Введение к работе
АКТуаЛЬНОСТЬ Проблемы. Streptococci/» pneumoniae -
пневмококк - является широко распространенным условнопатогенным микроорганизмом, вызывания» различные формы заболеваний у ллдейі острую пневмонию, бронхит, отит, гнойный менингит и др. Благодаря работам отечественных и зарубежных исследователей установлено, что пневмококк является ведущим этиологическим агентом при этих заболеваниях (Вишнякова Л.л.и др., 1981, Катосова Л.К., 1987,
В.Gray, Н.Dillon, 1986, P.Geslin et al., 1994). В ПОСЛЄДНЄЄ
десятилетие наблюдается резкое увеличение удельного веса внтнОиотикоустойчявых штаммов пневмококка (Катосова Л.К., 1990, p.Berche et аі.,і994). в связи с этим актуальной является разработка адекватных методов специфической этиологической диагностики при респираторных заболеваниях,- направленных не своевременное и надежное выявлению пневмококковой инфекции с целью проведения соответствующей терапии.
Для диагностики пневмококковой инфекции используют некоторые методы иммунохішического анализа, т.е. анализа, основанного на взаимодействии антител с антигенами. При бактериологическом обследовании с помощью антисывороткл возможна идентификация пневмококков методом набухания капсулы (E.Lund, j.iiem-ісквеп, 1978), а также методом прямой или непрямой ішмунофлуоресценции (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме этого известен способ идентификации капсульних форм пневмококков и соответствующее антигеноэ с помощью коагглютинации и латекс-агглютинации (P.Olcen, 197Э, M.Lelnonen, 1980). ОДНЭКО ВСЄ ЭТИ
методы основаны на р акции антител только с капсульними полисахаридами пневмококка. Имееются также сведения о методах обнаружения антител к пневмококку, . которые основаны на специфически капсульних полисахаридах, входящих в состав
ПНеВМОКОККОВОЙ ВаКЦИНН (H.Russel at al, 1980). ПрИ ИСПОЛЬЗОВЭШСТ
диагностикумов такого типа не могут быть выявлены бескапсульные (шероховатые) формы пнемококка, которые, по данным ряда авторов, играют значительную роль в патогенезе пневмококковой инфекция (Л.А.Вишнякова и др. 1981). Кроме того, полученные ранее сведения об иг.мунном ответе на капсулыше полисахариды пневмококка свидетельствуют о незначительных серологических сдвигах в ходе инфекции или вакцинации в отношения таких антигенов. Эти данные не позволяют однозначно оценить интенсивности иммунного ответа к пневмококку.
- г -
Капсулыше полисахарида пневмококка, представленные у этого
Микроорганизма 90 СероТИПаыИ (J.HenricKaan, 1993), являются
основой единственной известной иммунохимической классификации этого вида. Усовершенствование методов, идентификации пневмококков по свойствам их капсулы такга остается актуальным. Вместе с тем, в современной отечественной и заруйеншой литературе отсутствуют сведения о разработке систем диагностики, позволяющих охарактеризовать развитие пневмококковой инфекции на разных уровнях взаимодействия макро- и микроорганизма! путей выявления как клзток пневмококка и его антигенов, так и антител к нему. Постоянные поиски взаимосвязи меяду серотипом и вирулентностью штаммов пневмококка до сих пор но дали однозначного ответа, хотя известны некоторые закономерности, связанные с выделением у Сольных наиболее часто встречающихся серогипов пневмококка. В связи с 8тіім актуальной является разработка системы субтитрования по антигенним маркерам, отличным от капсульных антигенов, а такко шнек альтернативной системы типовой или субтиповой классификации пневмококков, позволямцей не только произвести субтитрование известных капсульных форм, но и осуществлять мониторинг за Свскапсулышмн формами этого микроба.
Цель работа - выявление шмунохимически активных белков пневмококка и создание на основе различных антигенов этого микроорганизма диагностических средств, позволяющих осуществлять Еммунохимическую диагностику пневмококковой инфекции.
1. Цровэсти анализ антигенной гетерогенности штаммов
пневмококка, как основы для их видоюй иммунохимической
идентификации. Проанализировать возмокность построения
классификационной схемы на основа вновь выявленных штвммовых
признаков пневмококка.
-
Оценить иммунологические свойства искусственных антигенов, синтезированных по аналогии с природным полисахаридом пневмококка свротипа 3, для использования их в диагностических целях.
-
Разработать адекватные методы иммунохимической диагностики для идентификации бактериальных клзток пневмококка, его антигенов н антител к ним.
4. Разработать метод быстрой диагностика для выявления
ентигенов пневмококки независимо от серотапе.
- а -
5. Определить диагностические возможности Еммунофермонтных систем на основе белковых и полисахаридных антигенов онв?мококка.
На основе сочетания основных иммунохамически ективных белков пневмококка предлокена система субтитрования, позволяющая классифицировать штаммы пневмококка независимо от ил серотипа.
Доказана иммунологическая активность искусственных антигенов, синтезированных химическим путем по аналогии с капсульним полисахаридом пневмококка серотипа 3.
Научно обоснован и разработан способ иммунохкмическол идентификации пневмококков независимо от наличия капсулы, который позволяет одновременно выявлять нетипируемие и оОычше кзпсулькые птвммы.
Установлено, что у пневмококка имеется несколько видов белковых антигенов, к которым происходит выработка антител при шевмококовой инфекции у животных и человека. Динсмика появления антител индивидуальна и может зависить от исходного уровня антител в крови.
Обнарунено. что у взрослы* здоровых людей уровень антител к белковым антигенам пневмокока и его тейхоэвым кислотам в средней выке, чем у здоровых детей и близок к уровни антител у детей сгшевмококкоБой инфекцей.
Предложено использование препаратов белковых антигенов для иммунохимической диагносики ішєвмококобой инфекции и показана возможности системы для определения антител к пневмококку с помощью иммуноферментного анализа.
Разработана универсальная методика приготовления латексних диагностикумов для определения различных антигенов на основе эпоксидировашшх латексов.
Разработанные диагностикумы* дммуноферментная система для определения антител к пневмококку (Фармакопейная статья 42-3SOBC-9I, Производственный регламент № 359-92) набор ПНЕВМО-ТЕСТ для коагглютинзции (Лабораторный регламент утверждай Ученым Советом НИИ ВС І4.ІІ.І99І г.)- внедрены в производство я используются в различных учреждениях Российской Федерации п Республики Украина. Эти технологические решс.гая защищены патентами на "Способ диагностики пневмококковой инфекции" (положительное
решение о выдаче патента от 23.01.92 на заявку н 4937427/14-4161I от I7.05.9I.) и на "Способ приготовления диагностикума для определения антигенов в реакции коагглютинации" ы 1762242.
1. Разработана система иммунохдаической диагностики
пневмококковой инфекции, вклгч8Щ8Я препараты для выявления
векториальных клеток пневмококка или его антигенов и антител к
ним, н поэволяшая выявлять антигены и антитела независимо от
серотипа пневмококка-возбудителя.
-
Белки пневмококка с м.м. 50, 74. 60 и 94 ко являются иммунологически активными, так как антитела к ним образуются у детей и взрослых при возникновении пневмококковой инфекции, 8 также у взрослых здоровых ладей.
-
Полностью искусственный антиген, содержаций олигомеры, идентичные участкам природного полисахарида пневмококка серотипа Э, обладает активностью природного полисахарида и может быть использован для качественной и количественной оценки активности ентительных и антигенных препаратов пневмококка в реакциях, основанных на РПГА и ИФА.
-
К особенностям гуморального иммунологического ответа при пневмококковой инфекции у человека и животных относится возможность различных типов реагирования: постепенного нарастания количества антител, сохранение относительно низких концентраций и сохранение относительно високих концентраций антител. В единичных случаях наблюдается снижение первоначально высокого уровня антител К пневмококку.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации обсуждались на научной конференции отдала нммуиохкмнческой диагностики НИИ ВС, заселении Ученого Совета НИМ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова (Протокол n 5 от 19.05.94), на 16-ой конференции Федерации европейских биохимических обществ (Иосква, 1964), іі-ой Всесоюзной конференции Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Москва. 1988), региональной научной конференции "Актуальные проблемы педиатрии в Сибире и на Дальнем Востоке" (Хабаровск, 1988). хи-ом Всесоюзном съезде детских врачей (Москва, 1988), Всесоюзных конференциях «Современные направления создания медицинских диагвостикумов" (Москва, 1988 и 1990 К
Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1989), Научно-практической конференции "Актуальные вопросы реабилитация больных с патологией органов дыхания" (Барнаул, 1989), xv-om Международном симпозиуме по проблеме детской пульмонологии (Киев, 1969),' xvii-ом Съезде Всесоюзного общества микробиологов и паразитологов им.И.И.Мечникова (Алма-Ата, 1989), 1-ом Всесоюзном иммунологическом Съезда (Дагомыс, 1989), 1-ом Всесоюзном Конгресса по болезням органов дыхания (Киев, 1990), Всесоюзной научной конференции "Проблемы медицинской биотехнологии" (Ленинград, 1990), 6-ом Международном Конгрессе по быстрым методам п автоматизации в микробиологии и иммунологии (Хельсинки, 1990), 14-ом заседании немецкого Общества педиатров- пулыионологоэ (Ганновер, 1992), 7-ш международном Конгрессе по местному Ешунитету (Прага, 1992), xxiv-om ежегодном заседании скандинавского Общества иммунологов (Орхус, 1993), хи-ом Цээдународном симпозиуме по стрептококкам и стрептококковой инфекции (Санкт-Петербург, 1993), 28-ом Всемирном Конгрессе по легким (Майнц, 1994),xv Международном Конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Стокгольм, 1994), Международном симпозиуме "Педиатрическая неделя Голландии" (Роттердам, 1994).
ПУБЛИКАЦИИ Основные пологения диссертационной работы опубликованы в 68 научных работах, из которых 2 - главы в монографіях, 2 - в зарубевных вурналах, 20 - в центральных изданиях, 2 патента.