентрации антигена 8 по белку (или полисахарида/), выявляемые данным методом в различных образцах исследуемых проб.
Статистяческуи обработку результатов опытов проводили методами вариационной статистики (Ашмаркн И.П., Воробьев А.А.,1962) с использованием статистических программ для микро-ЭВМ "Электроника БЗ-34" и "Электороника МК-56".