Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Влияние семенной плазмы полового партнера на репродуктивную функцию женщин при проведении программы экстракорпорального оплодотворенеия (обзор литературы) 13
1.1 Факторы, оказывающие влияние на эффективность вспомогательных репродуктивных технологий 13
1.2 Влияние семенной плазмы на репродуктивную функцию женщины
1.2.1 Влияние семенной плазмы на экспрессию цитокинов в женском репродуктивном тракте .20
1.2.2 Влияние семенной плазмы на верхние отделы женских половых путей 23
1.2.3 Влияние семенной плазмы на процессы ангиогенеза .27
1.3 Роль семенной плазмы в формировании иммунной
толерантности 29
1.3.1 Основные иммунные факторы семенной плазмы 30
1.3.2 Влияние семенной плазмы на содержание Т-регуляторных клеток в женском репродуктивном тракте и их функциональную активность 36
1.4 Влияние аппликации СП на исходы программы ВРТ .39
Глава 2. Материал и методы исследования 47
2.1 Материал исследования 47
2.2 Методы исследования
2.2.1 Общеклинические методы исследования 51
2.2.2 Гормональное исследование .52
2.2.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза .53
2.2.4 Спермиологическое исследование эякулята .53
2.3 Программа ЭКО 55
2.4 Специальные методы исследования
2.4.1 Оценка иммунного статуса 57
2.4.2 Оценка цитокинового профиля семенной плазмы 58
2.5 Статистический анализ полученных данных 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 61
3.1 Клиническая характеристика супружеских пар, включенных в исследование 61
3.2 Результаты клинико-лабораторного обследования 69
3.2.1 Характеристика функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы 69
3.2.2 Характеристика спермиологического исследования эякулята супругов исследуемых пациенток 70
3.3 Характеристика циклов ЭКО и ПЭ 71
3.3.1 Характеристика протоколов стимуляции в программе ЭКО в исследуемых группах женщин 71
3.3.2 Характеристика процессов фолликулогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза 72
3.3.3 Клиническая характеристика пациенток во время проведения программы ЭКО 75
3.4 Сравнительный анализ исходов программы ЭКО у обследованных женщин 75
3.5 Зависимость исходов ВРТ от концентрации цитокинов в семенной плазме партнера 76
3.5.1 Зависимость исходов ВРТ от концентрации TGF-pi в семенной плазме партнера 77
3.5.2 Зависимость между концентрацией IL-18 в семенной плазме партнера и исходами ВРТ 79
3.5.3 Зависимость между содержанием цитокинов ТГФ-рі и IL-18 во всем объеме СП, полученном при эякуляции, и исходами программы ЭКО/ИКСИ 80
3.5.4 Корреляционный анализ зависимости содержания цитокинов TGF-1 и IL-18 в эякуляте 82
3.6 Диагностическая значимость оценки содержания TGF-1 и IL-18
в семенной плазме полового партнера при прогнозировании исходов ВРТ 83
3.6.1 Результаты ROC – анализа 83
3.6.2 Результаты CART – анализа .85
3.7 Влияние введения семенной плазмы в репродуктивный тракт женщин при проведении ЭКО/ИКСИ на состояние клеточного звена иммунитета 88
3.7.1. Зависимость эффективности программы ЭКО от состояния клеточного звена иммунитета пациенток в день проведения ТВП и ПЭ 89
3.7.2. Зависимость состояния клеточного звена иммунитета пациенток в день проведения ТВП и ПЭ от цитокинового профиля СП 92
Глава 4. Обсуждение собственных результатов .96
Выводы .112
Практические рекомендации .114
Список сокращений .115
Список литературы
- Влияние семенной плазмы на процессы ангиогенеза
- Гормональное исследование
- Характеристика функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы
- Зависимость эффективности программы ЭКО от состояния клеточного звена иммунитета пациенток в день проведения ТВП и ПЭ
Введение к работе
Актуальность темы исследования В настоящее время одним из основных и наиболее эффективных методов лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). Несмотря на усовершенствование эмбрионального этапа программы ЭКО, позволяющего выбрать для переноса в полость матки эмбрионы высокого качества, результативность ЭКО остается достаточно низкой (В.С. Корсак с соавт., 2015; M. Kupka et al., 2014). При этом невысокая эффективность программ ЭКО связана, в основном, не с нарушением взаимодействия гамет, а с потерями на этапе имплантации эмбриона (R. Edwards, 2006).
Полноценная имплантация и последующее развитие плода
обеспечиваются за счет динамического равновесия экспрессии разных генов
в эндометрии под контролем не только стероидных гормонов, но и
различных биологически активных молекул, в том числе и иммунных
факторов (C. Boomsma et al., 2009). Присутствие в семенной плазме (СП)
широкого спектра иммуномодулирующих молекул придает ей уникальные
свойства и свидетельствует о потенциальной роли СП в регуляции
репродуктивной функции (S. Robertson et al., 2016). В многочисленных
экспериментах продемонстрировано, что содержащиеся в СП биологически
активные молекулы участвуют в формировании оптимального
иммунологического фона, необходимого для успешной имплантации и обеспечения иммунной толерантности матери к отцовским антигенам (S. Robertson et al., 2013). Особенностью программы ЭКО, в отличие от естественного цикла зачатия, является отсутствие контакта с СП. В связи с этим патогенетически обоснованным методом стимуляции женского репродуктивного тракта является применение СП полового партнера.
В зарубежных исследованиях неоднократно предпринимались попытки использовать введение СП в женские половые пути при проведении
4 программы ЭКО с целью повышения эффективности лечения. Однако
имеющиеся на сегодняшний день данные о влиянии аппликации СП в день
трансвагинальной пункции яичников (ТВП) на результативность программы
ЭКО носят весьма противоречивый характер. Лишь в единичных работах
обнаружен положительный эффект аппликации СП (R. Chicea et al., 2013; B.
Bellinge et al., 1986; C. Coulam, 1995), в то время как остальные исследования
выявили либо отсутствие эффекта (M. von Wolff et al., 2013), либо
статистически неподтвержденную тенденцию к увеличению частоты
наступления беременности (M. von Wolff et al., 2009; S. Friedler et al., 2013).
Вероятно, что успешность воздействия СП на репродуктивный тракт женщины может определяться содержанием иммунорегуляторных факторов. Изучение роли иммунных факторов СП при имплантации и дальнейшем развитии беременности может явиться основой для разработки новых терапевтических методов, основанных на использовании СП с целью локальной физиологической стимуляции женского репродуктивного тракта при ЭКО и повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.
Наиболее значимой иммунорегуляторной молекулой СП считается
трансформирующий фактор роста 1 (TGF-1). Результаты
экспериментальных исследований подтверждают, что TGF-1 является ключевым фактором формирования иммунной толерантности матери к антигенам плода, влияя на уровень Т-регуляторных клеток (Трег клеток) (S. Robertson et al., 2002; D. Sharkey et al., 2012).
В последнее время появились данные о том, что СП содержит целый ряд цитокинов, избыточное содержание которых может нарушать процессы имплантации и препятствовать развитию беременности. К таким цитокинам можно отнести интерлейкин-18 (IL-18) - провоспалительный цитокин, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к TGF-1 (C. Dinarello et al., 2013). При этом возможность влияния цитокинового
5 профиля СП на эффективность программы ЭКО до сих пор не
рассматривалась.
Механизмы влияния СП на репродуктивную функцию женщин также
остаются неизученными. Предполагается, что СП может играть
принципиальную роль в индукции и поддержании иммунологической
толерантности, обеспечивающей защиту полуаллогенного плода, несущего
чужеродные антигены отца, от отторжения. Основным звеном,
обеспечивающим формирование и поддержку периферической
толерантности к аллоантигенам плода при беременности, являются Трег клетки (S. Robertson et al., 2009). В настоящее время считается, что активная миграция Трег клеток из периферической крови может являться одним из механизмов иммунорегуляции начальных стадий беременности. До сих пор влияние введения СП в репродуктивный тракт женщины на состояние клеточного звена иммунной системы женщины не изучалось.
Цель исследования: оценка влияния иммунорегуляторного потенциала семенной плазмы, используемой для интравагинальной аппликации в день трансвагинальной пункции яичников, на эффективность программы экстракорпорального оплодотворения.
Задачи исследования:
1) представить клинико-анамнестическую характеристику исследуемых
пациенток, а также параметры фолликулогенеза, оогенеза и раннего
эмбриогенеза;
2) оценить влияние интравагинального введения семенной плазмы в
день ТВП при проведении программы ЭКО на частоту наступления
беременности и течение ранних сроков беременности;
3) оценить зависимость частоты наступления беременности при
проведении программы ЭКО от содержания цитокинов TGF-1 и IL-18 в
семенной плазме, вводимой интравагинально в день ТВП;
4) изучить влияние интравагинального введения семенной плазмы в
день ТВП при проведении программы ЭКО на состояние клеточного звена
6 иммунной системы пациенток;
5) оценить прогностическую значимость определения содержания цитокинов TGF-1 и IL-18 в семенной плазме для оценки эффективности программы ЭКО с применением интравагинальной аппликации семенной плазмы.
Научная новизна
Впервые представлено и научно обосновано влияние
иммунорегуляторного потенциала СП полового партнера, поступающей в женский репродуктивный тракт при естественных половых контактах в период проведения программы ЭКО и при интравагинальном введении СП в день ТВП, на реализацию репродуктивной функции женщин при проведении программы ЭКО.
На современном методическом уровне исследована ассоциация между особенностями цитокинового состава СП и исходами программы ЭКО с использованием аппликации СП супруга в день ТВП. Определена прогностическая ценность каждого из изучаемых факторов СП при определении вероятности наступления беременности.
Получены новые данные о влиянии СП, поступающей в репродуктивный тракт женщины, на клеточное звено иммунитета пациенток, в частности на содержание Трег клеток в периферической крови женщин, и проведен анализ изменения содержания Трег клеток в периферической крови на различных этапах программы ЭКО. Установлена зависимость динамических изменений Т-регуляторного звена иммунитета от цитокинового профиля СП, поступающей в репродуктивный тракт женщины. Выявлена ассоциация между уровнем цитокинов в СП и содержанием Трег клеток в периферической крови на различных этапах цикла ЭКО.
7 Практическая значимость
Определены особенности цитокинового профиля СП половых партнеров пациенток, коррелирующие с успешным и неуспешным исходами программы ЭКО с применением аппликации СП в день ТВП.
Выявленные взаимосвязи между исходами программы ЭКО с применением аппликации СП и иммуномодулирующими свойствами СП половых партнеров пациенток свидетельствуют о целесообразности персонифицированного назначения аппликации СП партнера в программе ЭКО/ИКСИ.
Обоснована необходимость проведения количественной оценки уровня цитокинов в СП полового партнера пациентки на этапе подготовки к программе ЭКО. Определённые в работе показатели содержания TGF-1 и IL-18 в СП половых партнеров пациенток с успешными исходами программы ЭКО с применением аппликации СП могут быть использованы для отбора супружеских пар с целью назначения аппликации СП в день ТВП при проведении программы ЭКО.
Оценка процентного содержания Трег клеток в периферической крови в день проведения пункции может быть использована для прогноза наступления беременности, что может явиться одним из подходов к повышению эффективности ЭКО.
Разработан алгоритм применения аппликации СП полового партнера у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий на основании оценки уровня цитокинов в СП.
Положения, выносимые на защиту
1. Эффективность реализации репродуктивной функции женщин в
программе ЭКО с применением аппликации СП в день трансвагинальной
пункции зависит от индивидуальных иммуномодулирующих свойств
семенной плазмы полового партнера. Факторами СП, определяющими
8 вероятность наступления беременности, являются содержание цитокинов IL-18 и TGF-1 и соотношение TGF-1/IL-18.
2. Успешная имплантация при проведении программы ЭКО с
применением аппликации СП в день трансвагинальной пункции происходит
на фоне снижения содержания Т-регуляторных клеток в периферической
крови. Изменения Т-регуляторного звена иммунитета определяются
цитокиновым профилем СП, поступающей в репродуктивный тракт
женщины.
3. Наибольшую значимость для прогнозирования наступления
беременности в программе ЭКО с применением аппликации СП в день ТВП
имеет определение уровня IL-18 во всем объеме СП, полученном при
эякуляции. Благоприятный прогноз программ ВРТ ассоциирован с
относительно низким уровнем IL-18 в СП.
Личный вклад автора
Автор непосредственно участвовал в выборе направления
исследования, разработке цели и постановке задач, в проведении анализа, научном обобщении и статистической обработке полученных результатов. Автор лично принимал участие в сборе биологического материала, в ведении пациенток на всех этапах лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, в анализе и научной интерпретации результатов иммунологического исследования, в подготовке публикаций результатов исследования в отечественных и зарубежных изданиях
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные положения диссертации соответствуют специальности
14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного
исследования соответствуют области исследования специальности,
конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
9 Апробация материалов диссертации
Основные положения диссертации и результаты работы представлены и доложены на XIV Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2013), XVI Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2015), 14-м Международном симпозиуме по иммунологии репродукции (Варна, 2015), 1-ом Калининградском научном иммунологическом форуме (Калининград, 2016). Работа обсуждена на межклинической конференции отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (25.02.2016) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (21.03.2016, протокол № 3).
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанный на основании полученных результатов алгоритм персонифицированного проведения программ ВРТ с применением аппликации семенной плазмы в день ТВП используется в практической деятельности отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени профессора Б.В. Леонова ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 5 статей в рецензируемых научных изданиях и одна статья - в зарубежном журнале (Journal of Reproductive Immunology).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 13 рисунками. Библиографический указатель включает 168 литературных источников, из них 6 работ отечественных и 162 – зарубежных авторов.
Влияние семенной плазмы на процессы ангиогенеза
Бесплодие в браке – одна из наиболее важных современных медико-социальных проблем. Согласно данным эпидемиологических исследований, от 8% до 15% супружеских пар детородного возраста не обладают естественной способностью к рождению ребенка. Отсутствие ребенка в семье приводит к социально-психологическому дискомфорту супругов, конфликтным ситуациям в семье, росту числа разводов и, соответственно, к снижению качества жизни. Актуальность проблемы также обусловлена ухудшающимися показателями репродуктивного здоровья населения и высокой частотой не только бесплодия, но и ранних репродуктивных потерь беременности. В настоящее время эффективное лечение бесплодия невозможно без применения современных методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), которые совершили революцию в борьбе с бесплодием.
Первые исследования, которые положили начало экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО) как самостоятельному направлению репродуктивной медицины, появились даже не в ХХ, а в ХIX столетии [60]. Однако многофакторность процесса оплодотворения не позволила тогда продвинуться дальше. Значительные прорывы в развитии методов ВРТ совершались параллельно с появлением научно-технических разработок и достижений фармакологии. И только в ХХI веке основоположник ЭКО Роберт Эдвардс, спустя более, чем 30 лет после рождения первого ребенка, зачатого при помощи ЭКО, был удостоен Нобелевской премии в области физиологии и медицины с формулировкой «за разработку технологии искусственного оплодотворения». В настоящее время достижения современной репродуктологии позволили добиться появления на свет миллионов долгожданных детей.
За более чем тридцатилетнюю историю развития метода ЭКО происходило дальнейшее совершенствование методов лечения бесплодия, шел поиск путей повышения их эффективности. Однако несмотря на революционные достижения в этой области, результативность циклов ЭКО остается достаточно низкой. По данным ХIX отчета Национального регистра центров ВРТ Российской ассоциации репродукции человека, частота наступления беременности из расчета на перенос эмбрионов в программе ЭКО/ИКСИ составляет 38,5 % / 36,9% [1].
С момента возникновения методов ВРТ внимание исследователей сосредоточено в основном на разработке новых модифицированных схем с целью получения качественных ооцитов, протоколах стимуляции, методах оплодотворения, усовершенствовании эмбриологического этапа. Все это приводит к переносу высококачественных эмбрионов, однако частота наступления беременности не превышает 40% [50, 1].
Изучение завершающего этапа процедуры ЭКО, а именно имплантации эмбриона после его переноса в полость матки, связано с рядом ограничений этического, методического и практического характера. Поэтому существующие данные об имплантации эмбриона человека весьма ограниченны. Доступная информация основана на раздельном изучении эндометрия и бластоцисты на моделях in vitro. Возможно, именно имплантационная способность эндометрия является одним из важных факторов, ограничивающим успех лечения бесплодия [2, 41].
Таким образом, для наступления беременности и ее успешного течения решающее значение имеет не только качество эмбрионов, но и рецептивность (восприимчивость) эндометрия [136]. Поэтому одним из наиболее важных направлений поиска способов повышения эффективности современных методов лечения бесплодия является оптимизация условий имплантации эмбрионов, переносимых в полость матки. В последние годы проводятся многочисленные исследования, направленные на понимание механизмов регуляции имплантации.
Эндометрий женщины репродуктивного возраста представляет собой
многокомпонентную систему, клеточные элементы которой находятся в сложной взаимосвязи, и состоит из базального и функционального слоев. Основными регуляторами морфологических изменений функционального слоя эндометрия в течение менструального цикла и в периимплантационном периоде считаются стероиды, синтезируемые в яичниках [46]. Однако появляется все больше фактов в пользу существования дополнительных паракринных процессов регуляции имплантации, основанных на реципрокных взаимодействиях эмбриона и эндометрия [155].
Нормальное развитие эндометрия и его адекватная структурно-функциональная трансформация в течение менструального цикла – важные условия для успешной имплантации и наступления беременности. Было выявлено, что имплантация бластоцисты возможна только в четко определенный период времени, в течение которого в эндометрии происходят структурные и молекулярные изменения, необходимые для нидации эмбриона [6]. Этот специфический период максимальной восприимчивости эндометрия к сигналам получил название «окно имплантации» [85, 84]. Перенос эмбрионов не будет успешным, если отсутствует синхронизация между стадией развития эмбриона и эндометрием [136]. «Окно имплантации» у человека изучено недостаточно в силу ряда причин, среди которых доминируют технические и этические факторы. В действительности никакая модель in vitro не способна восстановить сложность динамического клеточного взаимодействия, активизирующего эпителиальные, стромальные и иммунокомпетентные клетки, представленные в эндометрии на протяжении «окна имплантации» и необходимые для процесса аппозиции, адгезии и инвазии эмбриона.
Гормональное исследование
С целью исключения влияния на результат различных схем стимуляции в настоящем исследовании применялся стандартный протокол с рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (рФСГ) и антагонистом гонадотропин рилизинг гормона (антГнРГ) [3]. Стимуляция функции яичников проводилась со 2-3 дня менструального цикла. Доза препаратов рФСГ подбиралась индивидуально в соответствии с анамнезом пациентки, ее возрастом, овариальным резервом и уровнем гонадотропных гормонов. Далее при проведении УЗ-мониторинга по мере необходимости проводилась корректировка дозы препарата. С целью предотвращения преждевременного выброса лютеинизирующего гормона (ЛГ) введение антГнРГ начиналось при достижении лидирующими фолликулами диаметра 14-15 мм. Препарат антГнРГ в дозе 0,25 мг/сут вводился подкожно, ежедневно, включая день введения триггера овуляции. С целью финального созревания ооцитов в качестве триггера овуляции использовался препарат человеческого хорионического гонадотропина (ХГЧ) в стандартной дозе 10000 МЕ при достижении несколькими доминантными фолликулами диаметра 17-18 мм.
Трансвагинальная пункция яичников (ТВП) проводилась спустя 36 часов от момента введения триггера овуляции в асептических условиях малой операционной под внутривенной анестезией и ультразвуковым контролем. Спустя 4-5 часов после забора ооцитов проводили оплодотворение полученных ооцитов.
В зависимости от параметров спермы, полученной в день проведения ТВП яичников, использовались два метода оплодотворения – стандартное ЭКО или интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Выбор метода оплодотворения осуществлялся эмбриологом.
Оценку оплодотворения проводили на следующий день после забора ооцитов. Качество эмбрионов оценивалось согласно следующим параметрам: количество бластомеров, степень цитоплазматической фрагментации, наличие нескольких ядер и ранней компактизации.
Эмбрионами наилучшего качества считались эмбрионы, имеющие, по крайней мере, 8 бластомеров на 3-и сутки и менее 10% фрагментации, стандартный размер бластомеров и отсутствие многоядерности.
Качество бластоцисты оценивалось согласно критериям Gardner D.K. и Schoolcraft W.B. Бластоциста, имеющая компактную внутреннюю клеточную массу и хорошо структурированную трофэктодерму, считалась наилучшего качества.
Лучшие эмбрионы переносились в полость матки пациентки посредством мягкого катетера Wallace (Великобритания) на 3 или 5 сутки культивирования in vitro после пункции яичников. Количество переносимых эмбрионов не превышало 2-х и определялось индивидуально, оставшиеся эмбрионы «высшего» качества подвергались криоконсервации на 5-е сутки. Согласно общепринятой схеме ведения посттрансферного периода со дня ТВП всем пациенткам назначался препарат микронизированного прогестерона тремя отдельными дозами (300 мг/сут) или геля в дозе 90 мг/сут с последующим повышением дозировки до 600 мг/сут и 180 мг/сут, соответственно, со дня переноса эмбрионов.
Диагностику беременности осуществляли на основании определения сывороточной концентрации уровня -субъединицы хорионического гонадотропина (-ХГЧ) более 20 МЕ/л на 14-й день после переноса эмбриона, наличие клинической беременности подтверждали визуализацией плодного яйца при вагинальном УЗИ на 21-й день после переноса эмбрионов в полость матки.
Данные этапы дополнялись введением пациенткам основной группы предварительно подготовленной СП супруга в задний свод влагалища после проведения ТВП, проведением исследования образцов спермы, полученной в день трансвагинальной пункции и используемой для оплодотворения. Пациенткам группы сравнения после проведения ТВП вводили изотонический раствор хлорида натрия. Все этапы программы ЭКО проводились в отделении вспомогательных методов лечения ФГБУ «НЦ АГиП им. Кулакова» Минздрава России (руководитель – д.м.н., доцент, Калинина Е.А.).
Дополнительно в день проведения ТВП производили забор крови с целью определения субпопуляционного состава лимфоцитов (Т-лимфоцитов) и сразу передавали в лабораторию клинической иммунологии (заведующий лабораторией - к.м.н. Л.В. Кречетова).
Взятие цельной периферической крови проводили натощак из локтевой вены в вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette объёмом 4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток периферической крови женщин определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител к антигенам CD3, СD4, CD5, CD16, меченных флуоресцеин-изотиоцианатом, и к антигенам CD16, CD19, CD56, меченных фикоэритрином (Beckton Dickinson, США). Для выявления регуляторных Т-клеток использовали моноклональные антитела к поверхностным лимфоцитарным антигенам CD4, меченные флуоресцеин-изотиоцианатом, CD25, меченные модифицированным фикоэритрином (Сy7), и CD127, меченные флуорохромом Alexa Fluor 647. Моноклональные антитела добавляли к цельной крови согласно требованиям производителя, вортексировали, инкубировали 20 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Затем лизировали эритроциты раствором FACS Lysing Solution (Beckton Dickinson, США) в течение 12 минут, пробы пипетировали, центрифугировали в течение 5 минут при оборотах 500g, после чего супернатант удаляли и к осадку добавляли 150 мкл фиксирующего раствора BD CellFIX (Beckton Dickinson, США). Анализ клеток проводили с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCalibur (Beckton Dickinson, США). Лимфоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови, выявляли с помощью моноклональных антител к CD45, меченных перидин-хлорофилл протеином Per-CP (Dako, Дания). В каждой пробе анализировали по 5000 лимфоцитов.
Характеристика функционального состояния гипоталамо гипофизарно-яичниковой системы
Определение уровня TGF-1 в образцах СП партнера, вводимой в задний свод влагалища пациентки в день ТВП, было проведено у 110 женщин основной группы. В зависимости от результатов лечения были сформированы две подгруппы: 1а подгруппа (n=50) - с наступившей беременностью, 1б подгруппа (n=60) - с отрицательным результатом лечения.
По клинико-анамнестическим данным между группами не было выявлено статистически значимой разницы, также как и по количеству полученных и зрелых ооцитов, методу оплодотворения, частоте оплодотворения и среднему количеству перенесенных эмбрионов.
При оценке основных показателей спермограммы половых партнеров пациенток исследуемых подгрупп не было выявлено статистически значимых различий в концентрации, подвижности и числе морфологически патологических форм сперматозоидов.
Концентрация TGF-1 в СП полового партнера у пациенток с наступившей беременностью и женщин с неудачной попыткой ЭКО/ИКСИ составляла 127,5±6,2 нг/мл и 129,7±5,6 нг/мл соответственно (р=0,796). Учитывая, что согласно протоколу исследования, всем пациенткам вводили фиксированный объём 0,5 мл СП партнера, количество введенного TGF-1 соответствовало половине концентрации данного цитокина в СП и составляла 65,9±22,2 нг/мл и 64,8±22,2 нг/мл.
Представленные результаты демонстрируют отсутствие достоверных межгрупповых различий по концентрации TGF-1 в СП и, соответственно, количеству данного цитокина в СП, вводимой интравагинально.
Таким образом, полученные результаты, касающиеся изучения зависимости эффективности программ ВРТ от уровня TGF-1 в СП партнера, вводимой интравагинально в день проведения ТВП, показали отсутствие влияния содержания TGF-1 в СП партнера, используемой для аппликации, на исходы программы ЭКО/ИКСИ.
Полученные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего поиска маркеров, ассоциированных с успешным исходом программы ЭКО с применением аппликации СП в день ТВП. Вероятно, что не только TGF-1, но и другие медиаторы СП могут оказывать влияние на эффективность лечения методом ЭКО/ИКСИ.
СП здоровых фертильных мужчин содержит широкий спектр цитокинов, которые могут обладать разнонаправленным действием [30]. Известно, что провоспалительный цитокин IL-18, обладающий антагонистическими свойствами по отношению к TGF-1, может приводить к нарушению имплантации [30]. Поэтому следующим этапом исследования явилась оценка зависимости исходов ЭКО от концентрации IL-18 в СП половых партнеров пациенток основной группы. Данные о концентрации IL-18 в СП половых партнеров обследуемых пациенток представлены на рисунке 3. Рисунок 3. Концентрация IL-18 (А) и количество данного цитокина в СП, вводимой интравагинально в день ТВП (Б), у партнеров пациенток основной группы, с удачными и неудачными исходами программы ЭКО/ИКСИ
Согласно полученным результатам концентрация и, соответственно, количество IL-18 в СП, вводимой интравагинально, у половых партнеров пациенток с успешным исходом лечения оказались статистически значимо ниже по сравнению с аналогичными показателями половых партнеров женщин, у которых беременность не наступила (р=0,018) (рис. 3 А,Б).
Принимая во внимание, что эффект СП на исходы программы ЭКО может реализовываться не только при применении аппликации СП в день ТВП, но и при поступлении СП в репродуктивный тракт женщины при предшествующих сексуальных отношениях с биологическим отцом в цикле ЭКО, проводилось изучение уровня цитокинов TGF-1 и IL-18 во всем объеме СП, полученном при эякуляции. Проведена оценка зависимости исходов программы ЭКО/ИКСИ от уровня цитокинов TGF-p1 и IL-18 во всем объеме СП, полученном при эякуляции. Результаты сравнения уровней цитокинов в СП половых партнеров обследуемых пациенток представлены на рисунке 4.
Содержание IL-18 (А) и TGF-1(Б) во всем объеме эякулята партнеров пациенток основной группы, с удачными и неудачными исходами программы ЭКО/ИКСИ Количество TGF-1, содержащееся в СП, которая поступает в репродуктивный тракт женщины при половом контакте, в группе пациенток с наступившей беременностью было статистически значимо ниже, чем в группе женщин с неудачной попыткой ЭКО/ИКСИ и составляло 390,2±27,8 нг и 484,4±33,4 нг, соответственно (p = 0,033) (рис. 4Б). Содержание IL-18 в эякуляте половых партнеров пациенток с успешным исходом программы ЭКО/ИКСИ также было статистически значимо ниже по сравнению с аналогичным показателем у партнеров женщин с отрицательным результатом лечения и составляло 925,5±394,7 пг и 1429,3±608,3 пг, соответственно (р=0,0001) (рис. 4А). Возможно, не только уровень отдельных медиаторов СП, но и соотношение концентраций разнонаправленных цитокинов может определять влияние СП на реализацию репродуктивной функции. Поэтому была проведена оценка зависимости исходов программы ЭКО от соотношения TGF-1/IL-18 в СП половых партнеров пациенток основной группы.
Данные о соотношении уровней TGF-1/IL-18 представлены на рисунке 5. Соотношение TGF-1/IL-18 в группе пациенток с успешным исходом лечения составило 470±228, что оказалось статистически значимо выше по сравнению с аналогичным показателем в группе женщин с неудачной попыткой ЭКО - 363±146 (р=0,02). При расчете соотношения величины концентраций TGF-1 и IL-18 были приведены к единой единице измерения – пг/мл (1нг = 1000 пг).
Таким образом, содержание TGF-1 в СП половых партнеров в группе пациенток с наступившей беременностью превышает содержание IL-18 в 470 раз, в то время как в группе с неудачной попыткой ЭКО разница была существенно меньше.
Полученные результаты демонстрируют, что содержание цитокинов TGF-1 и IL-18 в эякуляте половых партнеров пациенток с наступившей беременностью было статистически значимо ниже по сравнению с аналогичным показателем у партнеров женщин с отрицательным результатом лечения. Выявленные взаимосвязи между содержанием данных цитокинов во всем объеме СП и исходами программы ЭКО свидетельствуют о возможном влиянии естественных половых отношений в цикле ЭКО, при которых в репродуктивный тракт женщины поступает весь объем эякулята.
Зависимость эффективности программы ЭКО от состояния клеточного звена иммунитета пациенток в день проведения ТВП и ПЭ
Поэтому на следующем этапе работы был проведен анализ особенностей цитокинового состава СП, а также взаимосвязи между уровнем определенных цитокинов и исходами программы ЭКО.
Анализируя данные литературы, следует отметить, что TGF-1 является ключевым фактором в репродуктивной физиологии женщин. При этом содержание TGF-1 в СП значительно превышает уровень данного цитокина в сыворотке крови [128]. Кроме того, S.A. Robertson и соавторы показали, что уровень TGF- остается относительно постоянным в течение времени и колеблется в пределах 20% от среднего значения для данного индивида [148]. Поэтому общее содержание TGF-1 можно рассматривать как относительно стабильную характеристику эякулята.
Следующий этап исследования был посвящен изучение взаимосвязи между уровнем TGF-1 в СП, вводимой интравагинально в день ТВП, и исходами лечения бесплодия методом ЭКО/ИКСИ с применением аппликации СП. Согласно протоколу исследования всем пациенткам вводили фиксированный объем СП. Полученные данные продемонстрировали отсутствие влияния количества TGF-1, поступающего в репродуктивный тракт женщины при аппликации СП, на наступление беременности при проведении программы ЭКО (р = 0,796).
Представленные результаты явились основой для поиска новых маркеров СП связанных с эффективностью программы ЭКО с применением аппликации СП.
Сперма здоровых фертильных мужчин содержит широкий спектр иммунологических факторов. По-видимому, не только TGF-1, но и другие про- и противовоспалительные цитокины, содержащиеся в СП, могут оказывать влияние на результативность лечения методом ЭКО/ИКСИ.
В научных публикациях имеются сообщения о разнонаправленности действия некоторых цитокинов при иммунорегуляции. Одним из таких цитокинов, обладающим антагонистическим действием в отношении TGF-1, как показали A. Koutoulaki и соавторы (2010), является IL-18, также присутствующий в СП [146]. На сегодняшний день имеются данные о том, что наличие детектируемых количеств IL-18 в полости матки связано со снижением частоты наступления беременности [37]. Возможно, что цитокины TGF-1 и IL-18 СП могут оказывать противоположное влияние на процессы имплантации. При ретроспективном анализе была выявлена зависимость эффективности лечения бесплодия методом ЭКО/ИКСИ с применением аппликации СП в день проведения ТВП от концентрации IL-18 в СП полового партнера. У пациенток с успешным исходом лечения концентрация IL-18 в СП партнера была статистически значимо ниже по сравнению с аналогичным показателем половых партнеров женщин, у которых беременность не наступила (р=0,018).
Ранее было продемонстрировано, что половая жизнь в перитрансферный период при проведении программы ЭКО благоприятно влияет на результаты лечения [135]. Возможно, что воздействие СП на исходы программы ЭКО может реализовываться не только при применении аппликации СП в день ТВП, но и при поступлении СП в репродуктивный тракт женщины при предшествующих сексуальных отношениях с биологическим отцом в цикле ЭКО. Соответственно эффективность репродуктивных технологий может зависеть не только от концентрации цитокинов, но и от их общего содержания во всем объеме СП, поступающей в репродуктивный тракт женщины при незащищенном половом контакте.
В результате ретроспективного анализа было выявлено, что содержание IL-18 в эякуляте супругов пациенток оказалось статистически значимо ниже в группе женщин с успешным исходом лечения в сравнении с пациентками, у которых беременность не наступила (р=0,0001). Эти результаты согласуются с данными предыдущих исследований, которые продемонстрировали, что, несмотря на важную роль IL-18 в процессах ангиогенеза в эндометрии, необходимого для успешной имплантации, повышенный уровень данного цитокина может стать причиной нарушения процесса имплантации [37].
Предыдущие исследования продемонстрировали, что повышенный уровень IL-18 в сперме связан с урогенитальной инфекцией и патозооспермией [64, 67]. Однако в данном исследовании статистически значимых различий между основными параметрами спермы в исследуемых группах выявлено не было, при этом лейкоцитоспермия являлась критерием исключения. Результаты, полученные относительно концентрации TGF-1 и IL-18 в СП половых партнеров пациенток с успешным исходом лечения и женщин с неудачной попыткой ЭКО, совпадают с аналогичными показателями в СП фертильных мужчин, приведенных в ряде предыдущих исследований [30, 67]. Следовательно, маловероятно, что повышенный уровень IL-18 в СП партнеров в группе женщин с отрицательным результатом лечения отражал наличие скрытой урогенитальной инфекции у половых партнеров пациенток.