Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Гнойные воспалительные заболевания придатков матки: этиопатогенез, диагностика и принципы терапии (Обзор литературы) 11
1.1. Эпидемиологические аспекты и факторы риска развития гнойных воспалительных заболеваний придатков матки 10
1.2. Роль нарушений системного и локального иммунитета в патогенезе гнойных воспалительных заболеваний придатков матки 16
1.3. Принципы и методы диагностики острых сальпингоофоритов 24
1.4. Возможности и перспективы малоинвазивных методов хирургического вмешательства в лечении больных с ГВЗПМ 34
Глава 2. Клиническая характеристика обследованных больных и методы исследования 42
2.1. Клиническая характеристика обследованных больных 42
2.2. Методы исследования 52
Глава 3. Результаты собственных исследований 62
3.1. Особенности клинического течения, диагностика и лечение гнойных воспалительных заболеваний придатков матки у пациенток, которым выполнена «ультразвуковая мини-хирургия» 62
3.2. Особенности клинического течения, диагностика и лечение гнойных воспалительных заболеваний придатков матки у пациенток, которым выполнена оперативная лапароскопия 81
3.3. Клиническая оценка вариаций некоторых белков острой фазы у пациенток с гнойным воспалением придатков матки 102
3.4. Локальные и системные изменения клеточного звена иммунитета и цито-кинового спектра у больных гнойным воспалением придатков матки 109
Глава 4. Обсуждение результатов собственных исследований 121
Выводы 143
Практические рекомендации 103
Список литературы 1
- Роль нарушений системного и локального иммунитета в патогенезе гнойных воспалительных заболеваний придатков матки
- Возможности и перспективы малоинвазивных методов хирургического вмешательства в лечении больных с ГВЗПМ
- Особенности клинического течения, диагностика и лечение гнойных воспалительных заболеваний придатков матки у пациенток, которым выполнена оперативная лапароскопия
- Локальные и системные изменения клеточного звена иммунитета и цито-кинового спектра у больных гнойным воспалением придатков матки
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы во всем мире зарегистрировано прогрессирующее увеличение частоты трансмиссивных инфекций. При этом повышение заболеваемости наиболее ярко отражено в возрастных группах 18-24 года (в 1,4 раза) и 25-29 лет (1,8 раза) (Адамян Л.В. и др., 2012; Подзолкова Н.М. и Глазкова О.Л., 2014; Стрижаков А.Н. и др., 2014). Несмотря на высокую распространенность воспалительных процессов в структуре гинекологической заболеваемости, наибольшую опасность среди них представляют гнойные тубоовариальные образования - абсцессы различной локализации и величины.
Несмотря на многообразие методов консервативной терапии гнойных воспалительных тубоовариальных образований, включающих широкий спектр антимикробных и иммуномодулирующих средств, факторов физического воздействия и др., остается незыблемым постулат гнойной хирургии - ubi pus, ibi incisio, означающий, что гнойный очаг должен быть полностью санирован.
Сегодня минимизация хирургического вмешательства - одна из главных задач репродуктивной медицины (Адамян Л.В. и др., 2015). Суть этой задачи -обеспечить минимальную хирургическую травму органов репродукции для сохранения или минимальной коррекции детородной функции. Вместе с тем, стремление к минимизации никоим образом не должно противостоять патогенетическим принципам лечения. В арсенале врачей акушеров-гинекологов минимальный подход к хирургическому лечению больных с ГВЗПМ обеспечивается, как правило, двумя методами - ультразвуковой мини-хирургией и лапароскопией.
Цель исследования: разработать и обосновать систему дифференцированного подхода к выбору метода малоинвазивного хирургического вмешательства - «ультразвуковой мини-хирургии» и оперативной лапароскопии - у больных с гнойными воспалительными тубоовариальными образованиями репродуктивного возраста, основанную на применении результатов комплексного клинико-лабораторного исследования - высокочастотной трансвагинальной
4 эхографии в режимах 2D и 3D сканирования, тестирования белков острой фазы (альфа-2-макроглобулин, лактоферрин, фибриноген), а также оценки системных изменений клеточного звена иммунитета и цитокинового спектра.
В соответствии с основной целью исследования были поставлены следующие задачи:
изучить особенности клинического течения ГВЗПМ у больных с различными формами тубоовариальных образований - абсцессами маточных труб, яичников, тубоовариальными абсцессами;
уточнить роль высокочастотной трансвагинальной эхографии в режимах 2D и 3D сканирования в диагностике ГВЗПМ и выборе тактики лечения больных с воспалительными тубоовариальными образованиями;
определить роль секреции ряда сывороточных белков острой фазы (аль-фа-2-макроглобулин, лактоферрин, фибриноген) в качестве маркеров оценки тяжести деструктивных процессов в очаге воспаления, а, следовательно, одного из факторов, определяющих выбор метода лечения больных с ГВЗПМ;
установить клиническое значение вариаций уровней экспрессии генов цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови больных с ГВЗПМ для оценки тяжести местной воспалительной реакции организма, а также оценить характер провоспалительных изменений продукции цитокинов в крови больных с ГВЗПМ до и после малоинвазивного хирургического вмешательства;
разработать и обосновать с методологических позиций условия, показания и противопоказания к «ультразвуковой мини-хирургии» и оперативной лапароскопии у больных с ГВЗПМ в зависимости гнойными воспалительными тубоовариальными образованиями репродуктивного возраста.
Научная новизна. Впервые с методологических позиций обоснован дифференцированный подход к выбору метода малоинвазивного хирургического вмешательства у больных с ГВЗПМ - «ультразвуковой мини-хирургии» и оперативной лапароскопии в зависимости от возраста женщины, наличия у нее детей, типа и локализации гнойного воспалительного тубоовариального обра-
5 зования, а также степени деструктивных процессов в очаге воспаления. С пато-морфологических позиций обоснована и представлена детальная характеристика диагностических маркеров гнойного воспаления придатков матки, как акустических (высокочастотная трансвагинальная эхография в режимах 2D и 3 D сканирования), так и эндоскопических (лапароскопия). Установлена прямая коррелятивная взаимосвязь между уровнем ингибитора протеиназ альфа-2-мак-роглобулином и тяжестью деструктивных изменений в выпаленных тканях придатков матки. Изучено значение вариаций уровней экспрессии генов цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови, а также характера про-воспалительных изменений продукции цитокинов в крови больных с ГВЗПМ до и после малоинвазивного хирургического вмешательства.
Практическая значимость. Систематизированы диагностические критерии гнойных воспалительных тубоовариальных образований при использовании высокочастотной трансвагинальной эхографии в режимах 2D и 3D сканирования, а также лапароскопии и имеющие клиническое значение в выборе тактики лечения пациенток с ГВЗПМ. Определены уровни показателей белков острой фазы (альфа-2-макроглобулин, лактоферрин, фибриноген), характерные как для локального воспаления, так и деструктивного процесса в тканях при воспалении придатков матки. Разработана и представлена для использования в практическом здравоохранении система дифференцированного подхода к выбору метода малоинвазивного хирургического лечения больных с ГВЗПМ репродуктивного возраста. В этой системе изложены конкретные рекомендации, позволяющие избрать оптимальный способ лечения пациенток с ГВЗПМ в зависимости от возраста женщины, наличия у нее детей, типа и локализации гнойного воспалительного тубоовариального образования, а также степени деструктивных процессов в очаге воспаления.
1. У больных репродуктивного возраста с отграниченными гнойными воспалительными тубоовариальными образованиями (патологический процесс не
распространяется за пределы маточных труб и/или яичников) лечебно-санаци-онное дренирование абсцессов под контролем трансвагинального ультразвукового сканирования («ультразвуковая мини-хирургия») можно рассматривать в качестве метода выбора лечения таких пациенток.
-
Анализ результатов бактериологического исследования в группах пациенток с различной клиникой ГВЗПМ убеждает, что тяжесть воспалительного процесса связана не столько с типом возбудителя заболевания, сколько с иммунной резистентностью организма и характером течения патологии (хроническое течение с частыми рецидивами и др.).
-
Тестирование уровней белков острой фазы (альфа-2-макроглобулин, лактоферрин, фибриноген) в сыворотке крови пациенток с ГВЗПМ представляет высокоинформативный метод диагностики тяжести воспаления и степени деструктивных поражений в тканях, позволяющий в комплексе с «традиционным» клиническим исследованием и высокочастотной трансвагинальной эхографией обосновать оптимальную тактику лечения этих больных.
Внедрение результатов исследования в практику. Методические и методологические рекомендации, разработанные на основе диссертации, внедрены в клиническую практику гинекологических отделений ГКБ № 61 и ГКБ № 7 г. Москвы. Результаты диссертационной работы используются в лекционном курсе и на семинарских занятиях на кафедре акушерства, гинекологии и пери-натологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации представлены исследователем на конгрессе «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2012), на VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012); XXVI Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2013); XIII Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2012); VII Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2013). Апробация диссертации состоя-
7 лась на конференции сотрудников кафедры акушерства, гинекологии и перина-тологии лечебного факультета Первого МГМУ имени И.М. Сеченова 15.05.2015.
Личное участие автора. Все 102 клинических наблюдений выполнены автором лично. Методы исследования изучены и освоены автором. Автором представлены результаты исследований, проведен их тщательный анализ, сформулированы выводы и практические рекомендации. При обсуждении результатов исследования проведен сравнительный анализ личных наблюдений и данных литературы о применении малоинвазивных методов хирургического вмешательства для лечения больных с гнойными тубоовариальными образованиями в репродуктивном периоде. Статистическая обработка полученных результатов проведена лично диссертантом. Личное участие автора состоит в организации дизайна исследования в соответствии с его целью и задачами, получении исходных клинических данных, интерпретации и систематизации полученных результатов лабораторных, инструментальных и клинических исследований, разработке системы обследования, профилактики, лечения, подготовке публикаций и автореферата по выполненной работе.
Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 7 работ, полностью отражающих содержание диссертации; из них 4 работы в журналах, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствует формуле специальности 14.01.01 -«акушерство и гинекология». Минимизация хирургического вмешательства при гнойных тубоовариальных образованиях у пациенток репродуктивного периода является одним из главных направлений акушерства и гинекологии. Важной областью исследований является клиническая разработка методов сохранения репродуктивного потенциала женщины и внедрение ее основных положений в клиническую практику.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страни-
Роль нарушений системного и локального иммунитета в патогенезе гнойных воспалительных заболеваний придатков матки
В последние годы во всем мире зарегистрировано прогрессирующее увеличение частоты трансмиссивных инфекций (инфекций, передающихся половым путем). Традиционно трансмиссивные болезни (сифилис, гонорея, трихо-мониаз) дополнились второй генерацией инфекций, включающей хламидиоз, вирусные, протозойные и др. По данным Американского центра контроля над заболеваемостью, ежегодно в США регистрируется около миллиона случаев острого воспаления придатков матки. Почти у каждой пятой женщины, перенесшей острый сальпингоофорит, развиваются гнойно-септические осложнения, требующие хирургического вмешательства. В экономически развитых странах Европы число трансмиссивных заболеваний с 1980 г. возросло примерно в 3 раза и в последние 10 лет стабилизировалось на уровне 10-13 на 1000 женщин в год. Повышение заболеваемости наиболее ярко отражено в возрастных группах 18-24 года (в 1,4 раза) и 25-29 лет (1,8 раза) (Адамян Л.В. и др., 2012; Кузьмин В.Н., 2009; Стрижаков А.Н. и др., 2014; Simmons S., 2015; Торси И.О. etal, 2014).
Несмотря на высокую распространенность воспалительных процессов в структуре гинекологической заболеваемости, наибольшую опасность среди них представляют гнойные тубоовариальные образования - абсцессы различной локализации и величины. Причины их формирования дискутируются до настоящего времени. Одним из главных факторов риска и пусковых механизмов развития тяжелых форм воспалительных заболеваний придатков матки считается внутриматочная контрацепция (ВМК). Применение ВМК в 3-9 раз повышает степень риска формирования воспалительных заболеваний придатков матки (Стрижаков А.Н. и Давыдов А.И., 2010; Hubacher D., 2014). Тем не менее, не все исследователи согласны с этой точкой зрения (Caddy S. et al, 2014). В литературе обсуждаются два аспекта, связанных с повышенным риском инфицирования внутренних половых органов при использовании ВМК: 1) длительность использования ВМК, 2) тип ВМК. Согласно заключению Совета экспертов ВОЗ, максимальный риск развития воспалительных заболеваний придатков матки отмечается в течение первого месяца после введения контрацептива (5-8 случаев на 100 женщин). В дальнейшем этот показатель снижается и уже через 13-24 месяцев составляет 2,5 на 100 женщин в год. Однако при непрерывном использовании внутриматочных средств свыше двух лет частота инфекционных осложнений вновь увеличивается (Papic М. et al., 2015; Simmons S., 2015).
Высокую частоту развития воспалительных заболеваний придатков матки на фоне ВМК А.Н. Стрижаков и А.И. Давыдов (2010) объясняют комплексом факторов. Так, в момент введения ВМК возможен механический перенос патогенных или условно-патогенных микроорганизмов из нижних отделов половой системы в ее верхние отделы. Не исключается вероятность распространения бактерий по нитям ВМК, свисающим во влагалище. Более того, контрацептив, находящийся в полости матки, нарушает слущивание эндометрия во время менструации, подавляет фагоцитоз и другие факторы локальной иммунной защиты, способствует появлению микроэрозий и перифокальной воспалительной реакции стромы. У 70% женщин через 2 года после введения ВМК даже при отсутствии клинической симптоматики определяются гистологические признаки эндометрита, а у 86% при исследовании мазков с удаленного контрацептива отмечается положительная бактериологическая реакция (Торси Н.О. et al., 2014).
Что касается типа ВМК, то, согласно заключению экспертов ВОЗ (1994), наиболее высок риск инфицирования внутренних половых органов при использовании пластмассовых средств и значительно ниже (приблизительно в 2-5 раз) при применении контрацептивов с медью. Доказано, что присутствие в ВМК меди способствует подавлению факторов, усиливающих рост анаэробных бактерий (Hardeman J. et Weiss B.D., 2014; Schindlbeck С. et al, 2014).
Введение ВМК относится к «малым» внутриматочным вмешательствам. Соответственно, любое внутриматочное вмешательство может вызвать развитие воспалительного процесса в придатках матки. Наиболее часто сальпингоо-фориты развиваются после искусственного прерывания беременности: после искусственного аборта с применением вакуум-аспирации воспаление внутренних половых органов наблюдается примерно у 10% женщин (наличие обширных дефектов, возникающих в результате травмы эндометрия, позволяет бактериям легко проникать в ткани стенки матки). В дальнейшем рост микроорганизмов поддерживается благодаря прекрасной питательной среде, образованной нитями фибрина, сгустками крови, некротизированными тканями. Не вызывает сомнений, что любое внутриматочное вмешательство ведет к ослаблению местной барьерной системы. Более того, анаэробные и аэробные бактерии, составляющие нормальную цервикальную и влагалищную флору, в этих условиях могут проявлять свою патогенность (Upadhyay U.D. et al, 2015).
Одним из факторов риска развития гнойных воспалительных заболеваний придатков матки является абдоминальное оперативное вмешательство. Риск возникновения послеоперационных инфекционных осложнений находится в прямо пропорциональной зависимости от исходной микрофлоры брюшной полости, а также длительности контакта между брюшной полостью и влагалищной средой (Стрижаков А.Н. и др., 2010; Ross J.D., 2015).
Учитывая, что практически все инфекционные осложнения в послеоперационном периоде формируются в результате осеменения раневой поверхности эндогенными микроорганизмами, любое травмирующее вмешательство на органах малого таза следует рассматривать как фактор, способный существенным образом видоизменить характер бактериальной флоры половых путей. Доказано, что уже через 5 дней после абдоминальной или влагалищной гистерэктомии наблюдается избыточная пролиферация аэробных бактерий, принадлежащих к виду стрептококков, кишечной палочки, протея и клебсиелл, а также большой группы неспорообразующих грамотрицательных анаэробов. Вместе с тем сформировавшиеся в процессе длительной эволюции достаточно сложные и совершенные механизмы биологической защиты формируют устойчивость половых органов к возможному воздействию различных патогенных факторов, в том числе и инфекционных агентов (Кохреидзе Н.А. и др., 2013).
Устойчивость внутренних половых органов к воздействию патогенных микроорганизмов связана с циклической отслойкой функционального слоя эндометрия, перистальтическими сокращениями маточных труб с мерцанием ресничек на поверхности трубного эпителия в сторону просвета полости матки, наличием зародышевого эпителия, покрывающего поверхность яичников (Ба-лакшина Н.Г. и Кох Л.И., 2011).
Возможности и перспективы малоинвазивных методов хирургического вмешательства в лечении больных с ГВЗПМ
Наклон датчика выполняли либо в передне-заднем направлении, либо в поперечном. Перед выполнением трехмерной эхографии, с помощью 2D метода, определяли зону позициирования, т. е. зону наибольшего интереса (рис. 12). На следующем этапе производилась активация программы трехмерной реконструкции. Перед проведением сбора данных производилась настройка параметров сканирования, а именно устанавливался угол поворота при «веерном» перемещении датчика, расстояние смещения вершины датчика и время сканирования. В наших исследованиях все исследования выполнялись при заданном значении времени сканирования 7 секунд и угла поворота 45. После выполнения сканирования диагностическая система автоматически выводила на экран реконструированное трехмерное изображение.
Изучение трехмерных сканограмм производили с применением следующих методик: поворот изображения; разворот (ротация) изображения; поворот плоскости вокруг выбранной точки; изучение «секущей» плоскости в собранном объеме данных; изучение трех взаимно перпендикулярных «секущих» плоскостей; режим показа с поверхностью - текстурой; режим показа «непрозрачность»; режим максимального, минимального затенения; режим имитации рентгеновского затенения. Комбинируя различные методики, осуществляли целенаправленное сканирование изучаемого органа или новообразования с детальным изучением топографического положения патологического образования, особенностей его формы, внутренней структуры, контуров, эхо-плотности, а также состояние прилегающих участков эндометрия и миометрия. При выявлении в полости малого таза объемных патологических образований оценивали локализацию, форму и внутреннюю структуру этих образований, а также устанавливали их нозологическую принадлежность. Интерпретация внутренней структуры патологических образований основывалась на изучении особенностей звукопроводимости и появлении полиморфных акустических сигналов.
На основании данных, полученных в ходе трехмерного ультразвукового сканирования, устанавливали предположительный диагноз, который сравнивали с результатами двухмерной эхографии, клинического обследования и данными, обнаруженными при операции.
«Ультразвуковую мини-хирургию» (активное дренирование гнойных воспалительных тубоовариальных образований с помощью трансвагинального ультразвукового мониторинга) выполняли с помощью специального устройства-насадки для трансвагинального датчика. Суть конструкции этого устройства - обеспечить поступление иглы строго по заданному ориентиру. Ориентир направления аспирационной иглы отражается на экране ультразвукового прибора в виде пунктирной линии при работе аппарата в режиме "биопсия" -т.е. в каком бы положении не находился датчик, игла будет направлена строго по определенной линии (рис. 13). Такая конструкция позволяет выбрать оптимальное место прокола. После прокола изучаемой структуры (образования) стилет извлекают из троакара (таким образом, одновременно игла выполняет функцию мандрена), троакар соединяют со шприцем или вакуум-аппаратом. Полученный аспират осматривали, определяли его характер, цвет, запах и подвергали обязательному бактерио- и цитологическому исследованиям.
Лапароскопию производили с помощью оборудования фирм "Karl Storz" (Германия), "Ethicon" (Johnson & Johnson, США). Прокол передней брюшной стенки осуществляли в трех точках: интралюмбальной (на расстоянии 1-2 см ниже пупка по белой линии живота) - для введения телескопа и надлобковых (правой и левой) - для хирургических инструментов и манипуляторов. Для наложения пневмоперитонеума применяли углекислый газ. Давление и ско Рисунок 13. Методика введения аспирационной иглы в полость малого таза с помощью трансвагинального ультразвукового мониторинга (схема) рость потока газа, подаваемого в брюшную полость, автоматически регулировались лапарофлатором. В качестве анестезиологического пособия операции использовали только эндотрахеальный наркоз.
В качестве «слепого» троакара применяли безопасную конструкцию фирмы "Rudolf (Германия). Введение дополнительных троакаров осуществляли только под визуальным контролем. Гемостаз во время операции обеспечивали электрокоагуляцией (моно- и биполярной) кровоточащих участков, а также по мере необходимости локальными инъекциями гемостатических препаратов (тра-нексамовая кислота, трансамча, циклокапрон). Основными лапароскопическими операциями в наших исследованиях являлись: 1) органоуносящие: удаление маточных труб; удаление придатков матки; 2) органосохраняющие: эвакуация патологического выпота, санация брюшной полости растворами антисептиков (хлоргексидин, диоксидин); рассечение сращений между маточными трубами, яичниками, а также окружающими их тканями; вскрытие гнойных тубоовариальных образований эвакуация гноя, санация полости патологических образований. Лабораторные исследования использовали как для проведения общеклинических исследований, так и оценке уровней белков острой фазы вое паления: альфа-2-макроглобулин (А2М), лактоферрин (ЛФ), фибриноген (ФГ). Их содержание определяли методом ракетного иммуноэлек- трофореза с использованием моноспецифических антисывороток к данным белкам. Уровень ЛФ определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «Вектор-Бест» (Росссия).
Иммунологические методы исследования включали определение продукции цитокинов, интерферонов, иммунный интерфероновый статус в острой фазе воспаления.
Комплексное исследование иммунного статуса включало оценку клеточного, гуморального и фагоцитарного звена, антимикробного и цитотоксическо-го потенциала, поглотительной и оксидазной активности нейтрофилов. Имму-нофенотипирование основных субпопуляций лимфоцитов проводили микропланшетным методом, с использованием комбинации моноклональных антител к дифференцировочным и активационным маркерам, меченным FITC и фи-коэритрином.
Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови, в аспирате из полости матки и способность к продукции цитокинов клетками крови in vitro, проводили методом ИФА и ELISA. При оценке цитокинового статуса определяли уровни спонтанной и индуцированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) до и после лечения.
Микроскопические и микробиологические методы исследования. Экссудат и гной, полученные из брюшной полости во время лапароскопии или дренировании тубоовариальных образований подвергался бактериологическому исследованию для определения аэробной и анаэробной флоры, а также чувствительности к антибиотикам. Использовали традиционные методики, позволяющие выделить условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли методом диффузии в агаре с использованием стандартных дисков.
Цитологическое исследование. Экссудат, полученный во время лапароскопии или дренирования воспалительных образований под контролем трансвагинальной эхографии, центрифугировали в течение 15 минут, затем полученный осадок переносили на предметное стекло и исследовали цитологический состав (количество клеток, клеточный состав, наличие атипических клеток) для исключения бластоматозного процесса.
Морфологическое исследование препаратов, полученных во время лапароскопии, чревосечения производили после предварительной фиксации кусочков тканей в 10.0% нейтральном формалине по методике Р.Д. Лилли (1969). В дальнейшем исследуемый материал заливали в парафин, и срезы тощиной 5 мкм окрашивали гематоксилином-эозином и по Ван-Гизону.
Особенности клинического течения, диагностика и лечение гнойных воспалительных заболеваний придатков матки у пациенток, которым выполнена оперативная лапароскопия
СБ4-позитивных клетках периферической крови больных. Анализ результатов исследования показал, что у пациенток с ГВЗПМ исходно повышена концентрация СБ4+-клеток, синтезирующих IFN-g. Данный факт указывает на повышение активности клеток (рис. 38).
В контрольной группе средние значения IL-4-синтезирующих клеток не превысило 4,6%; клеток, синтезирующих IFN-g - 6,3%, а их соотношение составило 0,8. У пациенток с ГВЗПМ уровень содержания цитокин-синтезирую-щих Т хелперов варьировал в широких пределах - от 4,1% до 10,4% для IL-4 и 6,2-18,8% - IFN-g. Тем не менее, их средние величины достоверно превышали таковые среди здоровых женщин. Достоверно варьировало и соотношение Thl/ Th2 клеток - с 0,9 до 2,1. Результаты тестирования Т-хелперов 1 и 2 порядка в периферической крови убеждают, что у пациенток с ГВЗПМ увеличивается содержание Thl-лимфоцитов.
Для оценки тяжести воспаления на локальном и системном уровне у больных с ГВЗПМ нами изучены вариации содержания IL-6 в соскобе слизистой шеечного канала и сыворотке крови методом иммуноферментного анализа.
Анализ полученных результатов показал, что у пациенток с ГВЗПМ концентрация IL-6 до лечения была увеличена как в сыворотке, так и в соскобах из цервикального канала. Причем наиболее выражены эти изменения оказались при оценке IL-6 в соскобе из шеечного канала; величины этого Т-хелпера колебались в пределах 210-570 пкг/мл. После проведенного лечения содержание сывороточного IL-6 у большинства обследованных женщин достигло контрольных значений.
Несмотря на общие закономерности при исследовании крови и соскобов, установлено, что вариации IL-6 в соскобах из цервикального канала характеризовались более замедленной реакцией и в ряде наблюдений численные значения этого параметра были выше, чем в здоровых женщин. С одной стороны, это свидетельствовало о сохранении фоновых нарушений иммунного гомеос-таза, с другой - указывало, что тестирование интерлейкина в соскобе обладает большей чувствительностью и, следовательно, прогностической способностью в отношении исходов лечения пациенток с ГВЗПМ.
Таким образом, анализ проведенных исследований убеждает, что тестирование IL-6 можно использовать в качестве маркера эффективности проводимых лечебных мероприятий. Вместе с тем, следует учитывать, что вариации хелпера крови не всегда показательны и могут не соответствовать клинической картине. Более обоснованным является оценка уровня IL-6 в соскобах из цервикального канала. Поэтому данный показатель может быть рекомендован в качестве количественного маркера эффективности проводимого лечения больных с ГВЗПМ.
Локальное воспаление характеризуется элиминацией патологических агентов, которая сопровождается активацией иммунной системы (происходит
112 активация иммунокомпетентных клеток и повышение продукции цитокинов). Поэтому для оценки тяжести ГВЗПМ, а также эффективности исходов лечения больных с воспалением придатков матки немаловажное значение имеет изучение основных популяций лимфоцитов периферической крови, степени активации Т-хелперов, уровня экспрессии генов и продукции ряда цитокинов.
Для решения поставленной задачи проведено фенотипирование лимфоцитов периферической крови. Для этого мононуклеарные клетки (МНК), выделенные центрифугированием на градиенте плотности фиколла, окрашивали на проточном цитофлуориметре, используя моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, CD 16, CD 19, CD25 и HLA-DR, меченные флуоресцеинизотиоцио-натом и фикоэритрином. Из каждой пробы анализировали 5000 жизнеспособных клеток, дискриминируемых по интенсивности свечения пропидиума йоди-да.
В таблице 11 представлены результаты фенотипического анализа МНК у пациенток с ГВЗПМ до и после малоинвазивного хирургического вмешательства. Анализ результатов, представленных в таблице, свидетельствует, что в периферической крови больных с ГВЗПМ достоверно увеличена концентрация натуральных киллеров (CD 16+), а также клеток, содержащих активацион-ные маркеры - рецепторы к IL-2 (CD25) и антигены гистосовместимости II класса (HLA-DR). При этом наиболее выраженные изменения были связаны с повышением уровня активированных клеток (CD25+, HLA DR+).
В последующем иммунный статус больных оценивали через 60 дней после лечения. Из данных таблицы следует, что после малоинвазивного хирургического лечения все показатели, характеризующие популяционный состав клеток периферической крови, достоверно не отличались от таковых в контрольной группе. При этом сравнительное изучение изменений в относительном содержании клеток разных фенотипов у больных, которым выполнена оперативная лапароскопия или «ультразвуковая мини-хирургия», не выявил достоверных
Безусловно, оценка иммунного гомеостаза на локальном уровне имеет большое значение для оценки тяжести в очаге воспаления. Тем не менее, изучение нарушений на системном уровне не менее актуально в отношении понимания патогенетических механизмов ГВЗПМ, а также интерпретации эффективности выбранных методов лечения. Изменения иммунитета на системном уровне отражается в изменении популяционного состава и перестройке функциональной активности мононуклеарных клеток периферической крови. С изменением функциональной активности клеток в первую очередь связано выраженное повышение продукции провоспалительных цитокинов.
Для оценки нарушений иммунного гомеостаза на системном уровне при ГВЗПМ нами изучена экспрессия генов провоспалительных цитокинов IFN-g, IL-6, IL-10, а также факторов роста и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов -IL-2, IL-4, IL-15, IL-18. Материалом для исследования являлась периферическая кровь, полученная из локтевой вены обследуемых пациенток в день операции и через 60 дней после ее проведения. Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли непосредственно после ее забора в градиенте плотности Ficoll-Paque. Вьщеление РНК, проведение ДНК-азной обработки, обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции проводили согласно методике, описанной в главе 2.
Локальные и системные изменения клеточного звена иммунитета и цито-кинового спектра у больных гнойным воспалением придатков матки
При оценке продукции фибриногена были получены данные, сходные с таковыми при тестировании лактоферрина. Также как и при анализе ЛФ, уровень ФГ у пациенток 1 группы (локализованные абсцессы при отсутствии пель-виоперитонита) достоверно не отличался от такового у здоровых женщин, а в группах 2 и 3 концентрация ФГ достоверно превышала нормативные показатели. Причем при развитии пельвиоперитонита (3 группа) уровень пептида повышался более чем на 50%.
Анализ результатов биохимического исследования позволяет предположить, что при формировании гнойно-некротической деструкции в тканях, сопровождающейся выраженной воспалительной агрессией, снижение уровня А2М свидетельствует о демобилизации защитных сил. Напротив, до развития деструктивных повреждений происходит их усиление (по-видимому, до определенного плато, после которого наступает резкая деактивация действия ингибиторов протеиназ).
В целом изучение продукции белков острой фазы в сыворотке крови больных с ГВЗПМ установило ряд закономерностей. По-видимому, наибольшей чувствительностью в качестве маркера оценки тяжести деструктивных процессов в очаге воспаления обладает ингибитор протеиназы альфа-2-макроглобу-лин. Этот пептид повышается уже на стадии образования локализованного гнойного процесса в придатках матки и усиливается при воспалении окружающей брюшины. В то же время, с формированием деструктивных преобразований в тканях секреция А2М резко уменьшается, чувствительно отражая состояние защитных сил организма (деактивация действия ингибиторов протеиназ).
Продукция ЛФ и ФГ при ГВЗПМ имеет определенные сходства. При локализованном гнойном процессе в придатках матки, представленном изолированными абсцессами маточных труб и яичников без вовлечения в воспаление окружающей брюшины, уровень секреции этих пептидов достоверно не отличается от показателей, полученных при обследовании здоровых женщин. Отчетливое повышение ЛФ и ФГ регистрировали в сыворотке крови больных с пельвиоперитонитом (2 группа) и деструктивными процессами в органах (3 группа). При этом численные значение пептидов достоверно отличались не только при сравнении их величин с таковыми в контрольной группе, но и между собой.
Таким образом, тестирование уровней А2М, ЛФ и ФГ представляет высокоинформативный метод диагностики тяжести воспаления и степени деструктивных поражений в тканях у пациенток с ГВЗПМ, позволяющий в комплексе с «традиционным» клиническим исследованием, высокочастотной трансвагинальной эхографией обосновать оптимальную тактику лечения этих больных.
Патогенетическая роль изменений клеточного звена иммунитета и цито-кинового спектра у больных гнойным воспалением придатков матки. ГВЗПМ всегда сопутствует иммунная недостаточность, которая определяет тяжесть клинических проявлений заболевания, развитие осложнений и ухудшение прогноза. Нарушения иммунных механизмов отражаются в изменении процессов дифференцировки, пролиферации и адаптации клеток иммунной системы и, как следствие, снижением иммунного ответа, т.е. повреждением ведущей функции иммунной системы - защите организма от инфекционных агентов (Кондранина Т.Г. и др., 2010; 2012). При распространенных генитальных инфекциях наблюдается нарушение иммунореактивности, которое проявляется снижением количества Т-лимфоцитов, изменением В-лимфоцитов в циркулирующих комплексах, снижением фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов, уменьшением способности NK-клеток активироваться под действием интерферона (IFN), который, в ответ на воздействие индукторов (вирусы, хламидии) подавляет внутриклеточные этапы репродукции инфекции. Доказано, что вирусы могут поражать не только клетки эпителия, но и непосредственно дендритные клетки. Продукция IFN первого типа снижается при поражении дендритных клеток вирусами, что приводит к персистенции инфекции (Курбанова Д.Ф., 2014).
Для оценки тяжести в очаге воспаления большое значение имеет исследование иммунного гомеостаза на локальном уровне. Однако изучение нарушений на системном уровне не менее актуально в отношении понимания патогенетических механизмов ГВЗПМ, а также интерпретации эффективности выбранных методов лечения.
Для оценки нарушений иммунного гомеостаза на системном уровне при ГВЗПМ нами изучена экспрессия генов провоспалительных цитокинов IFN-g, IL-6, IL-10, а также факторов роста и дифференцировки Т- и В-лимфоцитов -IL-2, IL-4, IL-15, IL-18. Материалом для исследования являлась периферическая кровь, полученная из локтевой вены обследуемых пациенток в день операции и через 60 дней после ее проведения.
У больных с ГВЗПМ наиболее выраженные нарушения были установлены при оценке экспрессии генов IL-4 и IL-8. При этом уровень экспрессии гена IL-8 в МНК периферической крови у больных достигал 1,5% от значений в контрольной группе, тогда как гена IL-4 - не превышал 0,4% (р 0,002).
Кроме того, установлена достоверная разница различий в концентрации мРНК IFN-g и IL-10 в МНК пациенток с ГВЗПМ. При этом уровень экспрессии гена IFN-g был увеличен в 2,6 раза в сравнении с показателями в контрольной группе (р 0,01). В то же время, продукция мРНК IL-10 (противовоспалительный цитокин Th2 типа) составила лишь 51% от уровня экспрессии этого гена у здоровых женщин (р 0,002).
Через 60 дней после малоинвазивного хирургического вмешательства отмечено значимое изменение, а при оценке ряда генов - восстановление интенсивности их экспрессии до уровней здоровых пациенток. Так в мононукле-арных клетках крови пациенток после лечения достоверно возросло содержа 141 ниє мРНК IL-4), IL-8 и IL-15 (р 0,001). Одновременно зарегистрировано достоверное уменьшение количества мРНК IFN-g и IL-12 в МНК (р 0,03). Одновременно наблюдали относительно полную нормализацию экспресии IL-8 и IL-15. При этом уровень продукции IFN-g, несмотря на его некоторое снижение после лечения, превышал нормативные величины почти в 2 раза (р 0,01). Концентрация мРНК IL-4 увеличилась в 10 раз, тем не менее, оставалась на сравнительно низких значениях, не превышая 9% от его уровня в МНК периферической крови женщин контрольной группы (р 0,02). В то же время продукция мРНК IL-10 после малоинвазивного хирургического вмешательства достоверно не изменилась и составила приблизительно 60% от нормативных параметров. Экспрессия генов IL-2, IL-6, IL-18 после лечения не претерпела существенных изменений.
Анализ полученных результатов показал, что после малоинвазивного хирургического вмешательства произошла «смена» провоспалительного характера продукции цитокинов на умеренно-провоспалительный. В частности, соотношение уровней мРНК IFN-g/IL-Ю, которое до лечения достоверно превышало нормативные значения в 4,4 раза, после завершения комплексной терапии уменьшилось в 2,4 раза (р 0,04). В то же время, это соотношение по-прежнему значительно отличалось от аналогичного в контрольной группе пациенток (р 0,02). Соотношение уровней продукции генов IL-12/IL-10 в МНК женщин с ГВЗПМ было достоверно выше, чем в норме (в 2,7 раза, р 0,04). Спустя 60 дней после малоинвазивного хирургического вмешательства указанное соотношение уменьшилось в 1,6 раза, хотя и было повышено в сравнении с нормативными параметрами - в 1,8 раза. Достоверные изменения обнаружил и анализ соотношений концентраций мРНК IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, что подтверждает гипотезу об изменении характера продукции цитокинов Thl и Th2 типов после патогенетического лечения больных с ГВЗПМ.
Таким образом, анализ результатов выполненного исследования убежда 142 ет, что у пациенток с ГВЗПМ в периферической крови наблюдается экспансивный характер провоспалительных изменений продукции цитокинов, а также активация лимфоцитов Thl-типа при одновременном снижении активности лимфоцитов Т1і2-типа. Однако уже спустя 60 дней после малоинвазивного хирургического вмешательства происходит смена провоспалительного характера продукции цитокинов на умеренно-провоспалительный.