Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Теоретические и прикладные аспекты генетики структурных хромосомных перестроек (Обзор литературы) 12
1.1. Теоретические основы генетики структурных хромосомных перестроек. Факторы, влияющие на мейотическую сегрегацию хромосом. 12
1.2. Прикладные исследования, посвященные изучению патологии репродукции у носителей сбалансированных хромосомных перестроек . 21
1.3. Патология плаценты при хромосомных аномалиях у плода . 31
Глава II. Материалы и методы исследования. 37
2.1. Материалы исследования 37
2.2. Методы исследования
2.2.1. Общеклинические методы исследования 39
2.2.2. Лабораторно-инструментальные методы 42
2.2.3. Методы статистического анализа данных 50
Глава III. Результаты собственных исследований.
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика супружеских пар 52
3.2. Анализ течения и исходов беременности в различных группах 62
3.3. Аномалии развития плода и новорождённого у супружеских пар с носительством сбалансированных хромосомных перестроек 75
3.4. Оценка репрезентативности выборки. 83
3.4.1. Особенности фенотипических эффектов хромосомной перестройки при различной тендерной принадлежности носителя 83
3.4.2. Особенности фенотипических эффектов при различных типах структурных хромосомных перестроек
Глава IV. Обсуждение результатов. 96
Выводы. 122
Практические рекомендации. 123
Список сокращений 124
Список литературы 126
- Прикладные исследования, посвященные изучению патологии репродукции у носителей сбалансированных хромосомных перестроек
- Патология плаценты при хромосомных аномалиях у плода
- Общеклинические методы исследования
- Аномалии развития плода и новорождённого у супружеских пар с носительством сбалансированных хромосомных перестроек
Введение к работе
Актуальность данного исследования обусловлена высоким риском бесплодия, невынашивания беременности, рождения детей с врождёнными пороками развития (ВПР) и/или задержкой психомотороного развития (ЗГТМР) у супружеских пар, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек.
Популяционная частота сбалансированных структурных перестроек среди здоровых новорождённых составляет 0,522%, а среди пациентов с бесплодием и/или невынашиванием отмечается почти десятикратное её возрастание до 4,6-7% [Jacobs Р.А., 1992; Meza-Espinoza, 2008; McLachlan R.I., 2010]. Хромосомные аномалии (ХА), включая структурные хромосомные перестройки, выявляются у 28% антенатально погибших плодов с ВПР, а также в 48% случаев являются причиной медицинского прерывания беременности по заключению инвазивной пренатальной диагностики, [Dolk Н., 2010]. В России в 2012 году было впервые выявлено 266 000 случаев ВПР у детей от 0 до 14 лет (Федеральная служба государственной статистики, ). Не вызывает сомнений значительное влияние данной патологии на качество жизни пациентов и членов их семей, ощутимый вклад в показатели младенческой и детской смертности, необходимость больших финансовых затрат, а также усилий медицинских, социальных и образовательных учреждений.
Традиционной тактикой предотвращения хромосомных аномалий у потомства носителей сбалансированных хромосомных перестроек является инвазивная пренатальная диагностика кариотипа плода. Данный метод предполагает определение генотипа плода и, при обнаружении мутации, прерывание беременности по медицинским показаниям. Развитие преимплантационной генетической диагностики1 (ПГД) в последнее десятилетие
1 ПГД - совокупность методов выявления генных и геномных мутаций на преимплантационной стадии культивируемых in vitro эмбрионов, с целью селекции и пересадки женщинам эмбрионов без генной патологии [Verlinsky Y., 1996].
сделало возможным определение генотипа эмбриона до наступления клинической беременности.
В настоящее время метод ПГД широко применяется в клинике вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) индустриально развитых стран. В период с 1997 по 2010 годы в Европе был проведен 5491 цикл ВРТ с применением ПГД в связи с носительством сбалансированных хромосомных перестроек у одного из супругов, наступило 947 клинических беременностей [Harper J.C., 2012; Moutou С, 2014]. Однако, несмотря на успешное внедрение ПГД, накопленный опыт применения метода до настоящего времени не систематизирован. Эффективность ПГД с позиций медицины, основанной на доказательствах, остаётся неизвестной. Объём посвященных данной проблеме исследований не позволяет обосновать применение ПГД у супружеских пар, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек, в широкой клинической практике. Кроме того, до настоящего времени не определен оптимальный комплекс диагностических мероприятий на предимплантационном и пренатальном этапах, снижающий риск рождения ребёнка с генетической патологией при носительстве сбалансированных структурных хромосомных перестроек у одного из родителей.
Цель исследования Совершенствование помощи супружеским парам, отягощенным носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек в реализации репродуктивной функции с использованием современных технологий.
Задачи исследования 1. Представить сравнительную клинико-анамнестическую характеристику супружеских пар, отягощенных носительством различных сбалансированных структурных хромосомных перестроек;
-
Изучить особенности акушерского и репродуктивного анамнеза у супружеских пар, в которых один из супругов является носителем сбалансированных структурных хромосомных перестроек;
-
Изучить особенности течения и исходы беременности при различных способах её достижения у женщин из супружеских пар, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек;
-
Оценить риск потери беременности у супружеских пар, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек, при различных способах её достижения;
-
Изучить временной интервал наступления беременности у супругов, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек, при различных способах её достижения;
-
Изучить структуру и оценить риск аномалий развития у плодов и детей, родившихся у супругов, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек;
-
Представить алгоритм обследования супружеских пар, отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек, направленный на снижение риска неблагоприятных репродуктивных исходов.
Научная новизна
Представлена современная характеристика клинических проявлений патологии репродукции, а также их количественная структура, у пациентов со сбалансированными структурными хромосомными перестройками. Установлено, что применение ПГД у супружеских пар с носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек ассоциируется со снижением риска репродуктивных потерь по сравнению со спонтанной беременностью. Показано значительное укорочение временного интервала, затрачиваемого на достижение успешной беременности у данной группы пациентов.
Определены варианты аномалий фенотипа у потомства супругов,
отягощенных носительством сбалансированных структурных хромосомных
перестроек. Показан риск ВПР и/или ЗПМР у детей с нормальным или сбалансированным кариотипом, идентичным кариотипу фенотипически нормального родителя, а также с несбалансированным кариотипом с числовыми нарушениями по хромосомам, не участвующим в перестройке.
Показана предрасположенность к повторным случаям ВПР плода. Установлено, что ПГД способствует снижению риска ВПР и совместимых с жизнью хромосомных аномалий плода до общепопуляционного уровня у пациентов с исходно более высоким генетическим риском путём элиминации эмбрионов с несбалансированным хромосомным набором.
Практическая значимость
Проведен анализ современного состояния медико-генетического консультирования в репродуктивной медицине. Показан длительный период времени, затраченного на обследование и лечение патологии репродукции (до 20 лет) супружескими парами с носительством сбалансированных структурных хромосомных перестроек.
Определены и обоснованы расширенные показания для исследования кариотипа супружеской пары у пациентов с отягощенным репродуктивным анамнезом (один или более случай невынашивания беременности), направленные на активное выявление носителей сбалансированных структурных хромосомных перестроек.
Обосновано применение преимплантационной генетической диагностики, включающей анализ перестроенных хромосом и диагностику витальных трисомий, у носителей сбалансированных структурных хромосомных перестроек с первичным и вторичным бесплодием, привычным невынашиванием беременности, имевших в анамнезе случаи рождения детей (плодов) с несбалансированным кариотипом, ВПР и/или ЗПМР.
На основании изучения исходов беременностей, состояния детородной функции и синдромологического анализа потомства пациентов предложен
алгоритм обследования супружеских пар, отягощенных носительством
сбалансированных структурных хромосомных перестроек, направленный на снижение риска неблагоприятных репродуктивных исходов.
Положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Сбалансированные хромосомные перестройки являются причиной высокой частоты нарушений генеративной функции: первичного бесплодия, выкидышей I триместра, что часто обусловливает в последующем формирование вторичного бесплодия. В 12% случаев выявляются врождённые аномалии развития плода и новорожденного и задержка психомоторного развития ребенка.
-
Преимплантационная генетическая диагностика у носителей сбалансированных хромосомных перестроек ассоциируется со снижением риска репродуктивных потерь по сравнению со спонтанно наступившей беременностью в 2,54 раза и беременностью после вспомогательных репродуктивных технологий без преимплантационной генетической диагностики - в 2,75 раза.
Преимплантационная генетическая диагностика приводит к значительному (в 4,26 раза) уменьшению времени, затрачиваемого на достижение успешной беременности.
3. Носительство сбалансированных хромосомных перестроек ассоциируется
не только с риском рождения детей с несбалансированными хромосомными
аномалиями родительского происхождения (52,4% случаев), но и с
хромосомными аномалиями неродительского происхождения (19,0%),
врождёнными аномалиями моногенной и мультифакториальной этиологии
(28,6%).
Преимплантационная генетическая диагностика способствует снижению риска врожденных пороков развития и совместимых с жизнью хромосомных аномалий плода до общепопуляционного уровня у пациентов с исходно более высоким генетическим риском.
Личный вклад автора
Автор работы принимал активное участие в постановке цели и задач
настоящего исследования. Автором была составлена схема дизайна исследования,
разработан опросник для пациентов, карта исследования. Выполнен сбор анамнеза пациентов, в том числе, телефонное анкетирование.
Проведено консультирование супружеских пар, самостоятельно выполнены инвазивные пренатально-диагностические манипуляции, проведен осмотр и синдромальная диагностика новорождённых, а также плодов с ВПР на аутопсии.
Автором выполнен статистический анализ данных и сформулированы выводы исследования.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формулам специальностей 14.01.01 - «акушерство и гинекология» и 03.02.07 - «генетика». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальностей, конкретно пунктам 3 и 4 паспорта акушерства и гинекологии, и пункту 17 паспорта генетики.
Апробация работы
Основные положения работы представлены и получили одобрение на: Российско-немецком форуме по акушерству и гинекологии (Берлин, Die Akademie der Konrad-Adenauer-Stiftung, Vivantes Humboldt-Klinikum, 4-5 ноября 2011 г.), VIII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 6-9 декабря 2011 г.), конференции «Генетика мультифакториальных заболеваний» (Москва, 24 апреля 2013 г.), конференции «Невынашивание беременности: социальная проблема, медицинские решения» (Москва, 29 октября - 1 ноября 2013 г.), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в эпицентре женского здоровья» (Москва, 18 - 21 марта 2014 г.), XV Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 23 - 26 сентября 2014 г.).
Обсуждение диссертации состоялось на межклинической конференции (30
января 2014 г.) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «Научный центр
акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России (3 марта 2014 г.)
Внедрение результатов работы в практику
Результаты исследования используются в работе лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 142 страницах компьютерного текста. Работа состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель включает 152 источника цитируемых авторов, из них на русском языке - 22, на иностранных языках - 130.
Прикладные исследования, посвященные изучению патологии репродукции у носителей сбалансированных хромосомных перестроек
Во втором цикле из шести эмбрионов у трёх эмбрионов была выявлена частичная моносомия 22: 46,--, r(22)(pl0ql2), у одного эмбриона - мозаичная форма частичной трисомии 22 и частичной моносомии 22: 47,--,+del(22)(pl0ql2)/46, , del(22)(pl0ql2). У двух эмбрионов моносомия 22 сочеталась с другими аномалиями: моносомией 14, а также с кольцевой хромосомой 22 и делецией 22: 45,--,-22,del(22)(pl0ql2)r(22)(pl0ql2) [89].
Вариабельный уровень аберрантных гамет (от 0 до 37,85%) характерен также для мужского гаметогенеза при наличии инверсий. Полагают, что соотношение аномальных и сбалансированных типов хромосомного распределения зависит от длины перестроенного сегмента, отношения длины образующего перестройку, в том числе, инверсию, к длине несущей перестройку хромосомы. Чем меньше образующий перестройку сегмент, тем больше вероятность жизнеспособности гаметы. Чем больше длина аберрантного сегмента в сравнении с длиной целой хромосомы, тем больше вероятность кроссинговера с образованием несбалансированных рекомбинантных хромосом. Так, при инверсии сегмента, протяженность которого составила 11,93% длины целой хромосомы, гаметы с несбалансированными хромосомными аберрациями не выявлялись; а случаи инверсий сегментов, составивших 44,50% и 48,15% всей хромосомы соответственно, ассоциировались с 0,78% и 3,41% аберрантных сперматозоидов. У носителя инверсии сегмента, длина которого составила 88,24% всей хромосомы, частота несбалансированных гамет достигла 37,85% [123, 66].
Важное значение в регуляции мейотического поведения хромосом придают расположению перестроенного сегмента (в терминальной или интерстициальной области хромосомы). Согласно гипотезе Escudero T.et al., транслокация, образованная вследствие разрыва терминальных хромосомных сегментов, существенно затрудняет формирование квадривалента в профазе мейоза, тем самым способствуя аномальному расхождению хромосом [ПО]. Данное предположение подтвердилось в исследовании мейотического расхождения хромосом у носителей сбалансированных реципрокных транслокаций. При локализации разрывов, образующих реципрокную транслокацию, в терминальных участках хромосом преобладали аномальные типы сегрегации. У бластомеров с реципрокными транслокациями, расположенными в терминальных участках хромосом, нормальный или сбалансированный хромосомный набор выявлялся существенно реже, чем среди бластомеров, несущих интерстициальные реципрокные транслокации (6,5% против 14,4%, р=0,001). Точки разрыва транслокации считали расположенными терминально, если по крайней мере для одной из точек разрыва отношение длины образующего транслокацию сегмента к длине хромосомного плеча, в котором локализуется перестроенный сегмент, было меньше 0,2. В структуре аномальных типов мейотического расхождения различные его варианты (совместное-1, совместное-2, 3:1) были распределены равномерно как при терминальном, так и интерстициальном расположении точек разрывов хромосомных сегментов [90].
Одним из факторов, оказывающих влияние на мейотическое распределение хромосом, считают пол носителя. Межполовые различия частот аномальных типов распределения по сравнению с нормальным и/или сбалансированным были продемонстрированы для всех типов структурных хромосомных перестроек [86]. У женщины, носителя внутрихромосомной инсерции хромосомы 7, преобладали нормальные/ сбалансированные эмбрионы (76,5%), в то время как у её брата, носителя идентичной инсерции, нормальные/ сбалансированные эмбрионы составили лишь 36%. Причиной данных различий, возможно, является более высокая частота кроссинговера в центромерном сегменте хромосом ооцитов по сравнению с хромосомами сперматозоидов, что обеспечивает возможность корректирующего двойного кроссинговера в ооцитах [86]. Различная плотность упаковки хроматина ооцитов, вероятно, объясняет различную частоту рекомбинаций в женских и мужских половых клетках [134]. На животных моделях было показано преимущественное расхождение дериватных хромосом в первое полярное тельце у мышей с Робертсоновскими транслокациями [146]. Гипотетическое наличие данного механизма у человека также может рассматриваться как один из путей коррекции аномальной сегрегации.
Помимо нарушений мейотического расхождения хромосом, в качестве причины формирования несбалансированных гамет и/или эмбрионов у носителей структурных хромосомных перестроек в последние годы стали рассматривать хромосомную нестабильность, проявляющуюся высоким уровнем пробелов и разрывов в участках повышенной ломкости хромосомы - ломких сайтах [43]. Ломкие сайты - участки хромосом, в которых наиболее вероятно образование хромосомных пробелов и разрывов при воздействии критических для репликации ДНК условий [72,52].
Предпосылками данного предположения выступили, во-первых, описанная ранее высокая интенсивность образования хромосомных пробелов и разрывов в культивируемых in vitro преимплантационных эмбрионах; во-вторых, её активация при подавлении репликации ДНК. В-третьих, в предшествующих работах было показано, что хромосомные разрывы, которые впоследствии дали начало транслокациям, располагались именно в пределах ломких сайтов [69,120]. При исследовании уровня хромосомной нестабильности в бластомерах носителей сбалансированных структурных хромосомных перестроек не было обнаружено количественной взаимосвязи между частотой хромосомных пробелов и разрывов и положением родительской структурной перестройки по отношению к ломким сайтам. Так, среди 12 супружеских пар, в которых один из супругов являлся носителем сбалансированной хромосомной перестройки, при этом одна из точек образующего перестройку разрыва локализовалась в пределах ломкого сайта, из 79 эмбрионов признаки наличия хромосомных разрывов выявлялись у 38 (48,1%). В подгруппе из 10 пар, в которых у носителя сбалансированной перестройки точки хромосомных разрывов располагались вне ломких сайтов, хромосомные разрывы были обнаружены у 39 из 79 (49,4%) эмбрионов. Не было обнаружено различий в частоте хромосомных разрывов у пар, в которых носителем перестройки был мужчина, по сравнению с парами, где перестройка имела место у женщины (50,8% и 47,4% соответственно). Исследование также не выявило связи между данными репродуктивного анамнеза, показаниями для медико-генетического консультирования и частотой хромосомных разрывов в клетках эмбрионов обследуемых пациентов. Поскольку возраст женщин в исследуемых подгруппах существенно не различался, различия частоты хромосомных разрывов в бластомерах были расценены как независимые от возраста. Кроме того, сравнение исследуемой частоты хромосомных разрывов в клетках эмбрионов в подгруппе матерей моложе 39 лет и в подгруппе 39 лет и старше не выявило достоверных различий. И хотя оценка частоты хромосомных разрывов в бластомерах ограничивалась анализом только одной, вовлеченной в перестройку, хромосомы в каждом цикле ВРТ, что могло недооценить общую распространенность данного биологического явления, важным наблюдением явилось существенное превышение частоты хромосомных разрывов в клетках эмбрионов носителей структурных перестроек (48,7%) по сравнению с эмбрионами лиц с нормальным кариотипом. Так, при анализе всех хромосом клеток преимплантационных эмбрионов методом метафазной сравнительной геномной гибридизации (CGH) у супружеских пар с бесплодием и нормальным кариотипом частота эмбрионов, мозаичных по сегментным анеусомиям, в том числе, сегментным моносомиям вследствие хромосомных пробелов и разрывов составила 14% [29, 47]. Полученные данные о статистически значимых (р 0.01) различиях частоты хромосомных разрывов в клетках эмбрионов от мужчин с хромосомными перестройками и с патозооспермией (71,4%) по сравнению с эмбрионами от мужчин-носителей структурных перестроек с нормальным сперматогенезом (27,6%) позволяют считать образование хромосомных разрывов еще одним механизмом элиминации несбалансированных гамет [43].
Патология плаценты при хромосомных аномалиях у плода
Преимплантационная диагностика эмбрионов проводилась путём молекулярно-цитогенетического исследования ядра бластомера. Биопсию бластомеров проводили на 3 день развития эмбриона in vitro. Для диагностики и последующего переноса выбирали эмбрионы хорошего качества, т.е., имеющие 6-10 бластомеров и фрагментацию не более 50% (классы А, В, С). [85].
Биопсию эмбрионов проводили на микроманипуляторе NARI SHIGA. Для пенетрации zona pellucida использовали лазерную пушку фирмы FERTILASE. Для аспирации бластомера использовали микропипетки фирмы COOK (кат. номера К-ЕВРН-3035, K-HPIP-3335). В качестве основы подготовки ядра и гибридизации in situ служил протокол, рекомендуемый фирмой-производителем. Выделение ядра из бластомера проходило с использованием гипотонического раствора, помещенного на предметное стекло, в количестве Юмкл. Гипотонический раствор, состоящий из 1% Твина 20 (1мл), 0.01 N раствора НС1 (0.1 мл), дистиллированной воды (8.9 мл), готовили ex tempore. Фиксацию ядер бластомеров проводили метанол-уксусным раствором (3:1) при комнатной температуре. Затем препараты с ядрами обрабатывали 0.01 N раствором НС1 (49 мл) с добавлением 50 мкл 10% пепсина при 37С в течение 3 минут. с последующей дегидратацией в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 20 секунд в каждом.
При подготовке клинического цикла ПГД FISH-зонды, адекватные для диагностики транслокаций, были предварительно протестированы на фиксированных лимфоцитах периферической крови пациентов. ПГД хромосомных транслокаций была дополнена диагностикой наиболее частых анеуплоидий (хромосом 13, 16, 18, 21, 22, X, Y) на втором этапе FISH.
С целью определения сбалансированности кариотипа по перестроенным хромосомам для гибридизации подбирали набор зондов, специфичных к центромерам и субтеломерным районам перестроенных хромосом и помеченных различными флуорохромами или их сочетаниями. Сбалансированность хромосомного набора эмбриона по хромосомам, участвующим в хромосомной перестройке, определяли по числу соответствующих сигналов гибридизации. Использовали зонды производства фирмы Abbott Molecular для определения номера хромосомы (https://www.abbottmolecular.com/products/fish/chromosome enumeration-probes.html) или субтеломерных участков хромосомных плеч (https://www.abbottmolecular.com/products/genetics/fish/vysisotelvvsionelvvsion probes.html), а также аналогичные зонды фирмы Kreatech (Netherlands), которые распраняются через компанию Leica Biosystems, The Pathology Company (Germanv)(http://www.leicabiosvstems.com/ihc-ish-fish/kreatech-fish-probes/satellite enumeration/; http://www.leicabiosvstems.com/ihc-ish/kreatech-fish-probes/sub telomeric/). Гибридизацию, отмывку и детекцию сигналов проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, прилагаемым к зондам. Для ПГД пяти основных хромосомных синдромов: Патау - трисомия по 13 хромосоме, Эдвардса - трисомия по 18 хромосоме, Дауна - трисомия по 21 хромосоме, Тернера-Шерешевского - женский генотип только с одной X хромосомой и Кляйнфельтера - мужской генотип, который представлен несколькими типами полисомии по хромосомам X и Y, - использовали набор фирмы Abbott Molecular «Vysis MultiVysion PGT Multi-color Probe Kit». В этом наборе имеются зонды на все пять хромосом, напрямую меченные различными флуорохромами (Таблица 3). fhttps://www bbottmolecularxom/products/genetics/fish/vvsis-multivvsion-pgt-multicolor-probe.html)
Для получения четких сигналов стекла с ядрами повторно фиксировали метанол-уксусным раствором (3:1) 10 минут при температуре 4С, с последующей дегидратацией в серии восходящих спиртов 70, 80, 96 по 20 секунд в каждом. К высушенному на воздухе исследуемому образцу добавляли ДНК зонд, денатурацию проводили при 75С в течение 10 мин. Затем препараты переносили во влажную камеру и инкубировали в течении ночи при температуре 42С. Постгибридизационное отмывание препарата проводили в 0.4Х SSC (рН 7.0-7.5) при 73 С в течение 1 минуты, последующую отмывку проводили в растворе 2Х SSC/0.1% NP-40 при комнатной температуре 30 секунд.
Перед идентификацией хромосом на препарат наносили противовыцветающий реагент DAPIII (фирма ABBOT Vysis). Микроскопический анализ проводили при увеличении 100X10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss, оборудованным соответствующим набором фильтров фирмы ABBOT (Vysis) (Orange, Green, Aqua, Blue) и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой MetaSystems.
Инвазивная диагностика выполнялась путём трансабдоминального хориоцентеза в 10-12 недель или трансабдоминального амниоцентеза в 17-18 недель беременности. При биопсии хориона в асептических условиях под контролем УЗИ проводили прокол передней брюшной стенки и стенки матки и пунктировали толщу хориона [2]. В фиксированном положении иглы удаляли мандрен и под отрицательным давлением производили аспирацию 8-12 мг ткани хориона. В случае трансабдоминального амниоцентеза пунктировали переднюю брюшную стенку и стенку матки и извлекали 30-40 мл околоплодных вод. После извлечения иглы место прокола обрабатывали раствором антисептика.
Выбор когортного исследования в качестве дизайна настоящего исследования был обусловлен, прежде всего, возможностью одновременного анализа множественных исходов. Весьма важным преимуществом когортного исследования явилась более высокая, чем у исследования «случай-контроль», точность проверки гипотезы, на которую указывают многие авторы [82, 55]. Ввиду низкой распространенности изучаемой патологии в популяции распределение в исследуемой выборке отличалось от нормального. В этой связи для анализа данных применялись тесты непараметрической статистики: тест Вилкоксона, Крускала-Уоллиса. Наиболее адекватными мерами оценки ассоциации между воздействием и исходом являются относительный риск и отношение шансов [55].
Относительный риск, OP (relative risk, RR), или отношение рисков (risk ratio), -отношение частоты развития исхода среди лиц, подвергавшихся воздействию (1Е), к частоте развития исхода среди лиц, не подвергавшихся воздействию (1Е ):
Общеклинические методы исследования
Частота потери беременности после ВРТ с применением ПГД - 25,0% -оказалась достоверно ниже частоты потери спонтанно наступившей беременности (с учётом поздних индуцированных выкидышей) - 63,4%, р!=0,024 (табл. 11). После ВРТ без ПГД (во II контрольной группе) частота потери беременности также превышала данный показатель в основной группе: 68,8% против 25,0%, р2=0,054.
Относительный риск потери спонтанной беременности оказался в 2,54 раза выше, чем потери беременности после ПГД. Шансы потери спонтанной беременности были оценены как в 5,2 раза более высокие, чем таковые после ВРТ с применением ПГД (Таблица 9). Относительный риск потери беременности после ЭКО и ПЭ в 2,75 раза превысил таковой при беременности после ПГД. Шансы репродуктивной потери, включая невынашивание беременности и внематочную беременность, после ВРТ без ПГД оказались в 6,6 раза более высокими, чем таковые при беременности после ВРТ с применением ПГД.
При внутригрупповом анализе в основной группе оценивали частоту потерь ранней беременности после ПГД и данные анамнеза тех же пациенток. До проведения ПГД, в анамнезе, в основной группе у 18 супружеских пар суммарно было 45 беременностей, из которых у 12 пар 28 беременностей (62,2%) прекратили развиваться в I триместре. Одна из анамнестических беременностей завершилась родами плодом с нормальным фенотипом. После применения ПГД самопроизвольный выкидыш имел место у трёх женщин, то есть, суммарно произошло три самопроизвольных выкидыша. Случаев аномалий кариотипа и/или ВПР плода после применения ПГД не было. Таким образом, при проведении ПГД отмечено снижение числа случаев потери ранней беременности в 9,3 раза - с 28 до 3 - по сравнению с анамнезом (р=0,003, тест Вилкоксона). Количество родов плодом с нормальным фенотипом увеличилось с 1 до 9. Возможно, данные изменения обусловлены именно селекцией нормальных и/или сбалансированных эмбрионов, лежащей в основе метода ПГД.
Период обследования и подготовки к ПГД у пациентов основной группы длился от двух до 48 месяцев и в среднем составил 13,79+ 12,38 месяцев (Рисунок 15). До обращения к методу ПГД (в анамнезе) те же самые пациенты затратили на обследование и лечение имеющихся репродуктивных нарушений от 12 до 172 месяцев, в среднем 58,68+42,75 месяцев, что в 4,26 раза больше продолжительности обследования перед ПГД и проведения программы ВРТ с ПГД (р 0,0001, тест Уилкоксона).
Период времени, затраченного на подготовку и проведение программ ВРТ без применения ПГД у пациентов II контрольной группы длился от двух до 24 месяцев, и в среднем составил 8,95+ 7,42 месяца, что достоверно не отличалось от времени, затраченного на подготовку и проведение ПГД (р=0,61, тест Манна-Уитни). В анамнезе пациенты II контрольной группы затратили на обследование и лечение от 12 до 240 месяцев, в среднем 75,70 + 64,03 месяца, что также достоверно больше периода времени, затраченного на ВРТ без ПГД (р 0,0001, тест Уилкоксона).
Пороками развития и/или совместимыми с жизнью хромосомными аномалиями плода осложнилось 22 беременности у 16 женщин, все они наступили спонтанно, включая период наблюдения, а также анамнестические данные. В обеих группах ВРТ случаев ВПР плода (ни спорадических, ни привычных) не было. Частота беременностей плодом с аномалиями развития составила, таким образом, 10,5% (22/210) среди всех беременностей и 12,1% (22/182) среди спонтанных беременностей у обследованных нами пациентов. Средний возраст женщин, имевших беременности плодом с аномалиями развития, составил 31,1+ 6,0 лет. 13 из 16 женщин были моложе 35 лет - значения старшего репродуктивного возраста.
Закономерные проявления носительства сбалансированных хромосомных перестроек - несбалансированные аномалии кариотипа потомства с вовлечением родительских перестроенных хромосом - были выявлены в 11 случаях у семи женщин (Таблица 10, Рисунок 16, а, б). В одном случае кариотип плода с МВПР был неизвестен.
У четырёх семей были выявлены совместимые с жизнью трисомии плода: у трёх плодов - синдром Дауна, в одном случае - синдром Эдвардса (Таблица 10, случаи 129, 153, 187, 197). При этом родительские сбалансированные транслокации ни 18-ю, ни 21-ю хромосому не затрагивали, что позволило нам рассматривать данные наблюдения как примеры межхромосомного эффекта.
У шести женщин имели место однократные случаи аномалий развития плода на фоне нормального кариотипа или сбалансированной перестройки родительского происхождения. У пациентки Г.-вой (наблюдение №11) кариотип ребёнка с МВПР был нормальным, фенотипический диагноз соответствовал синдрому Пьера-Робена.
У Елены С.-вой (наблюдение №12) пренатально в 13 недель был установлен нормальный мужской кариотип плода, на сроке 21 неделя беременности у плода были выявлены признаки танатоформной скелетной дисплазии - укорочение длинных трубчатых костей (ризомелия) с искривлением бедренных костей по типу «телефонной трубки». В третьем случае (наблюдение №13) у супругов К.-вых (кариотип отца 46,XY,t(10;13)(q26.1; q31.3)) пренатально в 13 недель был установлен нормальный женский кариотип плода. На сроке 21 неделя беременности у плода при УЗИ были выявлены микроцефалия, голопрозэнцефалия, неиммунная водянка плода, а при аутопсии - множественные признаки дизэмбриогенеза, характерные для синдрома Патау. Вероятной причиной формирования данного аномального фенотипа явилась сегментная анеусомия по хромосоме 13, участвующей в транслокации.
Аномалии развития плода и новорождённого у супружеских пар с носительством сбалансированных хромосомных перестроек
Возможная зависимость исхода беременности от способа её достижения является актуальным и недостаточно изученным аспектом проблемы профилактики неблагоприятных репродуктивных исходов у носителей сбалансированных структурных хромосомных перестроек. Целью настоящего исследования явилось совершенствование акушерско-гинекологической помощи женщинам из супружеских пар, в которых один из супругов является носителем сбалансированной структурной хромосомной перестройки. Для достижения цели исследования нами были изучены репродуктивные исходы у 109 супружеских пар с носительством сбалансированных хромосомных перестроек при различных способах достижения беременности: в основной группе - с помощью ВРТ с применением преимплантационной генетической диагностики, а также в двух контрольных - в естественном цикле и при ВРТ без ПГД. Основную группу (группу исследования) составили 42 пары, у которых была выполнена преимплантационная генетическая диагностика хромосомных аномалий эмбриона. I контрольную группу составили 34 пары, избравших консервативный сценарий репродуктивного поведения. II контрольную группу сформировали 33 супружеские пары, у которых было проведено ВРТ (ЭКО и ИКСИ) без применения ПГД. Кроме того, в основной группе был проведен внутригрупповой анализ: результаты ПГД сравнивались с анамнестическими данными тех же пациентов.
Выбор I контрольной группы был обусловлен необходимостью сравнения репродуктивных рисков при ПГД и при естественном наступлении беременности. В последние годы отмечается увеличение числа фертильных супружеских пар среди обратившихся за ПГД носителей сбалансированных хромосомных перестроек. Так, в период с января 1997 по декабрь 2007 из 3916 циклов ВРТ с ПГД, выполненных у носителей хромосомных перестроек, 63,9% - 2505 циклов приходилось на супружеские пары с бесплодием. В период с января по декабрь 2008 аналогичный показатель составил 53,4% - 414 циклов ВРТ с ПГД у носителей с бесплодием из 774 циклов ВРТ с ПГД в общей группе носителей (и страдающих бесплодием, и фертильных) [58]. В то же время систематические обзоры репродуктивных исходов у данной группы пациентов не представили убедительных данных в пользу предпочтения определенного способа достижения беременности, отметив при этом целесообразность проведения проспективных клинико-эпидемиологических исследований [122].
Пациенты второй контрольной группы - после ВРТ без преимплантационной генетической диагностики - являются, на наш взгляд, адекватной группой сравнения клинических исходов ПГД, поскольку позволяют нивелировать влияние сопутствующих факторов, связанных с собственно оплодотворением in vitro. В значительной мере целесообразность выделения II контрольной группы определили также данные о возможном неблагоприятном действии биопсии бластомера на жизнеспособность эмбриона. Так, Levin I. et al. в эмбрионах, подвергавшихся биопсии, по сравнению с эмбрионами контрольной группы на 2й день наблюдали более высокую частоту остановки дробления (3,6% против 0,7%), более высокий уровень фрагментации (9,5% против 3,0%), меньшее количество дробящихся эмбрионов хорошего качества (69,1% против 78,4%). На Зй день в основной группе (после биопсии) также отмечено снижение доли эмбрионов с шестью и более бластомерами (56,5% против 74,5%), более высокий уровень фрагментации (11,7% против 3,9%), большая доля эмбрионов с задержкой дробления (57,2% против 38,5%), а также снижение среднего числа бластомеров (5,8 + 2,1 против 6,6+1,9) по сравнению с эмбрионами контрольной группы [54, 25].
На животных моделях была показана более низкая выживаемость мышиных эмбрионов, подвергавшихся биопсии, по сравнению с культивированными in vitro без биопсии: 39 из 225 (17,3%) против 45 из 98 (45,9%), (р 0,05). Однако в постнатальном периоде более высокая выживаемость была отмечена у мышей опытной группы: до возраста завершения грудного вскармливания 20 из 44 (45,4%) детёнышей контрольной группы были съедены и/или отвергнуты матерями, в опытной группе этот показатель составил 28,2% (9 из 39). После завершения грудного вскармливания показатели смертности не отличались в обеих группах. Фертильность, а также физическая сила верхних конечностей не отличались в обеих группах. В то же время, у мышей, подвергавшихся на доимплантационной стадии эмбриобиопсии, отмечалось увеличение массы тела и снижение памяти по сравнению с мышами контрольной группы, у которых в эмбриональном периоде не проводили биопсию бластомера. Методами протеомного анализа у проходивших эмбриобиопсию животных в тканях мозга были установлены достоверные изменения профиля экспрессии 36 протеинов, схожие с изменениями при нейродегенеративных заболеваниях [61].
Возможно, неблагоприятное воздействие эмбриобиопсии является одной из причин ухудшения исходов после преимплантационного генетического скрининга методом FISH у женщин старшего репродуктивного возраста в общей группе пациентов с нормальным кариотипом. По данным систематического обзора и мета-анализа девяти рандомизированных контролируемых исследований, частота родов живым плодом у женщин этой возрастной группы после преимплантационного генетического скрининга была достоверно ниже, чем после ВРТ без применения ПГС: от 13 до 23% против 26% [95% ДИ: - 0.13 - - 0.03], [115, 87]. У носителей сбалансированных хромосомных перестроек особенности мейотического поведения хромосом и связанные с этим репродуктивные риски не позволяют упрощённо экстраполировать результаты исследований, полученные в общей группе пациентов клиник ВРТ, на пациентов с изучаемой нами проблемой. Вместе с тем, приведенные данные свидетельствуют о том, что выбор оптимального способа достижения беременности должен проводиться с учётом альтернативных рисков.