Введение к работе
Актуальность проблемы. Организм человека является саморегулирующейся системой, в которой эндотелий сосудов осуществляет функцию проницаемого барьера между кровью и тканями и, взаимодействуя с клетками крови, способствует их распространению по организму, тем самым поддерживая его гомеостаз (BeilkeM.A., 1989, SpringerT.A., 1992, Springer Т.Д., 1994)). В последнее время опубликованы данные об участии эндоте-лиалышх клеток (ЭК) кровеносных сосудов в проявлениях клеточного и гуморального иммунитета (Mantovani A., Dejana Е.. 1989, Pober J.S., и др. 1990). ЭК функционируют как антигенпредставляющие клетки (АПК), влияют на выработку цитокинов иммунокомпетентными клетками, оказывают воздействие на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами. Под влиянием цитокинов ЭК активируются, вследствие чего меняется выраженность их участия в межклеточных взаимодействиях. Однако, остается неизвестной роль ЭК в функционировании системы интерферона.
Воспалительные поражения сосудов, васкулиты, часто сопровождают целый ряд инфекционных и неинфекционных заболеваний, в том числе и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) (Levy Y.A., 1993). Антигены вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающего СПИД, обнаружены в эндотелии посткапиллярных венул лимфоузлов больных с лимфаденопатичес-ким синдромом (Baroni CD., и др., 1986) и в эндотелии сосудов подсли-зистой ткани биоптатов шейки матки женщин, зараженных ВИЧ (Pomerantz R.J. и др., 1988); ДНК транскрипты ВИЧ-1 идентифицированы методом гибридизации in situ в эндотелии капилляров мозга людей, умерших с признаками энцефалита (Wiley С.А., и др., 1986). Эти немногочисленные сообщения дают возможность предположить инфицирование эндотелия сосудов ВИЧ при СПИДе.
Для заболевания, вызванного ВИЧ-1 расстройство функционирования иммунной системы является основным проявлением патогенеза (Покровский В.В., Сервецкий К.Л, 1988, Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., 1992, Fauci A.S., 1991. Levy Y.A., 1993,). Нарушения выражаются как в виде супрессии (снижение числа Т-хелперов, вследствие чего снижается активность всех Т-хелперзависимых реакций, гибель других иммунокомпетентных клеток), так и активации (гипергаммаглобулинемия, выработка антиклеточных антител) функций иммунной системы. Кроме того, в крови инфицированных ВИЧ-1 людей и больных СПИДом поддерживается на высоком уровне содержа-
ниє цитокинов, в том числе, и интерферонов, которые у здоровых людей обнаруживаются не часто и в небольших количествах (Соловьев В.,Д.. Бектемиров Т.Д., 1989. Dianzani F., 1993).
Известно, что интерфероны (альфа, бета, гамма и омега), белки, продукция которых популяциями клеток может быть индуцирована разными стимулами, всегда рассматривалась как фактор противовирусной защиты (Соловьев В.Д., Бектемиров Т.Д., 1980, Dianzani F., 1993). Одна из его форм - альфа кислотолабильный интерферон (альфа КЛИ) присутствовала в крови больных аутоиммунными и некоторыми вирусными заболеваниями (РгеЫе О.Т. и др.. 1984, Levy Y.A., 1993). Обнаружение альфа КЛИ в крови больных СПИДом, увеличение активности альфа интерферона и его кислотолабильности, являющиеся плохим прогностическим признаком, указывают на развитие порочного круга при этом заболевании.
Вовлечение ЭК в инфицирование ВИЧ при СПИДе может, по-видимому, вызывать как деструктивные поражения самих клеток, так и изменения их функционирования. Цитокины и интерфероны, постоянно присутствующие в крови больных СПИДом, могут изменить выраженность инфекции эндотелия ВИЧ (увеличить, уменьшить) и характер участия ЭК во взаимодействиях с клетками крови и в функционировании иммунной системы.
В связи с этим, представлялось необходимым создание модели инфекции ВИЧ ЭК сосудов человека для изучения роли инфицированных ЭК в функционировании иммунной системы.
Цель работы - оценка роли и механизма участия эндотелия сосудов человека в иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека.
Задачи исследования: 1. Исследовать возможность участия клеток эндотелия сосудов в продукции интерферона в нормальном и инфицированном организме. Изучить способность культуры клеток эндотелия сосудов синтезировать интерферон in vitro и чувствительность этих клеток к действию интерферона.
-
Выявить закономерности взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клетками эндотелия сосудов человека и механизмы передачи инфекции чувствительным культурам.
-
Оценить значение молекул, экспрессированных на поверхности клеток эндотелия сосудов, и антител к ним в инфекции вирусом иммунодефиците человека и передаче инфекции чувствительным культурам.
-
Изучить характер влияния медиаторов клеточного иммунитета и интер-
- з -феронов на инфекцию вирусом иммунодефицита человека клеток эндотелия сосудов и передачу инфекции чувствительным культурам.
-
Разработать способ получения альфа кислотолабильного интерферона и охарактеризовать его свойства.
-
Сравнить закономерности функционирования сети цитокинов на модели нормальных и инфицированных вирусом иммунодефицита человека клеток эндотелия сосудов.
-
Оценить эффективность отечественных иммуномодуляторов в подавлении инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека в культурах клеток эндотелия сосудов и Т-лимфоцитов, и исследовать механизмы этих процессов.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное изучение инфекции ЭК сосудов человека ВИЧ-1 и передачи инфекции Т лимфобластоидной культуре человека, ауто-логичным и гетерологичным лейкоцитам крови.
Разработана модель инфекции эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ЭКПВЧ) ВИЧ-1 и ее трансмиссии Т лимфобластоидной культуре С8166.
Впервые установлено, что ВИЧ-1 вызывает в ЭКПВЧ развитие абортивной инфекции, проявляющейся в обратной транскрипции вирусспецифической РНК и последующем уменьшении ДНК транскриптов вируса. Инфицирование ЭКПВЧ ВИЧ-1 осуществляется через липидный рецептор галактозид церамид.
Передача вирусспецифического материала осуществляется при слиянии донорских и реципиентных клеток без предварительного созревания вирио-нов в ЭКПВЧ.
Впервые охарактеризовано регулирующее влияние моноклональных антител (Мо Ат) к молекулам клеточной адгезии (МКА) и антигенам главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) на инфицирование ЭКПВЧ ВИЧ-1 и передачу инфекции чувствительным культурам.
Впервые показано, что Мо Ат к ІСАМ-1 соединяют в виде моста молекулы ІСАМ-1 на ЭКПВЧ и включенные в состав вирионов. Увеличение адсорбции вируса на клетках с помощью этого механизма приводит к увеличению инфицирования ЭКПВЧ ВИЧ-1.
Показано, что Мо Ат к МКА ингибируют передачу вирусспецифического материала, препятствуя контакту комплементарных молекул, экспрессиро-ванных на поверхности инфицированнных ВИЧ-1 ЭКПВЧ и клеток С8166.
Впервые дана оценка функционирования системы интерферона в ЭКПВЧ нормальных и инфицированных ВИЧ-1. Отмечено, что альфа, бета и омега
- 4 -интерфероны ингибируют инфекцию ЗКПВЧ ВИЧ-1. тогда как гамма интерферон активирует ее.
Впервые показано, что гамма интерферон активирует передачу вирусспецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ чувствительным культурам, увеличивая число слияний донорских и реципиентных клеток.
Разработан метод получения альфа КЛИ. Показано, что кислотолабиль-ность интерферона этого типа связана с содержанием небольшого количества гамма интерферона. Впервые показано активирующее действие альфа КЛИ на инфекцию ВИЧ-1 ЭКПВЧ.
Выявлено активирующее действие ФНО альфа на инфекцию ВИЧ-1 ЭКПВЧ. Механизм действия этого цитокина аналогичен механизму действия гамма интерферона.
Впервые выявлен ингибирующий эффект индуктора интерферона ридостина на инфекцию ЭКПВЧ ВИЧ-1, ее трансмиссию Т лимфобластоидной культуре С8166 и репродукцию вируса в культуре С8166. Механизм действия препарата связан с модуляцией синтеза цитокинов: активацией выработки альфа интерферона и ингибицией продукции ФНО альфа.
Теоретическое^ практическое значение работы. Результаты проведенных исследований позволили получить ряд новых данных, указывающих на значение ЭК сосудов человека в патогенезе инфекции ВИЧ-1.
ЭК сосудов, как резервуар ВИЧ-1, способны передавать вирусспецифи-ческий материал клеткам крови и. тем самым, распространять инфекцию по организму.
Впервые показано антителозависимое усиление инфекции ВИЧ-1. передающееся антителами к молекулам, экспрессированным на поверхности ЭК: МКА и антигенам ГКГ. что указывает на включение аутоиммунитета в патогенез СПИДа.
Впервые зафиксирована активация медиаторами клеточного иммунитета, гамма интефероном и ФНО альфа, передачи вирусспецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ чувствительным культурам (Т лимфоблас-там, лейкоцитам крови). Активации инфекции альфа КЛИ связана с содержанием в нем гамма интерферона, что объясняет прогностически отрицательный показатель нахождения альфа КЛИ в крови больных на поздних стадиях СПИДа.
Ингибирующее влияние иммуномодулятора ридостина на передачу вирусспецифического материала от инфицированных ВИЧ-1 ЭКПВЧ Т-клеткам свидетельствует о возможности использования этого препарата для лечения инфекции ВИЧ-1.
-Разработанную модель инфекции ВИЧ-1 ЭКПВЧ целесообразно использовать для изучения различных аспектов патогенеза как СПИДа, так и инфекционных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудов.
-Предложенная модель является новым подходом к поиску антивирусных, в том числе и анти-ВИЧ. препаратов и изучению механизма их действия.
- Результаты исследования включены в курс лекций на биологическом и медицинском факультетах Римского Университета "La Sapienza".
Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на 8 Международном Конгрессе по химиотерапии (Афины, 1975 г.), 1 всесоюзной конференции "Теоретическая и прикладная иммунология" (Москва, 1982 г.), X Региональном симпозиуме социалистических стран по интерферону (Рига, 1988), Ежегодной конференции Международного общества исследователей интерферона (Япония, Киото, 1988; Италия, Флоренция 1989; Канада, Торонто, 1992), Ежегодной конференции Международного общества исследователей интерферона и цитокинов (Япония, Токио, 1993; Венгрия, Будапешт, 1994; США, Балтимор, 1995). Диссертация апробирована на конференции Отдела интерферонов НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 12 октября 1995 г. (Протокол N б).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работ в отечественных и зарубежных изданиях, получены 2 авторских свидетельства.
Структура и_объем диссертации. Диссертация включает в себя введение, обзор литературы (4 главы), заключение, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждение, обсуждение по работе и выводы. Список литературы состоит из 549 наименований отечественных и зарубежных работ. Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком и 54 таблицами.
Основные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором. Исследования по изучению взаимодействия вируса иммунодефицита человека с клетками эндотелия сосудов выполнены в Институте вирусологии Римского университета "La Sapienza" (директор Института, проф. Ф.Дианзани).