Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль вспомогательного хетчинга в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы) 12
1.1 Актуальность проблемы бесплодия 12
1.2 Понятие хетчинга 14
1.3 Причины неудач спонтанного хетчинга .15
1.4 Показания к проведению вспомогательного хетчинга и его эффективность 25
1.5 Методы выполнения вспомогательного хетчинга 27
1.6 Осложнения вспомогательного хетчинга 29
Глава 2.Материалы и методы исследования .32
2.1 Дизайн исследования для задачи 1 32
2.2. Дизайн исследования для задач 2-3 37
2.3. Дизайн исследования для задачи-4 38
2.4 Критерии включения в исследование .38
2.5 Расчет объема выборки 39
2.6 Методы исследования 40
2.6.1 Общеклинические методы исследования 43
2.6.2. Ультразвуковое исследование органов малого таза 44
2.6.3 Гормональное исследование .45
2.6.4 Исследование эякулята 46
2.6.5 Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция фолликулов 47
2.6.6 Морфологическая оценка ооцитов и оплодотворение .48
2.6.7 Оценка качества бластоцист 49
2.6.8. Определение наличия спонтанного хетчинга .50
2.6.9. Изучение экспрессии генов CTSL-2, GATA3, CGB, HLA-G 50
2.6.10 Перенос эмбрионов в полость матки и ведение посттрансферного периода .53
2.7 Статистическая обработка полученных данных 54
Глава 3. Предикторы эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах вспомогательных репродуктивных технологий .56
3.1. Роль эмбриональных факторов в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ 56
3.2 Роль качества гамет в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ 58
3.3 Роль качества эмбрионов и криоконсервации в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ .59
3.4 Определение клинико-лабораторных факторов, влияющих на эффективность спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ .62
3.5. Роль эмбриональных факторов (экспрессия генов CTSL2, GATA3, CGB) в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ 63
3.6. Модель прогноза эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ .65
Глава 4. Исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток в зависимости от наличия и вида вспомогательного хетчинга .68
4.1. Клинико-анамнестические данные пациентов .68
4.2 Лабораторные данные пациентов .73
4.3. Особенности протоколов стимуляции суперовуляции 75
4.4. Характеристика оогенеза и раннего эмбриогенеза .76
4.5. Клинико-лабораторные показания к проведению вспомогательного хетчинга 78
4.6. Исходы программ ВРТ .80
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 85
Выводы .99
Практические рекомендации .101
Список сокращений и условных обозначений 102
Список литературы .105
- Причины неудач спонтанного хетчинга
- Роль качества эмбрионов и криоконсервации в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ
- Клинико-анамнестические данные пациентов
- Исходы программ ВРТ
Причины неудач спонтанного хетчинга
Далеко не все бластоцисты способны осуществить хетчинг, даже если зона пеллюцида надорвана. Бластоциста затрачивает определенное время (от нескольких часов до суток), чтобы освободиться из надорванной оболочки. Длительный или неудачный хетчинг может быть фактором, снижающим частоту наступления беременности в программах ЭКО.
По данным литературы,на неэффективность хетчингаоказывают влияние такие факторы, кактолщина блестящей оболочки,изменениеее структуры и отсутствие дифференцировки клеток трофобласта(22,23).В циклах ВРТ часто можно наблюдать появление ооцитов и эмбрионов с нарушенной зоной пеллюцида - уплотнением, деформацией и изменениемее строения.Было показано, что утолщение или затвердевание зоны пеллюцида провоцируется средой культивирования(24)или криоконсервацией эмбрионов(25).Использование витрифицированных-размороженных эмбрионов позволяет снизить риск развития синдрома гиперстимуляции яичников и других осложнений проведения стимуляции овуляции ввиду отсутствия необходимости проведения повторных циклов стимуляции суперовуляции.
Технологии криоконсервации гамет и эмбрионов также постоянно развиваются. Это позволило увеличить процент жизнеспособных после разморозки эмбрионов с 40% до 80-90%, что способствовало внедрению метода в клиническую практику(26,27).Coticchio и соавторы в своем исследовании показали, что витрификация не влияет на оплодотворение и раннее эмбриональное развитие (частота оплодотворения в группах свежих и витрифицированных-размороженных ооцитов составила 81,9% и 81,4%, соответственно, р0,05)(28). Существует мнение, что криоконсервация может приводить к снижению частоты оплодотворения за счет утолщения блестящей оболочки(25), но эту проблему в клинической практике можно решить при помощи ИКСИ.
Основным вопросом остается влияние криоконсервации эмбрионов на потенциал к имплантации и постимплантационному развитию, которое должно привести к рождению здорового ребенка. Исследователи показали, что витрификация не приводит к снижению частоты имплантации. Частота имплантации при переносе витрифицированных и не подвергавшихся витрификации эмбрионов отличного качества составила 41,6% и 44,3%, соответственно (р0,05)(29).
Развитие эмбриона in vitro, предположительно, происходит медленнее, чем in vivo, поэтому и хетчинг при проведении экстракорпорального оплодотворения потенциально может происходить медленнее. Эмбрион при культивировании in vitro находится в субоптимальных условиях, поскольку состав культуральных сред не идентичен содержимому полости маточных труб и матки. Вследствие этого может происходить изменение конфигурации блестящей оболочки.
Группа ученых из Дании провела исследование, посвященное влиянию метода оплодотворения (инсеминация ооцитов in vitro или ИКСИ) на протекание хетчинга и клинический результат ЭКО(30). Исследователи выделили два типа хетчинга: с предшествующей пенетрацией блестящей оболочки трофэктодермальными отростками (ТЭО)и без таковой. В первом случае выход бластоцисты происходил через постепенно расширяющееся отверстие блестящей оболочки, во втором - наблюдался быстрый и обширный разрыв блестящей оболочки со стремительной экспансией бластоцисты. Было показано, что использование метода ИКСИ ведет к развитию хетчинга по первому типу (97,7% всех наблюдений по сравнению с 55,8% в группе без ИКСИ, p 0,001). Также авторы показали, что при оплодотворении методом ИКСИ хетчинг начинается раньше, чем без ИКСИ (95,9 часов по сравнению 99,7 часов после оплодотворения, p 0,001). При этом как метод оплодотворения, так и тип спонтанного хетчинга не оказывал влияния на частоту наступления беременности (p=0,72).
Процесс хетчинга бластоцисты человека был изучен in vitro с использованием методики морфокинетического наблюдения, однако сравнение полученных результатов затруднено по причине различий в используемом оборудовании, культуральных средах и условиях культивирования. Известно, что в период, предшествующий хетчингу, происходит транспорт жидкости в полость бластоцисты, приводящий к повышению гидростатического давления. В результате блестящая оболочка истончается, что является важным для нормального протекания процесса хетчинга(31).Что касается времени наступления самостоятельного хетчинга, в исследовании Menezes и соавторов(32)хетчинг наблюдался во временном промежутке 120-148 часов после оплодотворения.
Mio и Maeda наблюдали хетчинг в донированной бластоцисте через 104 часа после оплодотворения. При этом происходило однократное быстрое сокращение бластоцисты и последующий разрыв блестящей оболочки. Весьпроцессзанималоколо 7,5 часов(33).Полость бластоцисты восстанавливалась в объеме, затем начинался выход бластоцисты из блестящей оболочки. После того как бластоциста выходила из блестящей оболочки более чем наполовину, процесс хетчинга значительно ускорялся.
Среди клеток трофобласта выделены специализированные клетки, отвечающие за первичное разрушение зоны пеллюцида. Морфологически эти клетки отличаются от большей части клеток трофэктодермы, так как они приобретают шаровидную форму и имеют пальцевидные выросты. Данные клетки названы «разрывающими оболочку» клетками (англ. «zona-breaker» cells)(31). Было показано, что они способствуют прободеванию блестящей оболочки.
Разрыв блестящей оболочки, как правило, происходил в области, находящейся на противоположном от внутренней клеточной массы полюсе бластоцисты, однако, в редких случаях, хетчинг возможен в других областях блестящей оболочки (31). «Разрывающие оболочку» клетки, помимо расположения с обеих сторон от блестящей оболочки в зоне предстоящего хетчинга, характеризуются наличием большого числа микроворсинок, лизосом и активной секрецией везикул, взаимодействующих с блестящей оболочкой в области предстоящего хетчинга, что позволяет предположить, что процесс хетчинга зависит как от механических, так и от химических факторов. Также в этих клетках визуализируются крупные пучки сократительных тонофиламентов, проходящих вдоль разрыва блестящей оболочки наподобие сфинктера или воронки.
Большой интерес исследователей в области изучения патологии биологии развития представляет формирование ТЭО, существование которых было показано для многих видов млекопитающих. ТЭО бластоцисты человека были описаны с использованием морфокинетического наблюдения как пальцевидные цитоплазматические выросты трофэктодермы (34).Высокое содержание актина в ТЭО было показано в экспериментах с использованием иммунофлуоресцентной окраски и конфокальной микроскопии(3,35). Данные исследований ТЭО у человека совпадают с данными, полученными на других видах млекопитающих, и свидетельствуют об участии ТЭО в процессе хетчинга бластоцисты за счет прохождения через блестящую оболочку и инициацию ее разрыва (3). Также в работах высказываются предположения об участии ТЭО в процессе имплантации бластоцисты.
В настоящее время большое внимание уделяется генетическим причинам неудач хетчинга.У человека зона пеллюцида состоит из четырех гликопротеинов, носящих названиеZP1-ZP4(36,37). Аномальная продукция или секреция этих гликопротеинов может приводить к изменению структуры зоны пеллюцида и неспособности связывания с ней сперматозоидов, что приводит к нарушению оплодотворения.Гликопротеины ZP2, ZP3 и ZP4 могут связываться с капацитирующими сперматозоидами и/или сперматозоидами, вступающими в акросомную реакцию (38).ГликопротеиныZP3иZP4 могутвызыватьакросомнуюреакцию(39).Роль человеческого ZP1 в связывании со сперматозоидами и в провоцировании акросомной реакции не до конца изучена (40). По результатам опытов на мышах, нокаутированных по генам блестящей оболочки, все три мышиных гликопротеина (ZP1-ZP3), вероятно, необходимы для сохранения структуры зоны пеллюцида, поскольку исключение хотя бы одного из этих гликопротеинов влечет за собой нарушение структуры оболочки (41)или даже её полное разрушение(42,43). В работе PоkkylаR.,с соавторами было выявлено, чтополиморфизм генов ZP1-ZP4у женщин в программах ВРТ часто сочетается с различными аномалиями блестящей оболочки (тонкая, толстая, овальная, удвоенная), а полная потеря ZP2 может привести к истончению блестящей оболочки также, как это наблюдается у мышей, нокаутированных по гену ZP2(44).
Роль протеиназ в процессе хетчинга не вызывает сомнений и была доказана в экспериментах с добавлением ингибиторов протеиназ в культуральную среду к бластоцистам, что приводило к полной неспособности бластоцисты к хетчингу(45). В зависимости от вида млекопитающего, в процессе хетчинга принимают участие разные классы протеиназ: сериновые, цистеиновые, металлопротеиназы. На данный момент основным вопросом остается выявление протеиназ хетчинга, специфичных для человека, однако исследования в данной области крайне немногочисленны по этическим соображениям и носят характер предположений и экстраполяций.
Роль качества эмбрионов и криоконсервации в эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ
22,8% включенных в исследование эмбрионов (n=19) были подвергнуты криоконсервации, которая улучшала эффективность хетчинга бластоцист в 6,9 раз (ОР=6,9; 95% ДИ=2,2;22,1), что, по-видимому, объясняется лучшим качеством бластоцист, подвергнутых криоконсервации, а также может быть связано с механическо-физическим воздействием процедуры криоконсервации на блестящую оболочку (Таблица 4). Действительно, при проведении корреляционного анализа было выявлено, что проведение криоконсервации связано с качеством внутренней клеточной массы (r=0,3367, р=0,0210) и качеством трофэктодермы (r=0,2880, р=0,0500) бластоцист.
При оценке качества бластоцист на 5-е сутки культивирования по классификации Гарднера, было выявлено, что качество бластоцист влияет на их способность к хетчингу: чем лучшего качества были бластоцисты, тем они чаще совершали спонтанный хетчинг.
Большая часть бластоцист была 4-й степени зрелости (n=45, 54,2%). При этом бластоцист 5-й степени зрелости было значимо больше в группе 1, а бластоцист 2-й и 3-й степени зрелости - в группе 2 (р 0,0001) (Таблица 4, Рисунок 10А).
Внутренняя клеточная масса (ВКМ) категории А в равном числе случаев была выявлена в обеих группах. Тогда как ВКМ категории В было больше в группе 2 по сравнению с группой 1 (48,9% и 16,7% соответственно), а ВКМ категории С - больше в группе 1 по сравнению с группой 2 (55,5% и 21,3% соответственно) (р=0,0017) (Таблица 4, Рисунок 10Б).
Трофэктодермальный слой (ТФЭ) в равном числе случаев был оценен на категории A, B или C. При этом ТФЭ категории А был выявлен у 47,2% бластоцист группы 1 и лишь у 23,4% бластоцист группы 2, тогда как ТФЭ категории С был выявлен у 44,7% бластоцист группы 2 и у 11,1% бластоцист в группе 1 (р=0,0030) (Таблица 4, Рисунок 10В).
На основании характеристик зрелости бластоцист, качества ВКМ и ТФЭ была выделена группа бластоцист отличного качества, к которым относились бластоцисты 4 или 5 класса с ВКМ категории А и качеством ТФЭ категории А. В группе 1 таких бластоцист было значимо больше - 12 (33,3%), в группе 2 - 7 (14,9%) (р=0,0475).
Клинико-анамнестические данные пациентов
В соответствии с поставленной целью поставленными задачами в исследование были включены 309 супружеских пар с бесплодием различного генеза, которые соответствовали критериям включения и подписавшие информированное согласие на участие в исследование, которые были разделены на следующие группы:
группа 1 (п=209) - пациенты, у эмбрионов которых был проведен вспомогательный хетчинг
группа 1а (п=106) - пациенты, у эмбрионов которых было проведено частичное удаление зоны пеллюцида (лазерный хетчинг);
группа 1б (п=103) - пациенты, у эмбрионов которых было проведено полное удаление зоны пеллюцида (ферментативный хетчинг);
группа 2 (п=100) - пациенты, эмбрионам которых хетчинг не был проведен.
Были проанализированы клинико-анамнестические характеристики групп, которые могли явиться показаниями к проведению вспомогательного хетчинга бластоцист (сравнение групп 1 и 2), или быть конфаундерами при оценке влияния различных видов вспомогательного хетчинга на эффективность программ ВРТ (сравнение групп 1а, 1б и 2).
Средний возраст пациенток не различался в группах сравнения и составил (32,1±4,1) лет в группе 1: (32,7±3,9) лет и (31,5±4,3) лет в подгруппах 1а, 1б, и (31,8±4,0) лет в группе 2 (р 0,05). При анализе антропометрических данных (рост, масса тела и, как следствие, ИМТ), социально-экономических характеристик (образование, семейное положение) и вредных привычек (курение) не было выявлено различий в данных показателях в группах сравнения (Таблица 8).
При оценке менструальной (возраст менархе, длительность менструального цикла, продолжительность менструального кровотечения) и половой функции (возраст начала половой жизни, прием контрацептивов) не было выявлено статистически значимых различий между группами (р 0,05) (Таблица 9).
Гинекологическая заболеваемость пациенток не различалась в группах наблюдения, и была представлена в виде хронического сальпингоофорита, миомы матки малых размеров, наружного генитального эндометриоза 1-2 ст., синдрома поликистозных яичников (СПКЯ) и хламидийной инфекции в анамнезе. Инфекционные и воспалительные заболевания органов малого таза были пролечены до вступления женщины в программу ВРТ. При анализе данных о частоте оперативных вмешательств на органах малого таза(сальпингоовариолизис, тубэктомия по поводу гидросальпинкса, резекция яичников по поводу эндометриоидных кист яичников) не было выявлено статистически значимых различий между группами. Продолжительность бесплодия была сопоставимой в 3-х группах пациенток, и в среднем составила 5,5 лет (Таблица 10).
Акушерский анамнез (общее число беременностей, число родов, число самопроизвольных и искусственных прерываний беременности) также не различался в изучаемых группах. Число попыток ЭКО в анамнезе было меньше в группе 2 по сравнению с группой 1 пациенток. При этом чиcло попыток ЭКО не различалось между подгруппами 1а и 1б (Таблица 11).
В структуре экстрагенитальной патологии не было выявлено статистически значимых. Заболевания верхних дыхательных путей были представлены хроническим тонзиллитом, заболевания желудочно кишечного тракта (ЖКТ) - хроническим гастритом, урологические заболевания - хроническим циститом, аллергические заболевания атопическим дерматитом и бронхиальной астмой, заболевания эндокринной системы - гипотиреозом (Таблица 12).
Исходы программ ВРТ
Группы 1а и 1б не отличались между собой по всем клинико-анамнестическим и лабораторным параметрам вследствие рандомизации, что представлено в таблицах 8-17. Также при оценке клинико-лабораторных данных пациенток в группе с наступившей и не наступившей беременностью не было выявлено дополнительных факторов, влияющих на ее наступление, т.е. группы были сопоставимы между собой по всем возможным факторам. Таким образом, не были выявлены какие-либо дополнительные конфаундеры, оказывающие влияние на исходы программ ВРТ.
Частота биохимической беременности не различалась в группах сравнения и составила в группе 1 38,7% (81 случай): в подгруппе 1а -34,9% (37 случаев), в подгруппе 1б - 42,7% (44 случая), в группе 2 - 35% (35 случаев) (р=0,5235 для сравнения групп 1 и 2, р=0,4133 для сравнения 3-х групп).
Клиническая беременность наступила у 74 (35,4%) пациенток группы 1: у 30 - в подгруппе 1а (28,3%), у 44 - в подгруппе 1б (42,7%), и у 27 женщин в группе 2 (27%) (р=0,1404 для сравнения групп 1 и 2, р=0,0286 для сравнения 3-х групп), т.е. была наступила значимо чаще в группе пациенток с полным удалением ZP переносимого эмбриона. ОШ клинической беременности в группе ферментативного хетчинга по сравнению с отсутствием хетчинга составило 1,9 (95% ДИ=1,01;3,6). ОШ клинической беременности в группе ферментативного хетчинга по сравнению с проведением лазерного хетчинга также составило 1,9 (95% ДИ=1,02;3,5).
Частота самопроизвольных прерываний беременностей была несколько выше у пациенток группы 1б, хотя и не статистически значимо. Было диагностировано 20 потерь беременности в сроке до 22 недель гестации: 5 - в группе 1а (4,7%), 11 - в группе 1б (10,7%), 4 - в группе 2 (4%) (р=0,1022).
В группе 1 беременность закончилась родами у 58 (27,7%) пациенток: у 25 (23,6%) в подгруппе 1а и у 33 (32,0%) в подгруппе 1б. В группе 2 беременность закончилась родами у 23 (23%) пациенток (р=0,3742 для сравнения групп 1 и 2, р=0,2567 для сравнения 3-х групп).
Всего родилось 89 детей: в группе 1 у 52 пациенток родилось по 1 ребенку, у 6 родились монозиготные двойни, в группе 2 у 23 пациенток родилось по 1 ребенку, у 2 родились двойни (р=0,6520). При сравнении 3-х групп было выявлено, что все двойни родились в группах 1а (n=6, 5,7%) и 2 (n=2, 2%). В группе 1б многоплодных беременностей зарегистрировано не было (р=0,0327). Таким образом, многоплодие при проведении лазерного хетчинга по сравнению с проведением ферментативного хетчинга наблюдалось в 5,7 раза чаще, а при отсутствии хетчинга по сравнению с проведением ферментативного хетчинга - в 2 раз чаще (Рисунок 13).
Таким образом, исходы программ ВРТ не различались у пациенток, эмбрионы которых были и не были подвергнуты процедуре вспомогательного хетчинга, однако в подгруппе с полным удалением ZP у переносимых в полость матки бластоцист частота наступления беременности была значимо выше (в 1,9 раза), а частота многоплодия значимо ниже (в 2-6 раз) по сравнению с группами с лазерным хетчингом и отсутствием хетчинга.
Далее, для определения эффективности проведения вспомогательного хетчинга в зависимости от наличия и отсутствия выявленных показаний для его проведения, пациентки были поделены на группы по принципу наличия и отсутствия данных показаний. Группу А составили пациентки с уровнем АМГ 2 нг/мл, или пациентки с числом бластоцист 4 (n=228). Группу Б составили пациентки с уровнем АМГ2 нг/мл и числом бластоцист более и равным 4 (n=81). В группе А вспомогательный хетчинг был проведен 175 пациенткам (76,7%) - группа А1, и не проведен 53 пациенткам (23,3%) - группа А2. В группе Б вспомогательный хетчинг был проведен 34 пациенткам (42%) - группа Б1, и не проведен - 47 пациенткам (58%) (р 0,0001). Таким образом, 1/3 пациенткам, у которых были выявленные показания для вспомогательного хетчинга, он не был проведен, однако почти 1/2 пациенток без выявленных показаний к его проведению, он был проведен. Исходы программ ВРТ в подгруппах пациенток представлены в таблице 18 и рисунке 14. Частота биохимической и клинической беременности не различались в представленных группах пациенток, однако частота живорождения была значимо ниже у пациенток с наличием показаний к вспомогательному хетчингу, у которых он не был проведен (ОР=1,9; 95% ДИ=1,05; 3,6).
Частота монозиготных двоен была максимальной у пациенток с отсутствием показаний для вспомогательного хетчинга, но у которых он был проведен (р 0,0001). Таким образом, как отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии показаний к его проведению, так и его проведение при отсутствии к этому показаний, приводит к снижению эффективности программ ВРТ и развитию их осложнений (повышении риска монозиготных многоплодных беременностей).