Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Иммуноцитотерапия в коррекции аллоиммунных нарушений при привычном выкидыше (обзор литературы) 13
1.1 Определение и факторы риска привычного выкидыша 13
1.2 Роль аллоиммунного фактора в патогенезе привычных потерь беременности .15
1.3 Методы иммунотерапии в лечении привычного выкидыша .23
1.4 Иммуноцитотерапия при привычном выкидыше: возможности и перспективы 27
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1 Критерии включения и исключения пациенток в группы исследования 32
2.2 Методы исследования .35
2.3 Статическая обработка материала 45
2.4 Методика проведения ИЦТ 45
Глава 3. Результаты собственных исследований .50
3.1 Клиническая характеристика женщин исследуемых групп 50
3.1.2 Результаты клинико-лабораторного обследования супружеских пар с привычным выкидышем 59
3.2. Течение и исходы беременностей у женщин исследуемых групп 61
3.2.1 Осложнения и исходы ранних сроков беременностей 61
3.2.2 Оценка течения и исходов беременностей у женщин исследуемых групп после 22 недель 65
3.2.3 Анализ течения родов, послеродового периода и состояния новорожденных 71
3.3 Результаты расширенного иммунологического обследования женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза 76
3.3.1 Особенности фенотипа лимфоцитов периферической крови женщин с привычным выкидышем до назначения иммуноцитотерапии 76
3.3.2 Результаты иммунологического обследования женщин на фоне проведения предгестационной иммуноцитотерапии .81
3.3.3 Результаты иммунологического обследования женщин в течение I триместра беременности .87
3.3.3.1 Динамика субпопуляционного состава лимфоцитов у пациенток с привычным выкидышем, выносивших беременности до доношенного срока .87
3.3.3.2 Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин основной группы с пролонгированной и прервавшейся беременностью . 93
3.4. Динамика выработки антилейкоцитарных антител к отцовским антигенам при иммунизации аллогенными клетками женщин с привычным выкидышем .99
Глава 4.Обсуждение полученных результатов .102
Выводы 124
Практические рекомендации .126
Список сокращений 134
Список литературы 136
- Роль аллоиммунного фактора в патогенезе привычных потерь беременности
- Клиническая характеристика женщин исследуемых групп
- Результаты иммунологического обследования женщин на фоне проведения предгестационной иммуноцитотерапии
- Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин основной группы с пролонгированной и прервавшейся беременностью
Введение к работе
Актуальность исследования
Актуальность предотвращения привычного выкидыша обусловлена возрастающим риском потерь беременности при увеличении числа неудач, а также влиянием осложненного течения беременности на ранних сроках на перинатальные исходы. За последние 20 лет стало очевидным, что в развитии привычного выкидыша неясного генеза ключевую роль играют аллоиммунные иммунологические нарушения. Чем больше беременностей у женщины закончились самопроизвольным прерыванием, тем меньше у нее шансов пролонгировать следующую беременность до доношенного срока без соответствующей терапии. [P.J. Chong et al., 1993; Л.В. Мишарина, Н.Ю. Борзова, 2017].
Поэтому в настоящее время наличие даже двух последовательных
выкидышей рассматривается как основание для постановки диагноза «привычный
выкидыш», последующего обязательного обследования, в том числе и
иммунологического, разработки и проведения программы подготовки к
беременности [В.М. Сидельникова, Г.Т. Сухих, 2011; А.З. Хашукоева,
О.А. Свитич, 2014; Л.С. Логутова, Т.С. Будыкина, 2017]. Большое количество исследований было проведено с целью определения иммунологических маркеров, свидетельствующих о качестве ответа иммунной системы матери на антигены эмбриона отцовского происхождения [Н.Ю. Борзова, Н.И. Иваненкова, 2015; H Gong, Y Chen, H Kuang et al., 2017]. Выявление маркеров привычного выкидыша, указывающих на аллоиммунный генез, необходимо для обоснования патогенетической иммунотерапии.
Показано, что иммуноцитотерапия (ИЦТ) - введение аллогенных
лимфоцитов с целью иммунизации женщин с привычным выкидышем при
подготовке к беременности, способствует формированию такого состояния
иммунной системы, которое необходимо для успешной имплантации, а во время
беременности – для стимуляции развития плаценты и обеспечения нормального
развития эмбриона [Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько, 2003; Л.В. Посиссева,
А.И Малышкина, 2008; M Liu, X Zhen, H Sun et al., 2017].
Однако до сих пор влияние иммуноцитотерапии на динамику субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови у женщин с привычным выкидышем неясного генеза остается неизученным, отсутствуют данные о маркерах формирования толерантности в раннем гестационном периоде.
Поиск альтернативного подхода к лечению супружеских пар с неоднократными неудачами вынашивания беременности побуждает исследователей к изучению механизмов воздействия метода иммуноцитотерапии.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время осуществляется немало попыток обобщения
накопленного в мировой практике опыта клинических исследований
эффективности иммуноцитотерапии. Несмотря на это, задача до настоящего
времени остается нерешенной. По данным H. Carp (2007), иммуноцитотерапия
является высокоэффективным методом терапии привычного выкидыша, но есть
показания, которых следует придерживаться. Получены результаты как
положительного влияния иммуноцитотерапии на течение и исход беременности,
так и отсутствия достоверного терапевтического эффекта. С другой стороны,
установлено, что наиболее эффективно и целесообразно назначение
иммуноцитотерапии супружеским парам с многократными ранними потерями беременности в анамнезе. [T.F. Porter et al., 2006; R.G. Farquharson et al., 2012].
Аналогичных исследований в области лечения привычных потерь беременностей методом иммуноцитотерапии, посвященных одновременной оценке в периферической крови особенностей субпопуляций лимфоцитов с киллерной активностью, Трег-клеток и клеток, экспрессирующих CD200, в доступной литературе найти не удалось.
Цель исследования
Оценить эффективность проводимой предгестационной подготовки с
применением иммуноцитотерапии аллогенными лимфоцитами супруга и
оптимизировать ведение ранних сроков беременности у женщин с привычным
выкидышем аллоиммунного генеза на основании расширенного
иммунологического обследования.
Задачи исследования
1. Провести комплексное клинико-лабораторное обследование супружеских
пар с привычным выкидышем для формирования группы пациенток с
аллоиммунными нарушениями с последующим назначением иммуноцитотерапии
аллогенными лимфоцитами.
2. Провести иммуноцитотерапию аллогенными лимфоцитами партнера
женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза в предгестационной
подготовке в качестве монотерапии и в составе комплексной терапии в I
триместре наступившей беременности.
3. Провести расширенное иммунологическое обследование, включающее
оценку содержания Т-регуляторных клеток, субпопуляций NК-клеток, CD200+-
лимфоцитов, В-лимфоцитов и уровней антиотцовских антилейкоцитарных
антител у женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза до
иммуноцитотерапии, во время предгестационной подготовки и в динамике I
триместра наступившей беременности.
4. Проанализировать исходы беременностей в сопоставлении с
иммунологическими показателями (содержание Т-регуляторных клеток,
субпопуляций NК-клеток, CD200+-лимфоцитов, В-лимфоцитов и уровней
антиотцовских антилейкоцитарных антител) у беременных с привычным
выкидышем.
5. Разработать критерии оценки эффективности терапии и прогнозирования
исхода беременности у женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза
на фоне проводимого комплексного лечения.
6. Разработать алгоритм лечебных мероприятий и контроля их
эффективности для прогнозирования и предотвращения ранних потерь
беременности у женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза.
Научная новизна
В результате проведенной работы получены новые данные, позволяющие отнести супружеские пары с привычным выкидышем неясного генеза к категории пациентов с аллоиммунными привычными потерями беременности.
Впервые изучены иммунологические показатели небеременных пациенток с привычным выкидышем и у фертильных женщин, выявлены достоверные различия в содержании клеток, участвующих в механизмах защиты/отторжения плода, на этапе обследования до назначения терапии. Установлена ключевая роль в индукции толерантности материнской иммунной системы к отцовским антигенам плода Т-регуляторных клеток, субпопуляций NК- и NKT-клеток, CD200+-лимфоцитов.
Оценена динамика вышеуказанных параметров, а также антиотцовских антилейкоцитарных антител в процессе проведения иммуноцитотерапии. Наглядно показаны изменения иммунологических показателей в первом триместре беременности у женщин с привычным выкидышем после предгестационной иммуноцитотерапии, проведенной согласно принятому протоколу как монотерапии вне беременности, что позволило расширить понимание физиологических изменений при данном методе лечения.
Проведена оценка иммунологических параметров (Т-клеток с естественной
регуляторной функцией, субпопуляций NK-клеток, CD200+-лимфоцитов,
антиотцовских антилейкоцитарных антител) при успешном пролонгировании и самопроизвольном прерывании беременности
Практическая значимость
Оценена эффективность применения иммуноцитотерапии как монотерапии в период предгестационной подготовки женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза, обоснована необходимая кратность процедур.
Проведена оценка значимости определения изменений содержания естественных Т-регуляторных клеток, субпопуляций NK-клеток, CD200+-лимфоцитов и антиотцовских антилейкоцитарных антител для прогнозирования ранних гестационных осложнений и исходов беременностей у женщин с привычным выкидышем.
На основании предложенной программы предгестационной подготовки и
ведения беременности достигнуто пролонгирование беременности до
доношенного срока с рождением жизнеспособного ребенка в 84% случаев с предотвращением поздних гестационных осложнений.
Разработаны алгоритмы мониторинга предгестационной подготовки с применением иммуноцитотерапии отцовскими аллогенными лимфоцитами в качестве монотерапии, мониторинга и ведения беременности с контролем за эффективностью проводимых терапевтических мероприятий (см. приложение).
Методология и методы исследования
В работе использованы общеклинические и иммунологические методы исследования. Статистическую обработку проводили с использованием пакета статистического анализа для Microsoft Office Excel 2007 и пакета MedCalc12 для Windows 7.
Положения, выносимые на защиту
1. В структуре причин привычного выкидыша аллоиммунные факторы составляют 22,0%. Другие этиологические факторы, установленные при обследовании 320 супружеских пар: анатомические нарушения - 14,4%, сбалансированные хромосомные перестройки у супругов - 3,6%, гормональные нарушения - 20,0%, антифосфолипидный синдром - 19,6%, инфекции - 6,3%, тромбофилии высокого риска - 6,3%, тяжелая экстрагенитальная патология -4,7%, мужской фактор привычного выкидыша как единственная причина – 3,1%, а в сочетании с другими факторами - 11,0%.
-
У женщин с привычным выкидышем, обусловленным аллоиммунными механизмами, достоверно повышено содержание в периферической крови клеток с фенотипом CD3-CD8+, киллерных клеток (CD3+CD56+CD16+, CD56+CD16+), CD200+, BI-клеток (CD5+CD19+), значимо понижено – Т-регуляторных клеток с фенотипом СD4+CD25highCD127low/-. Лучшей диагностической значимостью обладают тесты определения относительного и абсолютного содержания Т-регуляторных клеток: одинаково высокой специфичностью (92,9%) и высокой чувствительностью (86,6% и 83,3%, соответственно).
-
Критериями эффективности проведенной иммуноцитотерапии клетками полового партнера в программе предгестационной подготовки является выработка антиотцовских антилейкоцитарных антител, в течение беременности -нормализация субпопуляционного состава лимфоцитов, включая содержание NK-клеток, CD200+ и Т-регуляторных клеток с фенотипом СD4+CD25highCD127low/-.
4. Прогнозировать потерю беременности в I триместре позволяет
определение в сроках 5-6 недель содержания субпопуляций киллерных клеток.
При уровнях ниже критериальных значений: CD56+ - менее 10,3%, CD56+CD16+ -
менее 11,9%, CD3-CD16+-клеток менее 3,1%, - высока вероятность
неразвивающейся беременности, при этом проведение иммуноцитотерапии не
улучшает ее исход. Достижение нормативных показателей в иммунологических
параметрах в сроке 12 недель на фоне проведения иммуноцитотерапии и
гестагенной поддержки предрасполагает к дальнейшему благоприятному течению
беременности.
Личный вклад автора
Автором проведена систематизация литературных данных по теме
диссертации, лично разработана анкета для сбора анамнеза, проведен анализ
клинико-анамнестических данных и результатов обследования 320 женщин в
проспективном исследовании, удовлетворяющих критериям включения в
исследование. Автор лично участвовал в ведении беременности и
родоразрешении женщин, включенных в исследование. Автором осуществлялись: забор, подготовка, хранение биологического материала на преаналитическом этапе, участие в иммунологических исследованиях. Анализ, статистическая обработка полученных данных проведены автором самостоятельно в соответствии с правилами и обеспечивают достоверность результатов и сформулированных выводов. Написание и публикация результатов выполнены автором лично.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 4, 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация диссертации Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции 2-го отделения акушерского патологии беременности совместно с лабораторией клинической иммунологии 03.11.2017 г. и на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (27.12.2017 г., протокол №19).
Внедрение результатов работы в практику
Основные рекомендации, полученные в ходе исследования, используются в
акушерских отделениях и научно-поликлиническом отделении ФГБУ
«НМИЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России при обследовании и лечении супружеских пар с привычным выкидышем.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 статей, все в рецензируемых научных изданиях. Материалы диссертации доложены на Всероссийском научно-образовательном форуме «Мать и Дитя» и V, VI, VII-ой конференциях «Невынашивание беременности: социальная проблема, медицинские решения» (Москва, 2015, 2016, 2017).
Структура работы
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических
рекомендаций, списка литературы, приложения. Работа изложена на
156 страницах, содержит 21 таблицу и 8 рисунков. Библиографический указатель состоит из 180 литературных источников, из них 35 - отечественных и 145 -иностранных авторов.
Роль аллоиммунного фактора в патогенезе привычных потерь беременности
Первоначально понятие «привычный выкидыш» ассоциировали либо с хромосомной патологией плода, либо с материнскими причинами, среди которых обозначались генетические, анатомические, гормональные, тромбофилические или инфекционные факторы. При исключении вышеперечисленных этиологических факторов говорили о неясном генезе привычного выкидыша. За последние 20 лет стало очевидным, что в развитии привычного выкидыша неясного генеза ключевую роль играют иммунологические причины аллоиммунного характера.
В структуре причин привычного выкидыша аллоиммунные нарушения по данным зарубежных авторов (Carp H., Portet T.F., Scott J.R.составляют от 15 до 50 % [30, 31]. Шанс доносить беременность без терапии после трех предшествующих выкидышей, обусловленных аллоиммунными механизмами, составляет около 38%. Пациентки с привычным выкидышем входят в группу риска по реализации поздних гестационных осложнений, связанных с нарушенной плацентацией. Поэтому коррекция необходима не только для предотвращения потерь беременности, но и для профилактики гестационных осложнений.
Аллоиммунные нарушения принципиально отличаются от аутоиммунных, что играет важную роль в тактике ведения супружеской пары. При аутоиммунном генезе развитие будущей плаценты и эмбриона зависит от воздействия материнских аутоантител, которые направлены против антигенов децидуальной ткани. При аутоиммунных состояниях иммунная система агрессивно настроена против материнских тканей, а плод уже страдает вторично.
Антифосфолипидный синдром (АФС) является наглядным примером аутоиммунного процесса, при котором увеличивается риск развития тромбоэмболических состояний и воспалительных реакций, приводящих к гибели плода.
При аллоиммунном генезе привычного выкидыша материнская иммунная система агрессивно реагирует на антигены эмбриона и трофобласта отцовского происхождения, так как нарушен механизм формирования иммунологической толерантности. При этом механизм реализации выкидыша напоминает реакции, приводящие к отторжению чужеродного трансплантата. Считается, что вероятность иммунологических нарушений в генезе привычного выкидыша растет с увеличением числа потерь беременностей [32, 33].
К аллоиммунным нарушениям, способным привести к привычным ранним потерям плода в настоящее время относят: наличие у супругов более 3 общих антигенов системы главного комплекса гистосовместимости (HLA-HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN); низкий уровень блокирующих факторов в сыворотке матери; повышенное содержание клеток с естественной киллерной активностью (NK-клеток с фенотипом CD56+, CD16+) в эндометрии и периферической крови матери как вне, так и во время беременности; высокие уровни в эндометрии и сыворотке ряда цитокинов, в частности -интерферона, фактора некроза опухоли-, интерлейкинов-1 и 2 [34].
Для изучения патогенеза привычного выкидыша аллоиммунной этиологии необходимо представить, как иммунная система матери реагирует на плод, несущий в себе аллоантигены, унаследованные от отца. Несмотря на то, что плод и плацента генетически отличаются от материнского организма, при нормальном течении беременности возникает иммунологическая толерантность и негативные иммунные реакции на развивающийся плод отсутствуют. Возникает так называемый «иммунологический парадокс беременности», связанный с формированием иммунологической толерантности, которая обеспечивает защиту плода, несущего антигены отцовского происхождения. Реализация данного механизма не происходит в полной мере у женщин с привычным выкидышем аллоиммуного генеза [35,36,37].
Множество исследований было проведено с целью определения иммунологических маркеров, свидетельствующих о качестве ответа иммунной системы матери на антигены эмбриона отцовского происхождения [38]. Существуют несколько субпопуляций лимфоцитов, которым на протяжении многих лет отдавали главную роль в формировании условий для нормального пролонгирования беременности. К одной из них относятся NK-клетки. Естественным киллерам всегда отводили особое место в реакциях мать-плацента-плод. Многочисленные исследования доказали, что содержание этих клеток в периферической крови при беременности у женщин с привычным выкидышем кардинально отличается от уровня у женщин с физиологическим течением беременности. Другой, не менее важной популяцией клеток, обеспечивающей успешное развитие беременности на ранних сроках, являются периферические Т-лимфоциты, которые после связи с антигеном делятся на Тh-1 и Th-2 субпопуляции. Для того, чтобы плод, несущий в себе антигены отцовского происхождения, удачно имплантировался в организме матери должна произойти супрессия материнских NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов [39]. Таким образом, выявление маркеров привычного выкидыша, указывающих на аллоиммунный генез, необходимо для обоснования способов патогенетической иммунотерапии и контроля ее эффективности.
Еще в 1987 году Т.Wegmann предложил иммунотрофическую (immunotrophic) теорию, согласно которой нормальное развитие плаценты является результатом взаимодействия и влияния различных цитокинов, которые он назвал иммунотропными цитокинами плаценты. К ним Т. Wegmann отнес гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор роста (GM-CSF), трансформирующий фактор роста (TGF-), и интерлейкин-3 (ИЛ-3)) [40]. Цитокины вырабатываются T-лимфоцитами и, как известно, Т-лимфоциты хелперы CD4+в по продукции цитокинов делятся на две субпопуляции - Th1 и Th2. Th1-клетки преимущественно секретируют интерферон–гамма (ИФ-гамма), ИЛ-2 и ФНО-альфа (ФНО-); Th2-клетки продуцируют ИЛ 10, ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6. ФНО- участвует в различных воспалительных и иммунных процессах. Его относят к одному из главных регулирующих белков при формировании иммунного ответа и воспаления. Как Th1, так и Th2-клетки продуцируют ФНО-альфа, однако чаще его секреция преобладает у Th2-клеток. Согласно гипотезе Т.Wegmann и других авторов, во время нормальной беременности происходит естественный сдвиг между Th1 и Th2 клетками в сторону преобладания Th2 хелперных клеток, что позволяет беременности развиваться нормально. [41]. Существует мнение, что у женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза этот механизм нарушен. Как известно, Th-1 клетки продуцируют провоспалительные цитокины, которые поддерживают воспалительный процесс, который в свою очередь, может привести к гибели плода, а Th-2 клетки отвечают за выработку регуляторных цитокинов. Недавно была выдвинута гипотеза, согласно которой отклонения в сторону Th-1 опосредованного иммунного ответа, сопровождающегося выработкой ИФ-гамма и ФНО- , вносят немалый вклад в патогенез невынашивания беременности аллоиммуного генеза.
Основная мысль этой гипотезы основана на том, что эмбрион (плод), генетически наполовину чужеродный по отношению к материнскому организму, является катализатором локальной клеточной иммунной реакции, направленной против его же антигенов, в результате происходит отторжение плода и прерывание беременности. Авторы делают выводы, что у пациенток с привычным выкидышем, антигены трофобласта влияют на активацию цитотоксических Т-лимфоцитов и макрофагов, что в свою очередь индуцирует клеточный иммунный ответ. Регуляция этого процесса определяется цитокинами Тh1-клеток – ФНО- и ИФ-гамма, которые оказывают эмбриотоксическое действие, что ведет к потере беременности. Таким образом, высокое содержание в периферической крови провоспалительных цитокинов, а именно (ФНО , ИФН-гамма, ИЛ-2) обнаруживается у пациенток с привычным невынашиванием беременности достоверно чаще, чем у женщин с нормальной репродуктивной функцией [42]. Нарушения иммунного ответа Th1-типа, выявляются у 60–80% небеременных женщин, в анамнезе у которых были потери беременности на ранних сроках. В то же время, у женщин с ненарушенной репродуктивной функцией подобные нарушения наблюдались менее чем в 3% случаев. Было также показано, что у женщин с физиологической беременностью наблюдается преимущественно Тh2-тип иммунного ответа в отличие от пациенток с привычным выкидышем, у которых преобладает Тh1-тип иммунного ответа, возникающий в ответ на антигены трофобласта [43]. Таким образом, нарушенный баланс цитокинов способен препятствовать нормальному течению беременности в зависимости от вида ответа, уровня факторов и стадии дифференцировки потенциальных тканей-мишеней.
Клиническая характеристика женщин исследуемых групп
Для уточнения генеза привычного невынашивания беременности, было суммарно обследовано 320 пар, в анамнезе у которых были две и более потери беременности на ранних сроках.
В результате обследования выявлено, что сбалансированные хромосомные перестройки родителей были причиной привычного выкидыша в 3,6% случаев, тромбофилии высокого риска в 6,3%, анатомические факторы (пороки развития матки, синехии, субмукозные узлы миомы матки, полипы эндометрия) в 14,4% случаев. Гормональные нарушения (гиперпролактинемия, поликистозные яичники, недостаточность лютеиновой фазы, сахарный диабет, гипотиреоз) послужили причиной привычных потерь беременностей в 20,0% наблюдений, антифосфолипидный синдром диагностирован в 19,7% случаев, из них в 3,8% - вторичный АФС на фоне системных заболеваний соединительной ткани. У 15 пациенток (4,7%) диагностирована тяжелая экстрагенитальная патология (хронические заболевания печени, почек, артериальная гипертония), в 10 случаях (3,1%) определен мужской фактор как единственная причина привычного выкидыша, рекомендованы методы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Мужской фактор в сочетании с другими причинами привычного выкидыша отмечен у 41 (12,8%) супружеской пары с привычным выкидышем. В 20 наблюдениях (6,3%) диагностированы обострения хронических воспалительных заболеваний органов малого таза – сальпингит, сактосальпингс, оофорит, тубоовариальные образования, потребовавшие как консервативного, так и хирургического лечения.
После исключения вышеуказанных причин, в группу исследования отобраны 70 супружеских пар с привычным выкидышем, у которых генез потерь беременности оставался неясным и, возможно, был обусловлен аллоиммунными причинами. Супружеские пары с неясным генезом привычных выкидышей составили 22,0 % от общего количества обследованных супружеских пар. Отбор пациенток в основную группу проводился вне беременности на стадии предгестационного обследования и подготовки. Предгестационное обследование включало в себя полное клинико-лабораторное обследование супружеских пар и специальные методы исследования.
В результате, в группу исследования отобраны 70 супружеских пар с привычным выкидышем, у которых генез потерь беременности оставался неясным и, как было установлено при иммунологическом обследовании, был обусловлен аллоиммунными причинами. Были изучены клинические и анамнестические данные 70 пациенток, вошедших в исследование. Также проанализированы данные 26 женщин контрольной группы с ненарушенной репродуктивной функцией. При сборе анамнеза пациенток учитывалось социально-экономическое положение, возраст, наследственность, наличие профессиональных вредностей, экстрагенитальная патология, характер менструальной функции, количество беременностей в анамнезе, наличие заболеваний органов малого таза.
Возраст обследованных женщин колебался от 20 до 40 лет. Средний возраст женщин основной группы составил 30,1±4,2 лет, контрольной группы 28,2±4,4 лет. Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту, данные представлены в таблице 1.
Практически все супружеские пары проживали в сходных климатогеографических условиях, преимущественно в Москве и Московской области, принадлежали к среднему социально экономическому классу, имели среднее и высшее образование; условия труда не были связаны с профессиональными вредностями.
При анализе генеалогического анамнеза пациенток основной и контрольной групп обращает на себя внимание наличие наследственных заболеваний у родственников I и II cтепени родства. У пациенток основной группы наследственность была отягощена в основном заболеваниями сердечно-сосудистой системы (у 18 пациенток – 25,7%).
Также были выявлены онкологические заболевания у близких родственников (у 7 пациенток – 10,0%) и заболевания аутоиммунной природы (у 3 пациенток (4,3%) у близких родственников – инсулинзависимый сахарный диабет).
При анализе соматических заболеваний выявлено, что у женщин с привычным выкидышем отмечался наиболее высокий процент перенесенных инфекционно-воспалительных заболеваний. Так, у 19 (27,1%) женщин в анамнезе был хронический тонзиллит, у 11 (15,7%) женщин в анамнезе был хронический цистит, у 7 (10,0%) хронический пиелонефрит.
Заболевания сердечно-сосудистой системы в виде вегето сосудистой дистонии по гипотоническому и гипертоническому типу выявлены у 7,1%; пролапс митрального клапана отмечался у 15,7% женщин; варикозное расширение вен нижних конечностей наблюдалось у 7,1% женщин; заболевания органов дыхания в виде хронического бронхита отмечены у 11%. Из заболеваний желудочно-кишечного тракта отмечены: хронический гастрит у 2 женщин (2,8%), язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки у 1 (1,4%) и дискинезия желчевыводящих путей у 3 (4,3%) женщин. Заболевания мочевыделительной системы в виде хронического пиелонефрита и цистита отмечены у 18 (25,7%) женщин.
Заболевания опорно-двигательного аппарата также достоверно не различались по частоте в основной и контрольной группах и были представлены сколиозом грудного отдела позвоночника и остеохондрозом, преимущественно, поясничного отдела позвоночника.
Оперативные вмешательства в анамнезе были в виде аппендэктомии у 11 (15,7%) и тонзилэктомии у 4 (5,7%) женщин в детском возрасте.
При анализе частоты гинекологических заболеваний было выявлено, что в 27 (38,5%) случаях у женщин основной группы в анамнезе отмечен хронический эндометрит и/или сальпингит, оофорит, пролеченный до наступления данной беременности, что достоверно превышает частоту воспалительных заболеваний в контрольной группе (таблица 3).
Оперативные вмешательства в анамнезе по поводу полипа эндометрия, внутриматочных синехий, эндометриоза, эндометриоидных кист были проведены в 25 (35,7%) случаях у женщин основной группы. Эктопия шейки матки также встречалась гораздо чаще у женщин основной группы, чем у пациенток контрольной.
Результаты иммунологического обследования женщин на фоне проведения предгестационной иммуноцитотерапии
После проведения иммунологического обследования и оценки субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин с привычным выкидышем до назначения иммуноцитотерапии к проведению данной процедуры были допущены 56 супружеских пар. У 14 супружеских пар (20%) к проведению данной процедуры в ходе полного обследования были выявлены противопоказания (носительство HBs, HCV у супруга; арталгии различного генеза и др.).
У 56 супружеских пар, отобранных для проведения иммуноцитотерапии, исследовали динамику субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови, включая субпопуляции киллерных клеток с различным фенотипом, естественных Т-регуляторных клеток и клеток, экспрессирующих CD200, в процессе предгестационной иммуноцитотерапии. В качестве подготовки к беременности женщинам с привычным выкидышем была назначена процедура иммуноцитотерапии (ИЦТ) – иммунизация женщин аллогенными клетками партнеров, которую проводили дважды с интервалом в один месяц с 5 по 9 день менструального цикла. При этом пациенткам подкожно вводили 50 млн клеток лейкоцитарной взвеси партнера в ладонную поверхность предплечья в 10-12 точек.
Кровь у женщин для анализа забирали натощак из локтевой вены до иммунизации и после каждого введения клеток на 18-22 день менструального цикла.
Было проанализировано содержание лимфоцитов различных фенотипов в периферической крови женщин с привычным выкидышем до назначения лечения и после каждой процедуры аллоиммунизации. Результаты исследования представлены в таблице 19.
Из таблицы 19 следует, что двукратная аллоиммунизация статистически значимо не влияла на содержание основных субпопуляций лимфоцитов, за исключением некоторых колебаний в содержании субпопуляций клеток с цитотоксической функцией. После первой процедуры значимо уменьшилось содержание лимфоцитов с фенотипом CD56+, CD3"CD56,16+, CD56,16+, а в содержании лимфоцитов с фенотипом CD3+CD16+ была отмечена тенденция к уменьшению (р=0,066). После 2 процедуры содержание лимфоцитов с фенотипом CD56+ и с фенотипом CD3-CD56,16+ вернулось к исходным значениям, содержание лимфоцитов с фенотипом CD56,16+ осталось меньшим по сравнению с исходными значениями, а содержание лимфоцитов с фенотипом CD3+CD16+ увеличилось по сравнению с уровнем после первой процедуры, но без отличий от исходного уровня.
В предыдущей главе (3.2) было показано, что содержание субпопуляционного состава лимфоцитов различных различается у пациенток с привычным выкидышем и фертильных женщин [114]. Сравнение динамики субпопуляций лимфоцитов женщин с привычным выкидышем в процессе предгестационной подготовки и содержания лимфоцитов в крови женщин контрольной группы отражено на рисунке 2.
При проведении иммунизации не менялись выявленные до ее начала особенности в содержании субпопуляций лимфоцитов (отсутствие различий в содержании CD4+, CD8+, CD19+-лимфоцитов, увеличение содержания CD200+-лимфоцитов и лимфоцитов с киллерной функцией и фенотипом CD56+, CD3-CD56,16+, CD56,16+, CD3+CD16+, снижение содержания Трег) по сравнению с контролем. Лишь относительное содержание субпопуляций клеток с фенотипом CD3+CD56,16+ стало сходным с содержанием в контрольной группе после первой процедуры иммунизации. Однако после 2 процедуры аллоиммунизации различия с контролем восстановились. Такая же динамика была выявлена при оценке абсолютного содержания лимфоцитов с фенотипом CD56,16+.
Обнаружено также, что после иммунизации увеличилось по сравнению с контролем абсолютное содержание B1-лимфоцитов с фенотипом CD5+CD19+.
Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови женщин основной группы с пролонгированной и прервавшейся беременностью
Иммунизация аллогенными лимфоцитами полового партнера используется в лечении женщин с ПВ уже продолжительное время (более 30 лет), но до настоящего времени влияние этой процедуры на состояние иммунной системы женщин остается невыясненным.
В данной работе проанализирован субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови женщин с привычным выкидышем аллоиммунного генеза в период предгравидарной (предгестационной) подготовки и в первом триместре наступившей беременности.
Беременность наступила у 37 женщин основной группы, из них в течение первых 3 месяцев - у 37 %, первых 6 месяцев - у 63% . В первом триместре беременных иммунизировали в сроке 5-6 недель и 8-9 недель беременности. Кровь для исследования брали в сроке 5-6 недель до 1-ой иммунизации во время беременности, в 8-9 недель и 12 недель гестации после введения клеток.
У 6 женщин беременность прервалась в сроках до 16 недель.
Было проведено ретроспективное сравнение динамики исследованных субпопуляций лимфоцитов в группе женщин с беременностью, завершившейся рождением живого ребенка, и у женщин с состоявшимся выкидышем с начала обследования, включая предгестационную подготовку и в сроках 5-6 недель наступившей беременности.
До назначения иммунотерапии в предгестационной подготовке пациентки с пролонгированной беременностью и с выкидышем не отличались по содержанию Трег-клеток, CD200+, BI и BII-клеток, но содержание клеток с естественной киллерной активностью у пациенток с выкидышем было значимо меньше. Динамика указанных субпопуляций лимфоцитов в процессе наблюдения от назначения иммуноцитотерапии до конца I триместра отражена на рисунках 5 и 6. Различий в содержании NKT-лимфоцитов (с фенотипом CD3+CD16+ и CD3+CD56,16+) между двумя группами пациенток с ПВ и до назначения лечения и в динамике наблюдения не обнаружено.
Динамика субпопуляций с естественной киллерной активностью (CD56+, CD16+, CD56,16+, CD3-CD56,16+, CD3-CD16+), а также субпопуляции с цитотоксической активностью CD3-CD8+ у пациенток с разными исходами первого триместра представлена на рисунке 6. Как видно из рисунка 6, уже до предгестационной подготовки содержание субпопуляций с киллерной активностью у женщин с состоявшимся выкидышем было ниже, чем у женщин с пролонгированной беременностью. В 5 -6 недель наступившей беременности у женщин с состоявшимся выкидышем содержание субпопуляций CD56+, CD56,16+, CD3+CD56,16+, CD3-CD56,16+ лимфоцитов было значимо низким не только по сравнению с содержанием у пациенток с пролонгированной беременностью, но и по сравнению с исходными значениями.
При отсутствии различий между группами в содержании цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3-CD8+ до начала лечения, в 5-6 недель наступившей беременности у женщин с состоявшимся выкидышем содержание этой субпопуляции также стало ниже, чем у женщин с пролонгированной беременностью, как и содержание киллерных субпопуляций (рисунок 6).
Характеристика диагностической значимости определения субпопуляций с киллерной активностью, В-клеток и CD200+-клеток для прогноза выкидыша у пациенток с ПВ в 5-6 недель наступившей беременности после предгестационной аллоиммунизации представлена в таблице 21.
Как следует из представленных данных, лучшими характеристиками чувствительности, специфичности для прогноза потери беременности в I триместре обладают тесты определения содержания CD3-CD16+, CD56+, CD45+CD56,16+-клеток. Показано, что у ПВ после аллоиммунизации в прегестационной подготовке, в 5-6 недель наступившей беременности при содержании указанных субпопуляций ниже критериальных значений со 100%-ой вероятностью можно прогнозировать потерю беременности.