Введение к работе
Актуальность проблемы. Распознавание белковых молекул лежит в основе практически всех биологических процессов. Имитирование их сайтов связывания делает возможным создание новых молекул для использования в биотехнологии, терапии и диагностике. В этом случае белковые конструкции de novo (искусственные белки, сконструированнные под заранее заданную третичную структуру и уникальную топологию, не встречающуюся в природных белках) могут являться неким каркасом, в который можно ввести сайт распознавания природного белка, тем самым открывая подход к созданию новых миметиков и антагонистов природных молекул.
Пептидные препараты, удобные для исследований in vitro, порой невозможно успешно применять в клинической практике, так как пептиды обычно быстро инактивируются в организме благодаря нескольким механизмам, включая гломерулярную фильтрацию в почках, рецепторно-опосредованный эндоцитоз, протеолиз сывороточными протеазами (O'Kelly Р. и соавт., 1985; Rostaing L. и соавт., 1998). Главным механизмом из перечисленных является последний. Учитывая также, что белковые фармакологические препараты разрушаются при введении per os, и поэтому вводятся внутримышечно, подкожно или внутривенно, поддержание терапевтически активной концентрации в кровотоке является важным фактором при клиническом использовании этих препаратов.
Одним из путей преодоления этого препятствия является увеличение молекулярного веса путем ковалентного свазывания с биологически инертной матрицей (Shechter Y. и соавт., 2001). Представляется вполне вероятным, что присоединение активного пептида к белковой молекуле носителя приведет к возникновению иммунного ответа как против носителя, так и против самого пептида. В этом случае новые конструкции, предназначенные для длительного курса лечения, будут инактивироваться и элиминироваться иммунной системой.
Любой новый белковый препарат после экспериментов in vitro, подтверждающих требуемую биологическую активность в отсутствии нежелательных побочных активностей и токсичности, должен рассматриваться в качестве потенциального антигена. Поэтому белковый препарат, который планируется применять парэнтерально в течение длительного курса лечения, должен обладать низкой иммуногенностью, т.к. возникновение иммунного ответа приведет к возникновению тяжелых побочных эффектов у пациента и будет препятствовать проявлению активности препарата. Он не должен иметь перекрестной реакции с собственными белками организма, чтобы не вызывать у пациента аутоиммунные реакции.
Гипотезы, касающиеся иммуногенности искусственных белков, могут быть проверены только экспериментально, так как теоретический анализ возможной антигенности, основанный на поиске Т- и В-эпитопов, встречающихся в последовательностях природных белков, все еще недостадочно точен и в данном случае малоэффективен, поскольку последовательности искусственных белков отличаются от природных по определению.
Цель исследования: Целью настоящей работы является изучение иммуногеннности искусственного белка альбебетина и его трех биологически активных вариантов, а также изучение специфичности и межвидовой вариабельности гуморального иммунного ответа на эти белки.
Задачи исследования:
-
Получить и охарактеризовать мышиные сыворотки и препараты иммуноглобулинов из желтка куриных яиц против альбебетина и его трех биологически активных вариантов, имеющих в своем составе пептидные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека.
-
С применением пиновой технологии синтезировать гексапептиды, перекрывающие последовательность белка с фрагментами интерферона-а2 и инсулина.
-
Определить линейные антигенные детерминанты белковых конструкций методом сорбционного ИФА гексапептидов последовательности белка с фрагментами интерферона-ос2 и инсулина, используя полученные антисыворотки и препараты иммуноглобулинов.
-
Сравнить внутри- и межвидовые антигенные карты, определить иммунодоминантные участки.
-
Определить, как влияет на иммуногенность исследуемых белков присоединенние к альбебетину биологически активных фрагментов.
-
Сопоставить расположение антигенных детерминант с известными структурными элементами исследуемых белков.
Научная новизна и практическая значимость работы.
-
Впервые проведено детальное исследование иммуногенности искусственного белка альбебетина и его производных, несущих биологически активные фрагменты интерферона-а2 и инсулина человека. Получены данные об иммунодоминантных В-эпитопах четырех (альбебетин, альбеферон, альбебетин-инсулин, альбеферон-инсулин) молекул.
-
Впервые показано влияние присоединенных фрагментов интерферона-а2 и инсулина человека на иммуногенность искусственных белков.
-
Впервые проведено сопоставление данных антигенного картирования искусственных белков с их трехмерной структурой. Данные антигенного картирования косвенно свидетельствуют о значительном сходстве пространственной структуры четырех исследуемых белков.
-
Впервые показано, что специфичность иммунного ответа на исследуемые искусственные белки практически не зависит от видовых особенностей иммунной системы.
Полученные данные об иммуногенности и иммунодоминантных В-эпитопах искусственных белков целесообразно учитывать в дальнейшем при создании новых искусственных белковых конструкций.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы бьши представлены на школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), на 7-м Международном конгрессе по аминокислотам и белкам (Вена, Австрия, 2001).
Аппробация диссертации состоялась на заседании коллоквиума лаборатории спектральных методов анализа Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН 30 января 2002 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 94 страницах печатного текста, включая 2 таблицы и 16 рисунков и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение» и «Выводы». Библиография содержит список из 120 источников литературы.