Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Роль повторных неудач имплантации в структуре неблагоприятных исходов программ экстракорпорального оплодотворения 10
1.2. Место клеточных технологий в современной клинической практике 21
1.3. Возможности клеточной терапии с использованием стволовых клеток эндометриального происхождения 24
1.4. Роль стволовых клеток в физиологии репродуктивной системы. 31
1.5. Роль клеточных технологий в терапии гинекологических заболеваний 34
Глава 2. Материалы и методы 41
2.1. Материалы исследования 41
2.2. Методы исследования 44
2.2.1 Методы, используемые в клинической части исследования 44
2.2.2. Методы, используемые в экспериментальной части исследования 53
Глава 3. Результаты собственных исследований 67
3.1. Результаты клинической части исследования 67
3.1.1. Клинико-анамнестическая характеристика женщин с повторными неудачами в программах ЭКО 67
3.1.2. Данные гистологического исследования эндометрия пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО в зависимости от исхода последующей программы ЭКО 76
3.1.3. Данные иммуногистохимического исследования эндометрия пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО в зависимости от исхода последующей программы ЭКО 79
3.1.4. Характеристика диагностических и лечебных мероприятий, проводимых в рамках прегравидарной подготовки у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО 85
3.1.5. Характеристика циклов ВРТ у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО 89
3.1.6. Разработка математической модели для прогнозирования эффективности программ лечения бесплодия у пациенток с повторными неудачами в циклах ЭКО 92
3.2. Результаты экспериментальной части исследования 95
3.2.1. Результаты выявления маркеров стволовых клеток в имплантатах аутологичного эндометрия после локального и системного введения клеточного продукта 95
3.2.2. Особенности влияния эндометриальных стволовых клеток на характеристики поврежденного эндометрия при локальном введении клеточного продукта 97
3.2.3. Особенности влияния эндометриальных стволовых клеток на характеристики поврежденного эндометрия при системном введении клеточного продукта 105
3.2.4. Сравнительная характеристика влияния эндометриальных стволовых клеток на поврежденный эндометрий при локальном и системном введении клеточного продукта 112
Глава 4. Обсуждение результатов 117
Выводы 131
Практические рекомендации 133
Список используемых сокращений 135
Список литературы 136
Список иллюстративного материала 169
- Возможности клеточной терапии с использованием стволовых клеток эндометриального происхождения
- Клинико-анамнестическая характеристика женщин с повторными неудачами в программах ЭКО
- Характеристика диагностических и лечебных мероприятий, проводимых в рамках прегравидарной подготовки у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО
- Особенности влияния эндометриальных стволовых клеток на характеристики поврежденного эндометрия при системном введении клеточного продукта
Введение к работе
Актуальность проблемы. Ежегодно в России регистрируется более 80
тысяч первичных обращений по поводу женского бесплодия (Росстат, 2015).
Количество проводимых программ вспомогательных репродуктивных
технологий (ВРТ) за последние 10 лет увеличилось в четыре раза и составляет около 75 тысяч в год (Calhaz-Jorge C., de Geyter C., Kupka M.S.; ESHRE, 2016). В среднем, частота наступления беременности, несмотря на постоянное совершенствование методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 31% в расчете на один цикл, причем этот показатель не имеет тенденции к увеличению (Петров Ю.А., 2015; Казачков Е.Л., 2014; De Geyter С., 2015). В то же время повторные неудачи протоколов ЭКО, по данным различных авторов, встречаются у 10% - 52% женщин (Ejzenberg D., 2016; Coughlan С., 2013; Polanski L.T., 2014). При исключении роли эмбриологической составляющей рецептивность эндометрия признается основным фактором, обеспечивающим фазовую трансформацию, децидуализацию эндометрия и определяющим вероятность наступления беременности, в том числе у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО (Coughlan С., 2014; Timeva T., 2014).
Рецептивность эндометрия могут компрометировать изменения в общесоматическом статусе (Занозин А.С., 2016; Comstock I.A., 2017), заболевания матки и внутриматочные вмешательства (Di Pietro С., 2013; Savasi V., 2013; Moreno I., 2016). Независимо от природы повреждающего фактора реакция эндометрия имеет универсальный характер, альтерация структурных компонентов эндометрия сопровождается фиброзом стромы, дефицитом специализированных клеток и развитием функциональной недостаточности эндометрия (Борова, М.Г., 2016; Колесникова Л.И., 2013; Сухих Г.Т., 2010). Аналогичная реакция эндометрия наблюдается и при развитии хронического эндометрита (ХЭ), который сопровождает до 60% случаев повторных неудач в программах ЭКО (Chen Y.Q., 2016; Park H.J., 2016; Bouet P.E., 2016; Kitaya К., 2016). Существующие в настоящее время терапевтические подходы, включая
комплексные хирургические и консервативные, комбинированные
гормональные методы, не обеспечивают восстановления функциональной полноценности эндометрия (Fatemi H.M., 2009; Oliveira F.G., 2003), и, в таком случае, программа суррогатного материнства рассматривается в качестве единственной альтернативы преодоления бесплодия (Beier К., 2015; Machtinger R., 2017; Testa G., 2017).
Накоплен опыт многочисленных исследований и эффективного
клинического использования клеточных технологий на основе аутологичных
мезенхимальных стволовых клеток (СК), выделенных, преимущественно, из
костного мозга, при патологических процессах в различных тканях и органах
(Grosicki S., 2015; Zhao D., 2015; Hawkey C.J., 2015; Oh K.W., 2015). В 2007 году
были выделены из менструальной крови и идентифицированы эндометриальные
стволовые клетки (ЭСК), обладающие свойствами мезенхимальных СК (Verdi J.,
2014; Jiang Z., 2013; Gargett C.E., 2009). В физиологических условиях
менструального цикла и послеродового периода именно резидентные СК
обеспечивают регенерацию эндометрия (Gargett C.E, 2012; Maruyama T., 2010;
Taylor H.S., 2004). Появились сообщения о возможности их использования на
модельных животных для лечения мышечной дистрофии Дюшенна, болезни
Паркинсона, ишемического повреждения миокарда и конечностей, сердечной
недостаточности, сахарного диабета (Ichim T.E., 2010; Wolff E.F., 2011; Li H.Y.,
2010), также описаны частные случаи применения ЭСК в клинической практике
при экстрагенитальных заболеваниях (Murphy M.P., 2008; Ichim T.E., 2010;
Zhong Z., 2009) и несостоятельности эндометрия (Tan J., 2016). Биологическая
целесообразность, безопасная неинвазивная методика получения
трансплантационного материала из менструальной крови позволяет
рассматривать клеточную терапию на основе ЭСК в качестве перспективного резерва для обеспечения регенеративных процессов в поврежденном эндометрии и восстановления его структурно-функциональной полноценности (Земелько В.И., 2011; Gargett C.E., 2016; Simon C., 2011).
Цель исследования: изучить структурно-функциональные особенности эндометрия у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО и определить подходы к восстановительной терапии с использованием клеточных технологий.
Задачи исследования:
-
Определить структуру заболеваний эндометрия у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО.
-
Оценить значение инвазивных внутриматочных вмешательств у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО в отношении результативности последующей программы ЭКО.
-
Определить функциональные, морфологические и молекулярно-биологические особенности эндометрия женщин с повторными неудачами в программах ЭКО.
-
Разработать прогностическую модель эффективности программы ЭКО у женщин с повторными неудачами ЭКО на основе выделенных параметров структурно-функционального состояния эндометрия.
-
На модельных животных в хроническом опыте оценить характер влияния клеточной терапии на основе эндометриальных стволовых клеток относительно восстановления структурно-функциональных характеристик поврежденного аутологичного эндометрия.
-
На модельных животных в хроническом опыте провести сравнительный анализ морфологических и иммуногистохимических характеристик поврежденного аутологичного эндометрия после локального и системного введения клеточного продукта на основе эндометриальных стволовых клеток.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования. На основе системного анализа структурно-функциональных особенностей эндометрия у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО впервые выделены молекулярно-биологические маркеры (CD138, CD16, CD56), являющиеся предикторами высокого риска отсутствия беременности у женщин с повторными
неудачами в программах ЭКО. Обозначены морфологические и
иммуногистохимические характеристики эндометрия, которые могут быть использованы в качестве кандидатных параметров для обоснованного выделения реципиентов клеточных продуктов среди женщин с повторными неудачами в программах ЭКО. Впервые в условиях хронического эксперимента изучено влияние клеточного продукта на основе ЭСК на поврежденный эндометрий. Показано, что действие клеточного продукта на основе ЭСК в поврежденном эндометрии реализуется за счет регулирования процессов репаративного ремоделирования ткани, вне зависимости от способа введения клеточного продукта. Определено, что локальное введение клеточного продукта на основе ЭСК обеспечивает наиболее выраженное терапевтическое воздействие на поврежденный эндометрий по сравнению с системным введением.
Практическая значимость работы. Предложен алгоритм обследования
пациенток с повторными неудачами программы ЭКО в анамнезе при
планировании протокола ЭКО. Обозначено влияние многократных
внутриматочных вмешательств, проводимых с диагностической и лечебной целью, на результативность программ ЭКО у женщин с повторными неудачами ЭКО. Определены морфологические характеристики эндометрия, которые являются фактором риска в отношении снижения результативности последующей программы ЭКО. Разработана математическая модель, позволяющая с высокой долей вероятности предсказать неблагоприятный исход программы ВРТ у женщины с повторными неудачами ЭКО.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Заболевания эндометрия имеют значительную распространенность в когорте женщин с повторными неудачами в программах ЭКО Наиболее часто (в 52,67% случаев) у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО диагностируется хронический эндометрит.
-
На основании логистического анализа показатели количественного содержания в эндометрии плазмоцитов CD138+, а также NK-клеток CD16+ и
CD56+ определены как кандидатные параметры для математической модели, позволяющей прогнозировать результативность программы ЭКО у женщин с повторными неудачами ЭКО.
3. Использование клеточного продукта на основе эндометриальных
стволовых клеток на модельных животных в хроническом эксперименте связано
со значительным уменьшением проявлений фиброзно-склеротических
процессов, обеспечением условий для микроциркуляции, а также изменением
клеточного состава стромального компонента эндометрия. Локальное введение
клеточного продукта ассоциировано с наиболее выраженными
морфологическими и иммуногистохимическими изменениями в поврежденном эндометрии.
Апробация работы и внедрение результатов работы в практику.
Материалы диссертационной работы доложены на XV всероссийской медико-
биологической конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и
клиническая медицина – человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2012; XVII
всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей
«Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье»,
Санкт-Петербург, 2014; XIX международной медико-биологической
конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2016; VII научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2016», Санкт-Петербург, 2016; на совещании Объединенного научного совета СПбНЦ РАН «Биология и фундаментальная медицина в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, 2016; международной конференции молодых ученых «Репродуктивная медицина: взгляд молодых - 2017», Санкт-Петербург, 2017.
Разработанные рекомендации по прегравидарному обследованию
пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО внедрены в практику отделения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) ФГБНУ «НИИ
акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта» и в учебный процесс кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
По теме диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе 5 – в рецензируемых журналах и изданиях, получено 2 патента.
Личный вклад автора в исследование. Экспериментальные исследования проведены совместно с сотрудниками ФГБУН «Институт цитологии РАН» в рамках гранта Министерства образования и науки Российской Федерации № 16.512.11.2190. Автор выполнил сбор клинического и экспериментального материалов, анализ и обобщение результатов исследований и статистическую обработку полученных данных.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с описанием материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 53 отечественных и 247 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 24 рисунками.
Возможности клеточной терапии с использованием стволовых клеток эндометриального происхождения
Первые данные о присутствии в эндометрии клеток со свойствами стволовых были получены в 2004 году. В изолированных обогащенных культурах эпителиальных и стромальных клеток эндометрия были обнаружены отдельные клетки, способные образовывать клеточные колонии [89]. Высокий пролиферативный потенциал и способность к самообновлению клеток этих колонии послужили основанием для дальнейшего изучения этих клеточных популяций. Далее было показано, что клетки из колоний стромального происхождения являются мультипотентными и могут дифференцироваться в адипоциты, хондробласты, миоциты и остеобласты при культивировании в определенных индукционных средах. А клетки из колоний эпителиального происхождения могут при дальнейшем культивировании образовывать структуры, напоминающие эндометриальные железы [207]. Все описанные свойства характерны для стволовых клеток. Таким образом, в эндометрии доказано присутствие эпителиальных и эндотелиальных прогениторных клеток и стволовых клеток со свойствами мезенхимальных [189].
Стволовые клетки эндометрия обладают высоким пролиферативным потенциалом – одна клетка может воспроизвести до 61011 копий [138]. Клоногенность стволовых клеток стромы и эпителиального компонента эндометрия не меняется на протяжении менструального цикла, а также не зависит от гормональной активности эндометрия [245]. Клетки сохраняют генетическую стабильность после 40 пассажей, что свидетельствует об их низкой туморогенности [138]. Под действием специфического окружения in vivo или in vitro в среде, обогащенной факторами роста, эндометриальные стволовые клетки проявляют свою мультипотентность – дифференцируются в мио-, адипо-, остео- или хондрогенном направлениях [100, 152, 153]. В дополнение к перечисленным свойствам, эндометриальные стволовые клетки отличаются определенной иммунной привилегированностью. В реакции смешанной культуры лимфоцитов стволовые клетки, выделенные из менструальной крови, показывают умеренно слабый иммунный ответ [63, 138]. Это свойство позволяет изучать эндометриальные стволовые клетки в качестве алло- или ксенотрансплантата без учета иммунологического ответа организма [203].
Клетки-предшественницы, обнаруживаемые в эндометрии, гетерогенны по своей биологии: это и эпителиальные прогениторные клетки, и эндотелиальные прогениторные клетки, и мезенхимальные стволовые клетки [150]. Поверхностные молекулы-маркеры не только выделяют стволовые клетки от других клеток ткани, но и определяют их происхождение, а также направление и степень дифференцировки. Все прогениторные клетки, обнаруживаемые в эндометрии, экспрессируют факторы плюрипотентности - Sox-2, Oct-4 и Nanog [61, 138, 250].
Мезенхимальные стволовые клетки эндометрия стромального происхождения синтезируют маркеры, обычно используемые для детекции стволовых клеток костномозгового происхождения - CD9, CD13, CD14, CD29, CD31, CD44, CD73, CD90, CD105, CD117, CD133, CD146 [207, 231, 284]. G-белок сопряженный рецептор-49 (GPR49, также известный как Lgr-5) обнаруживается в эпителиальных прогениторных клетках эндометрия и в клетках стромы [142]. Каждый из перечисленных маркеров мехенхимальных стволовых клеток является неспецифическим для подтверждения присутствия эндометриальных стволовых клеток, поэтому для их выявления используется одновременное определение нескольких поверхностных сигнальных молекул [284]. В качестве специфического маркера стволовых клеток эндометрия может использоваться коэкспрессия двух периваскулярных факторов CD140b и CD146 [244]. Другим специфическим маркером мезенхимальных стволовых клеток эндометрия является сочетание рецептора к тромбоцитарному фактору роста (PDGF-R) и поверхностной молекулы CD146 [137, 244, 250, 284]. Клетки, несущие на своей поверхностной мембране данное сочетание молекул, являются мультипотентными, дифференцируются в разных направлениях в пределах мезодермального зародышевого листка листка (остео-, хондро-, миогенном). Более подробное изучение клеток с данным сочетанием маркеров привело к открытию другого специфического, но при этом самодостаточного маркера – молекулы W5C5 [55, 250].
Кроме того, мезенхимальные стволовые клетки эндометриального происхождения экспрессируют на своей поверхности молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) первого класса и не экспрессируют молекулы второго класса МНС [250], что обеспечивает им низкую иммуногенность и наделяет иммуномоделирующими свойствами [63, 127, 139, 250, 284]. Эта особенность молекулярной биологии мезенхимальных стволовых клеток эндометриального происхождения объясняет отсутствие необходимости в подавлении иммунного ответа экспериментального животного. По этой причине эксперименты с использованием эндометриальных стволовых клеток в качестве ксенотрансплантата могут проводиться на иммунокомпетентных особях [3, 137, 164, 284]. Другой особенностью организации экспериментальных работ с использованием эндометриальных стволовых клеток является то, что с целью подтверждения терапевтической компетентности клеточного продукта в контрольных экспериментальных группах применяется стандартизированное введение заведомо терапевтически нейтрального вещества, которое чаще всего представляет собой фосфатно-солевой буфер [3, 137, 164, 284]. Лишь в одной работе с целью оценки иммунологической составляющей терапевтического эффекта стволовых клеток использовался контрольный ксенотрансплантат суспензия фибробластов человеческого происхождения [284]. Продолжительность жизни трансплантированной клетки в организме животного-реципиента может быть отслежена путем детекции иммунофлюоресцетных белков, которые используется в качестве метки. Эндометриальные стволовые клетки человека выявлялись в образцах ткани миокарда экспериментальных животных через 4 недели после внутрижелудочкового введения клеточного продукта, в образцах ткани мозга - через 5 недель после интракраниальной трансплантации, а в образцах ткани экспериментально поврежденных яичников – через 2 месяца после внутривенного введения суспензии стволовых клеток [3, 137, 164]. Меченые эндометриальные стволовые клетки человеческого происхождения выявлялись в образцах тканей яичников мышей-реципиентов на 14 день после локального введения клеточного продукта. При этом, в тканях животных, получавших аналогичную терапию суспензией меченых фибробластов человеческого происхождения, на 14 день после трансплантации иммунофлюоресцентные метки не обнаруживались [284]. Перечисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что ксеногенные стволовые клетки эндометриального происхождения могут длительно сохранять свою жизнеспособность в различных тканях иммунокомпетентных животных.
Культуру эндометриальных стволовых клеток можно получить несколькими путями. Стволовые клетки можно выделить из эндометрия, полученного в ходе любой инвазивной внутриматочной процедуры: выскабливания или вакуум-аспирации полости матки, а также штрих-биопсии эндометрия и биопсии с использованием урогенитального зонда типа Пайпель [110, 153, 205, 239]. Столовые клетки обнаруживаются в биоптатах эндометрия женщин не только репродуктивного возраста, но и в состоянии постменопаузы [205]. Важной отличительной чертой мезенхимальных эндометриальных стволовых клеток является то, что они десквамируются вместе с функциональным слоем во время менструации и могут быть обнаружены в менструальной крови. Эпителиальные прогениторные клетки не обнаруживаются в менструальной крови или обнаруживаются в несравненно меньшем количестве [132]. Объяснением этому факту служат различия в локализации обсуждаемым клеток-предшественниц: мезенхимальные стволовые клетки обнаруживаются и в базальном, и в функциональном слоях эндометрия, и в составе функционального слоя отторгаются во время менструации. Резидентные прогениторные клетки, дающие начало эпителиальному ростку, локализуются в железах базального слоя эндометрия, и в норме в менструальных выделениях не должны присутствовать. Существует несколько протоколов по выделению стволовых клеток из менструальной крови [18, 24, 153, 189], а также ряд методик по подтверждению природы выделенных клеток [89, 153, 244], следуя которым можно без проведения инвазивных манипуляций и длительной стимулирующей терапии получить достаточный объем мезенхимальных столовых клеток.
Клинико-анамнестическая характеристика женщин с повторными неудачами в программах ЭКО
С целью решения поставленных задач была обследована 131 женщина с повторными неудачами в программе ЭКО, основную группу составили женщины с отсутствием беременности после проведенной программы ЭКО (n=81), группу сравнения составили женщины с наступившей в результате ЭКО и эхографически подтвержденной беременностью (n=50).
Средний возраст женщин основной группы составил 34,47±0,5 года, женщин группы сравнения - 33,2±0,97 года (р=0,56). Несмотря на отсутствие достоверных различий в возрасте пациенток сравниваемых групп, возраст женщины при вступлении в программу ЭКО старше 35 лет оказался независимым фактором риска неблагоприятных исходов программ ЭКО (OR 2,29, 95%CI 1,05-5,02).
По количественным и качественным характеристикам менструального цикла пациентки сравниваемых групп достоверно не отличались (таблица 6).
На каждую женщину основной группы с искусственным прерыванием беременности в анамнезе пришлось в среднем по 1,94±0,41 артифициальному аборту, на каждую пациентку из группы сравнения – по 1,24±0,14 аборту (р=0,11). Медикаментозное прерывание беременности использовалось в обеих группах одинаково редко: в 5,0% случаев в группе с отсутствием беременности и в 5,88% случаев среди пациенток с наступившей беременностью (р=0,91).
Пациентки с повторными неудачами в программах ЭКО имели высокую распространенность гинекологических заболеваний (таблица 8).
Воспалительные заболевания органов малого таза диагностировались у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО наиболее часто.
Эндометриоз представлял собой второе по частоте гинекологическое заболевание у обследованных пациенток: у 56,79% пациенток основной группы и у 50,0% пациенток группы сравнения (р=0,45). Распространенность наружного генитального эндометриоза в большинстве случаев соответствовала I – II степени (в 73,33% случаев в основной группе и в 64,29% случаев в группе сравнения, р=0,55). Статистически значимых различий в отношении частоты встречаемости гинекологических заболеваний у пациенток двух сравниваемых групп выявлено не было (таблица 8).
Встречаемость инфекций, передающихся половым путем, в анамнезе у пациенток сравниваемых групп статистически не различалась (рисунок 5).
На момент вступления в текущий протокол программы ЭКО каждая пациентка имела в анамнезе несколько внутриматочных вмешательств, которые производились с диагностической или лечебной целью. У 41,22% пациенток, включенных в исследование, в анамнезе имелись указания на заболевания полости матки, у 16,03% пациенток патологические изменения эндометрия были сочетанными (рисунок 6).
Хронический эндометрит был самой частой патологией эндометрия, встречающейся в анамнезе у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО. Встречаемость хронического эндометрита в анамнезе у пациенток основной группы была достоверно выше (р=0,03). Полипы эндометрия, гиперплазия эндометрия и внутриматочные синехии встречались с меньшей частотой, при отсутствии достоверных межгрупповых различий (р=0,48, р=0,29 и р=0,48 соответственно) (рисунок 6).
Вопрос о роли повторных внутриматочных вмешательств у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО рассмотрен отдельно. На каждую пациентку, включенную в исследование, пришлось в среднем по 4,29±0,21 малоинвазивному внутриматочному вмешательству и по 1,85±0,1 процедуре выскабливания полости матки. Сравнительный анализ количества выполненных внутриматочных процедур по группам представлен на рисунке 7.
На каждую пациентку основной группы пришлось в среднем по 5,79±0,3 внутриматочных вмешательства, на каждую пациентку группы сравнения - по 4,57±0,33 (р=0,008). Группы различались преимущественно по количеству малоинвазивных вмешательств (р=0,03) (рисунок 7). Проведенный корреляционный анализ показал наличие достоверной отрицательной связи между количеством внутриматочных вмешательств (в том числе малоинвазивных и диагностических) и эффективностью программы ЭКО (R=-0,21, р=0,013). Каждая внутриматочная манипуляция дополнительно уменьшала эффективность циклов ЭКО в среднем на 6,31%. Было установлено, что наличие более трех внутриматочных вмешательств в анамнезе у женщины с повторными неудачами в программах ЭКО являлось независимым фактором риска отсутствия беременности после проведенной программы ВРТ (OR 2,20; 95%CI 1,06-4,56).
Операции на органах малого таза имелись в анамнезе у 64,12% пациенток (у 66,67% пациенток основной группы и у 60,0% пациенток группы сравнения, р=0,44) (таблица 9).
Острые состояния, включавшие внематочную беременность, геморрагическую форму апоплексии яичников и разрывы кист яичников, явились показанием для оперативного лечения в 54,76% случаев (в 48,15% случаев в основной группе и в 66,67% случаев в группе сравнения, р=0,10). Достоверных межгрупповых различий по количеству и объему проведенных оперативных вмешательств выявлено не было (таблица 9).
Длительность бесплодия включенных в исследование пациенток на момент обращения в клинику в среднем составила 5,04±0,4 года (4,92±0,56 года для пациенток основной группы и 5,25±0,52 лет для пациенток группы сравнения, р=0,69). Каждая пациентка на момент включения в исследование уже имела опыт лечения бесплодия и чаще - с использованием нескольких методов (таблица 10).
Контролируемая стимуляция овуляции в качестве метода лечения ановуляторного бесплодия использовалась у 28 пациенток: у 16 (19,75%) пациенток основной группы и у 12 (24%) пациенток группы сравнения. Метод искусственной инсеминации спермой мужа или донора использовался у 19 пациенток: у 14 (17,28%) пациенток основной группы и у 5(10%) пациенток группы сравнения. На каждую из этих пациенток приходилось в среднем по 2,05±0,29 процедуры искусственной инсеминации. Лишь у двух женщин основной группы в результате процедур искусственной инсеминации наступила беременность. Согласно критериям включения в исследование, все пациентки имели в анамнезе минимум 2 программы ЭКО. На каждую пациентку основной группы пришлось в среднем по 2,51±0,15 программы ЭКО (ЭКО+ICSI) и по 0,7±0,1 цикла с переносом криоконсервированных эмбрионов. На каждую пациентку группы сравнения пришлось в среднем по 2,12±0,16 программы ЭКО (ЭКО+ICSI) (р=0,21) и по 0,68±0,1 цикла с переносом в полость матки криоконсервированных эмбрионов (р=0,48). Частота наступления беременности после программ ЭКО составляла 5,50% в расчете на процедуру переноса эмбрионов (5,38% для пациенток основной группы и 5,71% для пациенток группы сравнения), ни одна из наступивших беременностей не завершилась родами (таблица 10).
Среди сопутствующих экстрагенитальных заболеваний у пациенток с повторными неудачами ЭКО наибольшее распространение имели врожденные и приобретенные тромбофилии, заболевания щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит, гипофункция щитовидной железы), а также ожирение. Заболевания органов дыхания (бронхиальная астма, хронический бронхит), мочевыделительной системы (мочекаменная болезнь, хронический пиелонефрит), желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит) встречались реже (рисунок 8).
Характеристика диагностических и лечебных мероприятий, проводимых в рамках прегравидарной подготовки у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО
Проведен анализ влияния методов прегравидарной подготовки на эффективность лечения бесплодия с использованием ВРТ у пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО.
В рамках подготовки к программе ВРТ части пациенток с повторными неудачами ЭКО проводилась процедура гистероскопии. Показаниями для проведения гистероскопии явились: патологические изменения полости матки по данным ультразвукового исследования, наличие в анамнезе процедур кюретажа полости матки, а также оперативных вмешательств на матке с проникновением в полость матки. Гистероскопическая оценка состояния полости матки была проведена у 63 пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО (таблица 16).
Среди пациенток, которым в рамках подготовки к последующей программе ВРТ проводилась гистероскопия, внутриматочные синехии были диагностированы у 15,87%, полипы эндометрия - у 15,87%, аномалия развития матки (седловидная матка) - у 6,35%, аденомиоз – у 6,35% женщин. Проведение в процессе гистероскопии рассечения внутриматочных синехий или полипэктомии ассоциировалось с увеличением вероятности наступления беременности в результате последующей программы ЭКО (OR 4,23, 95%CI 1,04- 17,21 и OR 1,80, 95%CI 0,71-4,52 соответственно). Хирургической коррекции диагностированных седловидной деформации матки и аденомиоза не проводилось (таблица 16). У всех пациенток процедура гистероскопии сопровождалась биопсией эндометрия.
Таким образом, патологическая гистероскопическая картина была выявлена у 44,44% пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО. Эффективность последующей программы ВРТ после хирургического лечения выявленных изменений полости матки составила 50,0%. У пациенток, в ходе гистероскопии у которых не было диагностировано какой-либо патологических изменений полости матки и была лишь произведена биопсия эндометрия, беременность наступила в 41,86% (р=0,42). Корреляционный анализ показал, что проведение гистероскопии в рамках подготовки к программе ЭКО у пациенток с повторными неудачами ЭКО имеет достоверную положительную связь с частотой наступления беременности (R=0,23, p=0,012).
В связи с тем, что процедура биопсии эндометрия могла оказывать влияние на рецепторные и имплантационные характеристики эндометрия, нами был проведен анализ зависимости частоты наступления беременности после программ ЭКО от продолжительности промежутка времени, прошедшего с момента биопсии эндометрия (из анализа были исключены пациентки с диагностированными полипами эндометрия, железистой гиперплазией и внутриматочными синехиями) (таблица 17).
Проведенный анализ не выявил зависимости исходов программ ЭКО от времени, прошедшем между контролируемым повреждением эндометрия и началом цикла лечения бесплодия с использованием ВРТ (таблица 17).
Следующий этап прегравидарной подготовки пациенток с повторными неудачами в программах ЭКО состоял из медикаментозной коррекции морфологически верифицированных патологических изменений эндометрия. Из 88 пациенток с выявленной патологией полости матки (51 женщина основной группы и 37 женщин группы сравнения) консервативное лечение получили 50 пациенток (30 пациенток основной группы и 20 пациенток группы сравнения). Показанием для назначения терапии в 86% случаев послужил хронический эндометрит. В таблице 18 приведены данные, отражающие влияние комплексной терапии хронического эндометрита (а также отдельных компонентов лечебной схемы) на результативность программы ЭКО.
Проведенный корреляционный анализ показал, что терапия хронического эндометрита, проводимая в рамках подготовки к программе ВРТ, вне зависимости от используемых методов лечения, не имела положительной связи с частотой наступления клинической беременности после программ ЭКО (R=0,017, p=0,85) (таблица 18).
Таким образом, обследование с включением гистологического и иммуногистохимического исследования эндометрия, а также оценки состояния полости матки под контролем гистероскопической оптики позволило выявить патологические изменения эндометрия у преобладающего большинства женщин с повторными неудачами в программах ЭКО. Обнаружение в образцах эндометрия мононуклеарной инфильтрации, фибропластических изменений стромы, а также увеличения количества плазмоцитов и натуральных киллеров CD16+ и CD56+, которые рассматриваются в качестве морфологических проявлений хронического воспаления в ткани эндометрия, отрицательно коррелировало с частотой наступления беременности после проведенной программы ЭКО. Комплексное консервативное лечение хронического эндометрита не показало положительной корреляции с результативностью программы ВРТ у женщин с повторными неудачами в программах ЭКО.
Особенности влияния эндометриальных стволовых клеток на характеристики поврежденного эндометрия при системном введении клеточного продукта
У экспериментальных животных после системного введения клеточного продукта оценка терапевтического влияния эндометриальных стволовых клеток производилась в те же сроки и с использованием тех же характеристик, что и в группе животным с локальным введением клеточного продукта (таблица 26).
Состояние имплантатов экспериментальных животных на 10 день после системного введения плацебо в большинстве своем характеризовалось гиперемией умеренной степени, также имелись образцы ткани с выраженной степенью гиперемии. У животных после системного введения клеточного продукта в зоне имплантированного эндометрия реактивность ткани проявлялась преимущественно гиперемией умеренной степени, и меньшее число образцов имплантатов имело выраженную гиперемию (таблица 26). Распространенность спаечного процесса у животных после системного введения клеточного продукта или плацебо сохранялась и была одинаково выражена. Однако у животных, получивших системное введение плацебо, наблюдались плоскостные утолщенные спайки между париетальной брюшиной и зоной имплантации эндометрия, вызывающие неравномерную деформацию передней брюшной стенки в зоне имплантации и по ее периферии. А у животных после системного введения клеточного продукта наблюдалась тенденция к стабилизации спаечного процесса, представленного в основном рыхлыми спайками между петлями тонкой и толстой кишки (таблица 26). Признаки организации фибрина в виде островковых пленок фибрина на поверхности имплантата были выявлены лишь у одного животного после системного введения клеточного продукта. Тогда как у половины животных после системного введения плацебо на значительной площади в зоне имплантации и по ее периферии, по ходу послеоперационного рубца и в области спаек между петлями тонкой и толстой кишки были выявлены отложения фибрина, представленные рыхлой или плотной рубцовой тканью, вызывающей выраженную деформацию передней брюшной стенки. Форма имплантатов у животных после системной трансплантации клеточного продукта, как правило, сохранялась. У животных после системного введения плацебо на фоне рубцовой деформации передней брюшной стенки чаще наблюдались имплантаты неправильной формы. В подавляющем большинстве наблюдений имплантаты эндометрия животных после системного введения клеточного продукта или плацебо, так же, как и имплантаты животных после локального введения клеточного продукта или плацебо, отличались от окружающих тканей по цвету и толщине, но в динамике имелась тенденция к увеличению случаев возвышения имплантатов над поверхностью брюшины (таблица 26).
С целью проведения гистологического исследования было получено 70 образцов имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных после системного введения клеточного продукта и 66 образцов имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных после системного введения плацебо (таблица 27).
Эндометриальные железы сохранялись в большинстве образцов имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных после системного введения клеточного продукта или плацебо, при этом в имплантатах животных после системного введения плацебо отмечалось невыраженное снижение количества эндометриальных желез. Частота обнаружения щелевого промежутка между имплантатом и подлежащей брюшиной снижалась как после системного введения стволовых клеток, так и после введения плацебо. Уменьшение размеров и частоты обнаружения щелевидного пространства между имплантатом и подлежащей брюшиной рассматривалось как естественное течение имплантации образца ткани эндометрия (таблица 27). Системное введение клеточного продукта и системное введение плацебо ассоциировалось с уменьшением количества воспалительных инфильтратов образцах имплантатов. Менялся и состав инфильтратов: в образцах после системного введения клеточного продукта снижалась частота обнаружения плазмоцитов в составе смешанно-клеточных инфильтратов (рисунок 19). Отек стромы имплантированного эндометрия увеличивался после системного введения клеточного продукта, тогда как введение плацебо коррелировало со снижением выраженности отека. Разнонаправленную тенденцию имел признак «очаговый фиброз стромы»: системное введение клеточного продукта было связано с частичным разрешением очагового фиброза стромы, а системное введение плацебо приводило к усилению процессов фиброзирования (рисунок 20). Та же динамика наблюдалась и в отношении изменений, связанных со склерозом стенок спиральных артерий. Стаз эритроцитов в спиральных артериях частично разрешался как после системного введения суспензии стволовых клеток, так и после системного введения плацебо, в группе после введения клеточного продукта изменения данного показатели было выражены интенсивнее (таблица 27).
Для проведения иммуногистохимического исследования было получено 70 образцов имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных после системного введения клеточного продукта и 66 образцов имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных после системного введения плацебо (таблица 28).
После системного введения клеточного продукта и плацебо наблюдалось повышение относительной плотности экспрессии маркеров цитотоксических NK-лимфоцитов CD 16+ в образцах имплантатов аутологичного эндометрия, при этом системное введение суспензии стволовых клеток было ассоциировано с достоверным увеличением относительной площади экспрессии маркера CD 16 (р=0,000034) (рисунки 21, 23). Экспрессия маркера CD56 в образцах животных после системного введения клеточного продукта и плацебо имела отрицательную динамику без достоверных различий между группами (рисунки 22, 24, таблица 28).
Таким образом, макроскопическая оценка, а также данные гистологического и иммуногистохимического исследований имплантатов аутологичного эндометрия экспериментальных животных показали, что системное введение суспензии стволовых клеток было ассоциировано с достоверным снижением выраженности очагового фиброза стромы (р 0,0001) и склеротических изменений стенок спиральных артерий (р=0,006), а также с существенным уменьшением содержания плазматических клеток в составе воспалительных инфильтратов (р=0,055) в образцах имплантатов аутологичного эндометрия. Кроме того, было отмечено достоверное увеличение экспрессии маркера CD 16 в образцах имплантатов эндометрия при системном введении суспензии стволовых клеток (р=0,000034).