Введение к работе
Внимание многих исследователей до сих пор сконцентрировано на изучении межклеточных взаимодействий в иммунной системе, которые являются одной из актуальных проблем современной иммунологии (Медуницын Н.В. с соавт., 1980; Петров Р.В. с соавт., 1981; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1991; Козлов И.Г. с соавт., 1995; Маянский А.Н., 1995; Фрейдлин И.С, 1984; 1995; Пальцев М.А., Иванов А.А., 1995; Хаитов P.M., Земсков В.М., 1995; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Липшиц Р.У. с соавт., 1996 и др.). Необходимость тесной кооперации различных популяций иммунокомпетентных клеток при реализации их функций в иммунном ответе стало неопровержимым фактом, доказанным многочисленными фундаментальными исследованиями (Земсков В.М., 1983; Вогралик Н.В., Ковальчук Л.В., 1986; Кульберг А.Я., 1986; Брондз Б.Д., 1987; Мазинг Ю.А., 1991; Завьялов В.П., 1993; Ляшенко В.А., 1994; Воробьев А.А., Медуницын Н.В., 1995; Стефани Д.В., Вельтищев Ю.В., 1996; Ogle James D. et al., 1992; Campebll P.A. et al., 1993 и другие). Однако, вопрос об участии нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза только в последнее время становится предметом для пристального внимания исследователей (Бакуев М.М., 1992; Бережная Н.В., 1988; Чередеев А.Н. с соавт., 1983; 1986; Зурочка А.В., 1991; Пигаревский В.Е., 1992; Долгушин ИИ. и соавт., 1986-1996; Маянский А.Н. с соавт., 1995; Полянская Г.А., Свирежива М.Н., 1993; Goto К. et al., 1984-1988; Ishibashi Y. et al., 1981-1989; Zeman K. et al. 1987-1993 и другие). Вместе с тем, изучение механизмов кооперации этих клеток с иммуноцитами, клетками крови, фибробластами, эндотелиоцитами, медиа-торными системами крови и соединительной ткани может иметь существенное значение в понимании патогенеза острого воспаления, вообще, и заболеваний, возникающих после повреждений тканей, в частности.
Современное понятие травматической болезни трактуется как совокупность местных и общих изменений гомеостаза, обусловленных механической травмой, определяющих жизнедеятельность и адаптивные возможности организма (Дерябин И.И., Насонкин О.С., 1987; Шапошников Ю.Г. с соавт., 1989; Краснов А.Ф. с соавт., 1996 и другие). Тяжесть общего состояния, течение посттравматического периода, возникновение гнойных осложнений, процессы тканевой репарации и окончательный исход травматической болезни во многом зависят от качества и выраженности изменений в гомеостазе, в частности, в его иммунном звене (Александров В.Н., 1989; Долгушин И.И. с соавт., 1989; Ермолович Е.Ю., 1993; Кожевников B.C., 1994; Шилова Н.А., 1995; Donnelly S.C. et al., 1994; Feuerstein G.Z. et al., 1995; Kantorova I. et al., 1995 и другие).
Доказано, что в ответ на тяжелую травму развивается стойкая иммунодепрес-сия, характеризующаяся инволюцией лимфоидной ткани, выраженным Т-иммуноде-фицитом и нарушением функций макрофагов (Долгушин И.И., 1980; Вагнер Е.А. с соавт., 1992; Кожевников B.C., 1994; Шилова Н.А., 1995; Хилько В.А. с соавт., 1994-1995; Barlow Y., 1994; Dibirdik I., 1995 и другие). Наряду с дефектами иммунных
механизмов, развивающихся при травме, в литературе широко представлены в о< новном данные о посттравматическом угнетении эффекторной функции нейтрофилс (Беловолова Т.А., 1992; Ермакова Н.Г., 1991; Котельников Г.П. с соавт., 1996; Мяд< лец ОД. с соавт., 1993; Орлов А.Б. с соавт., 1994; Chiba К. et al., 1989; Childs С. et al 1994 и другие).
Вместе с тем известно, что нейтрофилы являются не только элиминирующим] вспомогательными и эффекторными клетками, выполняющими «команды» лимфе цитов и макрофагов, но и клетками, участвующими в инициации и регуляции имм^ нологических реакций (Зурочка А.В., 1991; Бакуев М.М., 1992; Пигаревский В.Е 1992; Долгушин И.И. и соавт., 1986-1996; Маянский А.Н. с соавт., 1995; Goto К. і al., 1984-1988; Ishibashi Y. et al., 1981-1989; Zeman K. et al. 1987-1993 и другие Значение клеточной кооперации в системе «нейтрофил-иммуноциты», реализуемо посредством секреции регуляторных факторов - «нейтрофилокинов», исследован некоторыми из вышеперечисленных авторов в основном в норме и при инфекциоі ном процессе. Между тем, иммунорегуляторная роль нейтрофилов и их низкомол< кулярных продуктов секреции в процессе развития травматической болезни остаетс не-изученной.
В последние годы обнаружены медиаторы, общие для иммунной и нервно систем (Захарова Л.А., Петров Р.В., 1990; Абрамов В.В., 1991; Михайлова А.А., 199; Pousset F., 1994; Hopkins S.J., 1995 и другие). По мнению Е.М. Sternberg (1989), ря пептидных медиаторов были обозначены как моно- и лимфокины, а не как нейропег тиды, лишь потому, что сначала были открыты в иммунной, а не в нервной системі Работами И.И. Долгушина с соавт. (1989-1996) было показано, что нейтрофилокин: также обладают выраженным нейротропным действием. Это обстоятельство опред< лило необходимость изучения при травматической болезни влияния низкомолекуляї ных продуктов нейтрофилов на нервную систему, роль которой в течении и исхол данного заболевания не вызывает сомнений.
В последнее время доказана значительная роль макрофагов в восстановлени поврежденной ткани. Эти клетки и продукты их секреции участвуют в межклеточны взаимодействиях с фибробластами и другими клетками соединительной ткани, обновлении таких важных ее компонентов, как коллаген и фибрин (Маянский А.Н 1981; Фрейдлин И.С., 1984; Маянский Д.Н. с соавт., 1996; Henson Р., 1993 и другие Основываясь на данных И.И. Долгушина с соавт. (1988) о существовании функцж нальных контактов нейтрофилов с макрофагами, можно думать об опоередоваї ном участии полинуклеарных фагоцитов в регуляции восстановительных процессе поврежденной ткани. При этом, нельзя исключить и прямое влияние нейтрофилов их продуктов на механизмы заживления ран, поскольку эти клетки максимальн накапливаются в зоне тканевой деструкции уже в первые часы после травмы. Одн; ко, эти предположения требуют доказательств.
Кроме того, остается неясным, связано ли состояние секреторной функции неї трофилов с другими звеньями гомеостаза при травматической болезни, нарушени которых определяет течение и исход данной патологии. Именно поэтому, большо практический интерес представляют исследования возможности применения нейтрс
филокинов для коррекции нарушений ряда звеньев гомеостаза организма при травматической болезни. Исследования в этом направлении не проводились.
Из вышеизложенного очевидно, что роль нейтрофилов и продуктов их секреции в патогенезе травматической болезни окончательно не определена. Вместе с тем, ее исследование при данной патологии может позволить разработать новые подходы к диагностике и лечению иммунодефицитного состояния при травматических повреждениях, а также определить возможность коррекции нарушений других звеньев гомеостаза. Эти обстоятельства и определили цель планируемого исследования.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является исследование при травматической болезни роли нейтрофилов и их секреторных продуктов в развитии нарушений иммунного и других звеньев гомеостаза, а также изучение возможности коррекции последнего с помощью нейтрофилокинов.
-
Изучить процессы межклеточной кооперации в системе "нейтрофил-моно-цит" у детей в различные периоды травматической болезни.
-
Исследовать иммунобиологическую активность нейтрофилов и их продуктов секреции у животных с изолированной и множественной механической травмой.
-
Определить связь между состоянием секреторной функции нейтрофилов, с одной стороны, и изменениями иммунологической реактивности, состояния центральной нервной системы, репаративно-пластических процессов и устойчивостью организма к стресс-воздействию, с другой, у животных с экспериментальной травматической болезнью, и тем самым, установить роль и место этих клеток в регуляции гомеостаза при данной патологии.
-
Изучить возможности повышения иммунореактивности травмированного организма, ускорения репаративной регенерации поврежденных тканей, стимуляции двигательно-ориентировочной деятельности и усиления устойчивости животных с тяжелой механической травмой к дополнительному стресс-воздействию с помощью секреторных продуктов активированных нейтрофилов донора.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе впервые установлено, что при иммунодефи-цитном состоянии, возникающем у детей с травматической болезнью, происходит нарушение межклеточного взаимодействия в системе кооперации "нейтрофил-мо-оцит", которое проявляется снижением секреции полинуклеарными фагоцитами низ-номолекулярных факторов, обладающих выраженным иммунобиостимулирующим действием. Выявлены четыре типа состояния секреторной функции нейтрофилов: нормальное, компенсированное, субкомпенсированное и декомпенсированное. Нормальный и субкомпенсированный типы межклеточного взаимодействия в системе "секреторные продукты нейтрофилов + моноциты" in vitro характеризуются стимулирующим, а суб- и декомпенсированный - супрессорным действием супернатантов активированных нейтрофилов детей с травмой на клетки-мишени. Последние два типа состояния иммунорегуляторной функции нейтрофилов наиболее часто встречаются при множественной, сочетанной и осложненной гнойной инфекцией травме, а также в ранние периоды травматической болезни. Введение супернатантов нейтрофилов, полученных у детей в острый период и в катаболическую фазу периода развернутой
клинической картины травматической болезни, вызывает у интактных животных нарушения иммунореактивности, поведенческих реакций и снижение репаративнои регенерации, подобные тем, которые отмечаются у мышей с тяжелой механической травмой.
Множественные переломы костей скелета у животных приводят не только к резкому снижению иммунной защиты, психомоторной активности, репарационно-пластических процессов, устойчивости к дополнительному стресс-воздействию, но и к подавлению способности нейтрофилов секретировать иммуностимулирующие пеп-тидсодержащие продукты. При этом, между нарушением секреторной активности нейтрофилов и изменениями вышеуказанных звеньев структурного гомеостаза определяется тесная взаимосвязь, свидетельствующая о важной роли данного функционального дефекта нейтрофилов в развитии расстройства постоянства внутренней среды организма при травматической болезни.
Впервые показано, что введение супернатантов активированных латексом нейтрофилов доноров восстанавливает иммунологическую реактивность у мышей с тяжелой экспериментальной травмой, ускоряет репарацию поврежденной ткани и оказывает стимулирующее действие на нервную систему.
Из супернатантов активированных нейтрофилов здоровых людей было получено и очищено ранее неизвестное вещество пептидной природы С ЖІ2-КОНЦЄВОЙ аминокислотой - лейцином, ММ. около 1500 Д, которое обладало выраженным иммуностимулирующим, нейротропным, репарантным и протекторным действием. Новизна этого вещества была подтверждена авторскими свидетельствами (А.с. № № 1536977, 2008006, 2008683).
Введение вышеуказанного вещества животным с множественными переломами костей позволяет восстановить их иммунологическую реактивность, ускорить процессы заживления ран и костной консолидации, повысить двигательно-ориентиро-вочные реакции, устойчивость организма к дополнительному стрессу и почти в 2 раза снизить летальность. Полученные данные открывают перспективу для создания нового лекарственного препарата, обладающего широким спектром биорегуляторного действия.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Результатами настоящего исследования показано, что нейтрофилы занимают важное место в системе регуляции межсистемных взаимодействий, обеспечивающих сохранность постоянства внутренней среды организма в экстремальных условиях. Регуляторную функцию нейтрофилы могут осуществлять посредством секреции низкомолекулярных (менее 10 кД) пептидсодержащих факторов, которые оказывают модулирующее влияние на систему иммунокомпетентных клеток и органов, центральную нервную систему, процессы репарационной регенерации и устойчивость организма к стрессу. Нарушение секреции данных факторов (нейтрофилокинов) является одной из причин вторичного посттравматического иммунодефицита. Экспериментально доказано, что коррекция нарушения данной функции нейтрофилов путем восполнения дефицита секре-тируемых ими иммунобиостимулирующих факторов веществом, полученным из А5-
пептидсодержащей фракции супернатантов активированных нейтрофилов доноров, существенно улучшает исход посттравматического процесса.
Все это расширяет представление о нейтрофилах, как об одной из центральных клеточных популяций, участвующих в поддержании гомеостаза организма при травматической болезни.
Исследование секреторной функции нейтрофилов и воспринимающей способности моноцитов к нейтрофилокинам у детей с травматической болезнью в комплексе с другими методами оценки иммунного статуса позволяет диагностировать развитие у них иммунодефицитного состояния. Разработанные методические подходы к оценке процессов кооперации "нейтрофил-иммуноциты" подробно изложены в методических рекомендациях "Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме и патологии", опубликованных на всероссийском уровне, и используются для диагностики не только хирургической, но инфекционной и аллергологической патологии. Челябинским медицинским институтом принято и внедрено в практику рационализаторское предложение № 2 от 19 января 1989 года "Способ исследования секреторной функции нейтрофилов".
На базе кафедры детской хирургии Челябинской государственной медицинской академии создана лаборатория по исследованию регуляторной функции нейтрофилов, в которой обследуются дети с различной хирургической патологией (травма, хирургическая инфекция), и в настоящее время на основе полученных результатов разрабатываются методы прогнозирования течения посттравматического и послеоперационного периода у детей.
Метод исследования иммунорегулирующей функции нейтрофилов внедрен не только в Челябинской государственной медицинской академии, детских хирургических отделениях Челябинской областной клинической больницы, но и в Челябинской дорожной больнице, Челябинском областном кожно-венерологйческом диспансере, а также в клинико-иммунологическом центре Тюменской медицинской академии.
Для сокращения времени и трудоемкости исследования секреторной функции нейтрофилов был разработан способ определения иммуномодулирующей активности нейтрофилов, основанный на определении цветности супернатантов данных клеток. Данный способ был защищен авторским свидетельством № 1287006.
Разработана технология получения из супернатантов нейтрофилов вещества с выраженными биорегуляторными свойствами, которая защищена авторским свидетельством № 1536977 "Способ получения иммуностимулирующих нейтрофилоки-нов". На вещество, выделенное этим способом, получены два патента на изобретение: № 2008006 "Средство, обладающее репаративной активностью" и № 2008683 "Психотропное средство".
И, наконец, результаты исследований используются при преподавании патогенеза травматической болезни как в лекционном материале, так и на практических занятиях со студентами Челябинской государственной медицинской академии.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научной конференции "Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии" (Краснодар, 1983); Всесоюзном симпо-
зиуме "Фагоцитоз и иммунитет" (Москва, 1983); Всесоюзных конференциях "Про филактика, диагностика и лечение аутоиммунных заболеваний и вторичных иммуно дефицитов" (Новосибирск, 1985); "Актуальные вопросы клинической микробиологи! в неинфекционной клинике" (Москва, 1988); "Стресс и иммунитет" (Ростов-на-Дону Ленинград, 1989); 1 конгрессе иммунологов Эстонии (Тарту, 1989); 1 Всесоюзної* иммунологическом съезде (Москва-Дагомыс, 1989); 7 Международном конгрессе п< иммунологии (Западный Берлин, 1989); 5 Всесоюзном симпозиуме "Взаимодействи нервной и иммунной систем" (Оренбург, 1990); Всесоюзной конференции "Экологи ческие аспекты иммунопатологических состояний" (Алма-Ата, 1990); на Междуна родном симпозиуме "Мононуклеарная фагоцитирующая система в норме и патоло гии" (Новосибирск, 1990); I Республиканском съезде детских хирургов Башкири: (Уфа, 1992); I Международном конгрессе по иммунореабилитации (Москва-Дагомыс 1994); зональных конференциях "Факторы гуморального и клеточного иммунитет; при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск, 1990 1992, 1994); I Российском конгрессе по патофизиологии (1996), на совместных сове щаниях кафедр микробиологии, иммунологии и детской хирургии Челябинской госу дарственной медицинской академии, а также на заседании Челябинского городской научно-практического общества ортопедов-травматологов.
По теме диссертации опубликованы 54 научных работы, получены 4 авторски: свидетельства, оформлено и внедрено рационализаторское предложение и изданы ме тодические рекомендации.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 325 стра ницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, материалов и мєтодое четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библио графического указателя, включающего 187 работ отечественных и 201 работу иност ранных авторов. Работа иллюстрирована 45 таблицами, 42 рисунками и 5 фотогра фиями.