Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В организме иммуноглобулины (Ig) функционируют как антитела-рецепторы антигенных субстанций. Они могут выступать в роли гуморальных факторов внутренней среды или компонентов клеточных мембран [Putnam F.W., 1985]. Интерес фундаментальной иммунологии и иммунохимии к исследованию Ig определяется способностью этих молекул распознавать широкий спектр антигенов, обеспечивать высокий уровень специфичности распознавания и трансформировать энергию реакции связывания антигена в сигналы, регулирующие работу физиологических систем организма [Zavodszky P. et al., 1986]. Интерес практической медицины к изучению Ig определяется их ролью в поддержании равновесия между антигенными факторами внешней И внутренней среды, а также участием в формировании и эволюции патологических процессов [Burton, D., 1987]. Понимание роли Ig как одного из ключевых элементов системы гомеостаза определило использование их в медицине в качестве стимулируемых вакцинацией защитных факторов Prines R., 1996], лечебных препаратов [Schumacher К., 1986], индикаторов иммунного статуса и маркеров ряда заболеваний человека [Ling N., 1983]. Поэтому решение многих актуальных задач прикладной и фундаментальной иммунологии немыслимо без применения арсенала средств изоляции, идентификации и анализа молекул Ig человека. В течение последних 10-15 лет за рубежом создан ряд препаратов моноклональных антител (МКАТ) против Ig человека [JefFeris R. et al., 1985, 1992] и налажен их промышленный выпуск [Linscott's Directory, 1992]. Однако, большинство созданных МКАТ против Ig человека принадлежит репертуару иммунного ответа мышей BALB/c, поэтому спектр распознаваемых ими детерминант ограничен иммунодоминантными эпитопами и далеко не исчерпывает разнообразия антигенных маркеров Ig человека. Кроме того, доступ отечественных лабораторий и клиник к этим реагентам весьма ограничен.
ЦЕЛЬ настоящей работы состояла в создании МКАТ, которые
-
распознают типы, изотипы и субизотипы Ig человека,
-
дополняют спектр эпитопов, выявляемых ранее созданными МКАТ,
-
обладают совокупностью свойств, необходимых для конструирования тест-систем детекции и определения концентраций Ig и их фрагментов.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
-
Создать коллекцию миеломных парапротеинов, представляющую разнообразие типов, изотипов и субизотипов Ig человека, и позволяющую устанавливать специфичность получаемых МКАТ.
-
Создать независимый от ростовых факторов эмбриональной сыворотки штамм миеломных клеток-партнеров для гибридизации.
-
Для создания гибридом выбрать в качестве доноров иммунных лимфоцитов мышей инбредной линии с репертуаром иммунного ответа, отличающимся от такового у мышей BALB/c.
-
Получить семейства гибридомных штаммов-продуцентов МКАТ против типов, изотипов и субизотипов Ig человека.
-
Исследовать свойства полученных МКАТ, включая их эпитопную специфичность, антиген-связывающую активность при иммобилизации на твердой фазе и присоединении ферментной метки, а также способность связывать Ig в растворе, в составе иммунных комплексов или при адсорбции на твердой фазе.
-
Исследовать возможности применения полученных МКАТ в качестве компонентов тест-систем детекции или определения количества Ig человека в жидких средах организма.
-
Провести экспертизу специфичности МКАТ и апробацию на клиническом материале лабораторных вариантов тест-систем, основанных на применении полученных реагентов.
Впервые для создания гибридом использован новый штамм культивируемых клеток миеломы мышей, независимый от ростовых факторов эмбри-ональной сыворотки.
Впервые получены семейства МКАТ против Ig человека на основе иммунных лимфоцитов мышей линии SJL/J.
Из полученных МКАТ впервые сформирована панель, обеспечивающая идентификацию и количественное определение свободных к- и X-цепей, Ig к- и Х-типов, основных изотипов (а, у, є, ц) и субизотипов (al, yl, у2, уЗ, у4), а также детекцию антител перечисленных разновидностей.
Впервые исследован профиль антиген-распознающей активности МКАТ против изотип-специфичных эпитопов Ig человека и отобраны реагенты, равномерно связывающие все 4 подкласса IgG.
Получены МКАТ против антигенных маркеров Х-, у2-, у4-, є- и ц-цепей Ig человека, не имеющие аналогов по эпитопной специфичности и (или) серологической активности.
Впервые на основе МКАТ разработаны иммуноферментные тест-системы типирования миеломных парапротеинов.
Применение усовершенствованных приемов гибридомной технологии позволило получить семейства МКАТ, направленных против Ig человека.
В результате отбора по критериям специфичности и серологической активности сформирована панель МКАТ, распознающих консервативные, конформационно-устойчивые антигенные маркеры типов, изотипов и субизотипов Ig человека.
В панель включены МКАТ, сохраняющие антиген-связывающую активность при адсорбции на твердой фазе и присоединении ферментной метки.
Экспрессия эпитопов, распознаваемых МКАТ, сохраняется при формировании иммунных комплексов, что позволяет с помощью иммуносор-бентного метода исследовать изотипические спектры антител, направленных против определенных антигенов или аллергенов.
Комплементарные сочетания меченых и иммобилизованных МКАТ позволяют с помощью двухдетерминантного метода ИФА выявлять и определять концентрации Ig четырех изотипов (IgA, IgG, IgM, IgE) и пяти субизотипов (IgAl, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), а также свободных легких цепей к- и Х-типов.
Апробацией на клиническом материале установлена пригодность полученных МКАТ для диагностики гаммапатий, инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний человека.
АПРОБАЦИЯ МАТЕРИАЛОВ ДИССЕРТАЦИИ. Результаты работы были представлены на национальных и международных конгрессах, конференциях и симпозиумах:
2nd Meeting of European Haematology Association, Paris, 1996; 3rd Annual Congress of British Society of Immunology, Brighton, 1995; "Иммунологический мониторинг патологических состояний и иммунореабилитация", Москва,1995; "Актуальные вопросы гематологии", С.-Петербург, 1995; International conference "Biotechnology, St-Petersburg94", С-Петербург, 1994; XV Intern. Congress of Allergology & Clinical Immunology, Stockholm, 1994; II Congress of International Society of Neuroimmunology, Paestum, Italy, 1993;
"Современные достижения медицинской радиологии." С.-Петербург, 1993; "Нейроиммунология на пороге XXI века", С.-Петербург, 1993; International Conference on Medical Biotechnology, Immunization and AIDS. Leningrad, 1991; International symposium on Allergy and Clinical Immunology. Moscow, 1990; "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва, 1988 и 1990; 2-й Национальный конгресс по аллергологии. София, 1989; "Применение иммуноферментного анализа в медицине", Харьков, 1989;" Актуальные вопросы в биохимической и иммунологической диагностике злокачественных новообразований", Москва, 1989; "Диагностика и лечение лимфом", Всесоюзный симпозиум, Ленинград, 1981.
ПУБЛИКАЦИИ. Материалы диссертации отражены в 47 публикациях, среди которых 4 авторских свидетельства.
МКАТ против IgE используются в ИФА тест-системах, выпускаемых предприятием "Аллерген" (г. Ставрополь) согласно научно-технической документации, утвержденной ГИСК им. Тарасевича. МКАТ против IgM и IgG применяются в тест-системах, подготовленных к промышленному выпуску предприятиями ЦНИИВС им.И.И. Мечникова (Москва), НИИ гриппа РАМН и НИИ вакцин и сывороток (С-Петербург).
Основанные на применении МКАТ тест-системы используются в лабораториях С-Петербургского ГМУ им. И.П.Павлова, неврологической клиники Военно-Медицинской Академии, НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова, НИИ ортопедии и травматологии им. P.P. Вредена, Государственной педиатрической медицинской академии, Клинического центра передовых медицинских технологий (больница № 31), Областной детской клинической больницы (С-Петербург), а также ЦНИИВС им. И. И. Мечникова и Института иммунологии (Москва).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация изложена на.йЭ.6 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав, содержащих обоснование цели и задач работы и описание материалов и методов, семи глав изложения и обсуждения результатов исследования, заключения и выводов. Диссертация содержит 58 рисунков и 29 таблиц. Библиографический указатель включает .6.») источников на русском и.53Рна иностранных языках.