Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные тенденции применения ВРТ в клинической практике при преждевременной лютеинизации (Обзор литературы) 14
1.1 Значение ВРТ в лечение бесплодия 14
1.2 Современные подходы к контроллируемой стимуляции суперовуляции в программах ВРТ 15
1.2.1. Антагонисты гонадотропин релизинг гормона 18
1.3. Сравнительная эффективности мочевых и рекомбинантных гонадотропинов 23
1.4. Повышение уровня прогестерона в период КОС
1.4.1. Преждевременная лютеинизация 25
1.4.2. Влияние преждевременной лютеинизации на частоту наступления беременности 27
1.4.3. Критерии пороговых значение прогестерона
1.5. Эмбриологические аспекты циклов ВРТ в зависимости от выбранного гонадотропина 31
1.6. Роль ЛГ в фолликулогенезе 33
1.7. Процесс имплантации эмбриона 37
1.7.1. Рецептивность эндометрия 38
1.8. Влияние преждевременной лютеинизации на рецептивность эндометрия 41
1.9. Молекулярно-генетические аспекты рецептивности эндометрия 42
1.10. Методы профилактики ПЛ 45
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 49
2.1. Объем исследования и клиническая характеристика больных 49
2.2. Методы исследования з
2.2.1 Общеклинические методы исследования 53
2.3. Схема стимуляции функции яичников 57
2.3.1. Индукция овуляции рекомбинантным ФСГ 58
2.3.2. Индукция овуляции с применением ЧМГ
2.4. Оценка морфологии и зрелости полученных ооцитов 60
2.5. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование рецептивности эндометрия 62
2.6. Молекулярно-генетическое исследование эндометрия 64
2.7. Статистическая обработка данных 65
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 66
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток 66
3.2. Сравнительный анализ параметров индуцированного цикла при использовании двух протоколов стимуляции яичников 69
3.2.1. Сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей исследуемых групп пациенток 69
3.2.2. Репродуктивный анамнез у обследованных пациенток 71
3.3. Результаты комплексного клинико-лабораторного обследования пациенток 73
3.4 Анализ индуцированного цикла 75
3.5. Эмбриологические, клинические и гормональные аспекты проведения программы ВРТ 91
3.6. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика эндометрия 99
3.7. Экспрессия мРНК генов в эндометрии и цервикальной слизи 105
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 114
Выводы 131
Практические рекомендации
Список сокращений 135
Список литературы
- Повышение уровня прогестерона в период КОС
- Общеклинические методы исследования
- Сравнительный анализ параметров индуцированного цикла при использовании двух протоколов стимуляции яичников
- Эмбриологические, клинические и гормональные аспекты проведения программы ВРТ
Повышение уровня прогестерона в период КОС
Безусловные успехи, которые были достигнуты за длительный путь развития ВРТ, по-прежнему, можно считать недостаточными, а актуальность проблемы развития данного направления заключается в повышении эффективности и результативности проводимых программ.
Ключевым аспектом ВРТ является стимуляция функции яичников и получение достаточного количества зрелых ооцитов «хорошего качества». Безусловно, контролируемая овариальная суперовуляции (КОС) является крайне важной задачей программы ВРТ, достижение которой заключается в использовании гормональных препаратов.
Формулировка «натуральный цикл» подразумевает рост одного доминантного фолликула, а индукция овуляции – рост нескольких 2-3 фолликулов. Что касается «контролируемой овариальной стимуляции», то это влияние препаратов, оказывающих прямое или опосредованное воздействие на яичник, в результате которого стимулируется рост одновременно нескольких фолликулов [7; 11; 16; 17; 22]. Препараты, используемые для этих целей, называют индукторами овуляции. Кломифен цитрат является первым препаратом, который стали использовать в репродуктологии. Он способен повышать эндогенный уровень ЛГ и ФСГ по средствам снижения уровня эстрогенов и усиления синтеза ГнРГ [17]. В дальнейшем усилиями клинической фармакологии и медицины в арсенал специалистов вошли гонадотропины разного состава и происхождения.
Впервые гонадотропины были выделены в 40-х годов XX века и были синтезированы на основе гонадотропных гормонов, полученных из мочи беременных кобыл и гипофиза крупного рогатого скота. В 1958 году Бруно Люненфельд впервые осуществил стимуляцию суперовуляции с использованием гонадотропинов, выделенных из человеческого гипофиза. Позднее, в 60-х годах смогли получить и очистить гонадотропины из мочи женщин в постменопаузе. В течение 20 лет его применение не было распространено и только с 1980 годов использование человеческого менопаузального гормона (ЧМГ) для стимуляции функции яичников стало широко использоваться в клинической практике специалистов. [9, 10, 57; 69].
Препараты ЧМГ содержат по 75 МЕ ФСГ и ЛГ. Содержание компонента ФСГ в препаратах чМГ формирует ключевой аспект в результатах индукции овуляции, такой как количество фолликулов развивающихся в период стимуляции и отбор лидирующих [9]. Удаление ЛГ из ЧМГ дало возможность получить «чистый» ФСГ, что было сделано в 80-х годах с помощью полисомальных антител к ХГ, но они все, же содержали 1 МЕ ЛГ на каждые 75 МЕ ФСГ, а наличие большого количества примесей вызывало необходимость продолжения поиска новых препаратов для стимуляции суперовуляции. Позднее была разработана принципиально новая технология - генно-инженерное получение ФСГ in vitro, но осуществлялась эта работа уже в 90-х годах. Удалось выделить высокоочищенные рекомбинантные гонадотропины, которые оказались более чистыми по своему биохимическому составу и имели высокую удельную биологическую активность. Данными препаратами являются фоллитропин-бета и фоллитропин-альфа [22]. Состав aаминокислот практически в точности соответствует ФСГ человека, то же самое можно сказать о последовательности индивидуальных субъединиц рекомбинантного ФСГ (р-ФСГ). Фолликулостимулирующий гормон – это гетеродимерный гликопротеин массой 35-45 кД, в состав которого входит две субъединицы и , нековалентно связанных между собой. В каждую из субьединиц входят по две углеводные цепи, связанные аспарагином [81; 82; 121].
Широта возможностей ВРТ и применение их практически во всех формах бесплодия различной этиологии, диктует необходимость тщательного подбора протоколов для разных групп пациенток. Этому факту также способствует наличие широкого спектра препаратов с разным гормональным составом, которые содержат как ФСГ, так и ЛГ компоненты или имеют в своем составе рекомбинантный р-ФСГ и р-ЛГ или ЧМГ [9, 11, 69, 77, 124]. При выборе необходимого метода стимуляции суперовуляции в первую очередь учитывают состояние репродуктивной системы пациентки и возможный ответ на введение гонадотропина, с целью прогнозирования ответа яичников [12, 17, 102].
Оптимальным считают такой ответ яичников, когда было получено не менее 7, но не более 20 ооцитов, при этом расход индуктора овуляции не должен превышать 3000 МЕ. В результате такой стимуляции суперовуляции получают наиболее высокие показатели частоты наступления беременности и частоты живорождений [18,35]. Если при увеличении курсовой дозы ФСГ до значений более 3000 МЕ происходит созревание лишь 4-6 или менее 4 фолликулов, то это считают, соответственно, субоптимальным или бедным ответом [33].
Общеклинические методы исследования
Восприимчивость эндометрия к имплантации эмбриона является сложным процессом, связанным с многочисленными молекулярными механизмами. В период «окна имплантации», которое охватывает 20-24 день регулярного менструального цикла, эндометрий приобретает новые адгезионные свойства. Экспрессия генов профилирует в эндометрия при координации и последовательном действии стероидных гормонов, как это демонстрируют ряд исследований [89, 131, 132, 133]. Накопленные данные свидетельствуют о том, что эстрогены и прогестерон регулируют активность эндометрия различными аутокрино-паракриновыми регуляторами, включая факторы роста, цитокины, хемокины, липиды, а также молекулы адгезии, которые служат в качестве ключевых компонентов процесса имплантации [134, 135]. В настоящее время известно, что в некоторых случаях в период «окна имплантации» гены экспрессируются в эндометрии не соответствующим образом, в связи с чем не происходит имплантация, что объясняет снижение частоты наступления беременности в программах ВРТ.
Потенциальным регулятором восприимчивости эндометрия является мРНК, кодируемый большим набором 22 нуклеотидов, которые контролируют экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне таргетинга мРНК, проявляющимся деградацией или поступательной репрессией [136, 137]. Их открытие представляет собой важный прорыв в науке, а функциональная идентификация мРНК стала одним из наиболее активно изучаемых областей в биологии. Было показано, что одна мРНК несет прямую ответственность за репрессию сотен белков [137]. Функциональный анализ мРНК показал их значительное регуляторное влияние на экспрессию целевых генов, участвующих в физиологических и патологических состояниях [138; 139]. Циклы клеточной прогрессии, пролиферации и дифференцировки [132, 146] относятся к числу биологических процессов, регулируемых мРНК, процессов, которые, как известно, происходят во время циклических изменений в эндометрии [150]. Особое значение имеют последние данные, которые свидетельствуют о роли мРНК в регулирующих экспрессию некоторых клеточных генов эпителия эндометрия в секреторной фазе менструального цикла [150]. Кроме того, выраженные нарушения мРНК связаны с такими расстройствами состояния эндометрия, как эндометриоз [131, 142], гиперплазия эндометрия и карциномы [138]. В совокупности эти данные свидетельствуют о возможности участия мРНК в дефектах имплантации. Результаты недавних исследований могут служить объяснением снижения частоты наступления беременности в циклах, где была выявлена преждевременная лютеинизация фолликулов, эти исследования показали, что высокие значения прогестерона в позднюю фолликулярную фазу цикла могут негативно влиять на состояние рецептивности эндометрия. E. Labarta и соавт. [63]. На основании функционального геномного анализа биоптатов эндометрия, которые были получены на 7-й день после введения ХГЧ у 12 доноров ооцитов показали, что происходит изменение экспрессии более чем 140 генов при повышении уровня прогестерона в день введения ХГЧ 1,5 нг/мл, среди которых 64 экспрессируются активно, а 76 — менее активно. Описанные гены способны отвечать за адгезию клеток, а также ряд процессов, необходимых для формирования способного к имплантации эндометрия. Также авторами было замечено изменение экспрессии 13 из 25 исследуемых генов, которые являются непосредственными маркерами рецептивности эндометрия [63].
Подобные данные были продемонстрированы в исследовании R. Li и соавт. [89]. У женщин с высоким значением преовуляторного прогестерона была произведена отмена переноса, а при анализе биоптатов из полости матки полученных на 6-й день после трансвагинальной пункции яичников у 19 пациенток, при экспрессии генов было выявлено изменение рецептивности эндометрия. Авторами сформулировано мнение, что преждевременная лютеинизация фолликулов вызывает изменение экспрессии генов остеопонтина и сосудистого эндотелиального фактора роста (СЭФР) — паракринных медиаторов. Также известна их важная роль в процессе имплантации.
В настоящее время немалое число ученых поддерживают мнение, что повышение преовуляторных значений прогестерона более 2,0 нг/мл является предиктором низкой вероятности наступления беременности в данном цикле ЭКО. Большинство авторов [41,52,148] у данной категории пациенток рекомендуют проводить криоконсервацию всех полученных эмбрионов, а перенос осуществлять в следующих менструальных циклах.
Появление геномных биочипов расширило представление о характере экспрессии генов в течение менструального цикла, причем в некоторых исследованиях был обнаружен определенный спектр генов, экспрессируемых в середину секреторной фазы. Diaz-Gimeno P. и соавт. [20] в 2011 году разработали диагностический метод оценки рецептивности эндометрия, основанный на применении биочипов. Возможность использования более узкого набора генов, временно экспрессируемых в соответствии с фазой рецептивности, делает технологию менее затратной по сравнению с применением биочипов для оценки полного спектра экспрессируемых генов. Однако дальнейшие исследования необходимы для демонстрации ценности данного диагностического подхода в клинической практике.
Сравнительный анализ параметров индуцированного цикла при использовании двух протоколов стимуляции яичников
На следующем этапе исследования нами проанализированы параметры индуцированного цикла у исследованных групп пациенток в сравнительном аспекте. Были проанализированы такие аспекты как: дни стимуляции, стартовая доза препарата, доза индуктора на цикл лечения, день введения триггера овуляции, число пропунктированнных фолликулов, число полученных ооцитов, число ооцитов хорошего качества, число полученных эмбрионов хорошего качества. Эти данные представлены в таблице 5. Таблица 5 Параметры индуцированного цикла
Исходя из этих данных мы нашли достоверные различия в общем числе растущих фолликулов - 10,6±1,8 и 12,8±2,2 соответственно, р=0,048, количество преовуляторных фолликулов 8,3±2,9 и 10,4±2,6 соответственно, р=0,002, а также число полученных ооцитов статистически отличались 6,09±3,4 и 8,5±4,4,р=0,001, Длительность введения ант-ГнРГ и среднее число эмбрионов хорошего качества, а также суммарная доза гонадотропинов статистической достоверности не имели. Однако, в длительности стимуляции была получена достоверная значимость 9,4±1,9 и 8,7±1,6, р=0,036 (Таблица 5). Гормональный профиль в период стимуляции функции яичников У всех пациенток, вошедших в исследование, был произведен гормональный мониторинг всего стимулированного цикла. Забор крови производился на 2-3 день менструального цикла, перед вступлением в программу лечения бесплодия, на 6-й день введения гонадотропинов и при начале введения ант-ГнРГ, а также на день введения триггера овуляции (Таблица 6).
Были проанализированы полученные данные. В группе с использованием рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона уровень ФСГ на начало стимуляции составил 6,91±3,0 МЕ/л, ЛГ 4,81±2,8 МЕ/л, эстрадиол - 168,61±119,3 пмоль/л, прогестерон - 1,49±0,7 нмоль/л. Достоверных различий у пациенток в группе с ЧМГ получено не было (ФСГ- 8,43±3,63 МЕ/л, ЛГ- 4,81±2,8 МЕ/л, Е2-155,8±117 пмоль/л, прогестерон - 1,81±1,6 нмоль/л), что свидетельствует о равных условиях начала стимуляции. Однако, на 6 день введения гонадотропина также были получены достоверные различия в уровне Е2 (2175,8±1509,8 и 3110,5±2134,2 соответственно р=0,0004). На день введения ант-ГнРГ уровень концентрации ЛГ соответствовал 4,08±4,5 МЕ/л и 3,37±2,2 соответственно (р=0,084). П на день введения ант-ГнРГ имел статистические значимые различия и соответствовал при ЧМГ стимуляции 1,49±0,77 нмоль/л и 1,75±1,02 пмоль/л (р=0,0404) при использование р-ФСГ. В день введения хорионического гонадотропина человека уровни гормонов соответствовали при использовании протокола с р-ФСГ: ЛГ 1,92±1,99 МЕ/л, эстрадиол 5441,9±3364пмоль/л, прогестерон 2,03±1,0 пмоль/л и не различались соответственно, что свидетельствует об отсутствии паразитарных пиков гормонов и преждевременной лютеинизации, также не было различий в показателях уровня П (2,01±0,89 в ЧМГ группе и 2,03±1,0 в р-ФСГ соответственно), более того, средние уровни прогестерона в обеих группах не превышали «критических» значений обсуждаемых в литературе и выявленных нами данных, свидетельствующих о возможной преждевременной лютеинизации эндометрия.
Нами зарегистрированны достоверно большие преовуляторные концентрации Е2 в преовулятторный период в группе р-ФСГ (3110,5±2134,2 и 2175,8±1509,8 р=0,0004 соответственно), что коррелировало с высоким уровнем прогестерона на день введения триггера, а также с большим числом полученных ооцитов.
Также, при индивидуальном анализе каждого протокола стимуляции в обеих группах были обнаружены циклы, в которых преовуляторный уровень прогестерона был выше «критического» - 4,85 нмоль/л. Таких циклов в группе с ЧМГ было 12, что соответствовало 9,6 % от общего числа, а в группе с р-ФСГ 16, что соответствовало 12,8% от общего числа проведенных циклов стимуляции. Эти данные статистически не различались между собой.
Эмбриологические, клинические и гормональные аспекты проведения программы ВРТ
В основной группе с высокими значениями уровня прогестерона количество пиноподий в эндометрии было на 4% меньше, чем в группе, где значения П были нормальными - 14,5% и 18,5% соответственно, число эстрогеновых рецепторов, как в строме, так и железах было существенно ниже в группе с высоким прогестероном, чем при прогестероне менее 4,85 нмоль/л (р 0,05). Средняя стадия секреции выявлена в 62,5% случаев в группе с высоким преовуляторным прогестероном, поздняя стадия в 18%, а среднее значение соотношение ПР/ЭР в строме превышало данный показатель в группе с высоким уровнем прогестерона (p 0,05). Указанные различия могут свидетельствовать о нарушении рецептивных свойств эндометрия, что в свою очередь, может быть причиной неудачных попыток ЭКО. Однако следует отметить, что уровень ЛИФ в группах сравнения высокого и нормального уровня прогестерона статистически не различался. Что касается контрольной группы исследования, то 11 пациенток включенных в данную группу, продемонстрировали высокое содержание ПР/ЭР как в строме, так и в железах, экспрессия ЛИФ соответствовала 5-6 баллов в апикальной части покровного эпителия, также и в железах, количество пиноподий в средней стадии секреции было снижено по сравнению с ранней стадией и группой контроля. р 0,05.
С целью детального анализа состояния эндометрия, нами было исследовано 47 образцов биоптатов эндометрия, а также цервикальной слизи на экспрессию 13 генов. Среди них - 19 образцов от пациенток, стимулированных в циклах ВРТ с нормальным уровнем прогестерона на день введения триггера овуляции и 17 образцов с высоким уровнем прогестерона. Контрольную группу составили 11 фертильных женщин.
В качестве маркеров, характеризующих функциональное состояние клеток, были выбраны 13 показателей. Было произведено выделение РНК из образцов тканей для определения экспрессии мРНК функционального комплекса генов (IL1b, IL2, IL6, LIF, LIFR, IL10, IFN-g, TLR2, TLR4,TLR9, MSX-1/HOX-7, HOXA-10, HOXA-11) эндометрия в период «окна имплантации».
Возраст пациенток группы исследования (n=36) колебался от 24 до 40 лет и в среднем составил 32,1 ± 7,8лет. Первичное бесплодие отмечено у 15 (41,6 %), а вторичное у 21 (58,3 %) пациенток. Продолжительность бесплодия колебалась от 3 до 14 лет (6,5± 3,2 года в среднем).
Из 36 пациенток стимулированной группы исследования, у 17 был зарегистрирован повышенный уровень преовуляторного прогестерона - 4,85 нмоль/л, у 19 пациенток эти показатели соответствовали нормативным значениям.
Параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза были удовлетворительными. Динамика роста и структурной трансформации эндометрия в ходе программ соответствовала адекватной УЗ картине. Объем яичников во время исследования составил: правого 9,7±3,2см и левого 8,9±2,9 см, что также не отличается от нормативных значений. Все женщины имели сохраненные параметры овариального резерва, определяющие адекватный ответ яичников на стимуляцию. Изучение профиля экспрессии маркеров
Было установлено, что уровень экспрессии в эндометрии всех исследованных маркеров достаточен для проведения исследования. Все пациентки были поделены на три группы, первая и вторая распределена в зависимости от уровня значения прогестерона. В группу I вошли пациентки с уровнем прогестерона 4,85 нмоль/мл, в группу II – более
Экспрессия мРНК генов IFN-g ,TLR4, TLR9, MSX-1/HOX-7, HOXA-11 была сопоставима в исследуемых группах, При этом, в стимулированном цикле отмечено снижение экспрессии генов LIF 3,8 раз, LIFR в 3,6 раз, HOXA 10 в 4,8 раз, IL10 в 4,1 раза, IL1b в 3,9 раз, IL2 в 2,6 раз, TLR2 в 3,1 раз (Таблица 19).
Был произведен анализ уровня цитокинов, контролирующих воспалительный процесс, таких как IL1b, IL2, IL6, IL10. Так при повышении уровня прогестерона более 4,85 нмоль/л отмечена высокая экспрессия провоспалительных цитокинов IL6 в 2,2 раза (Ме=2,18, р=0,036) и IL10 в 2,3 раза (Ме=2,29, р 0,01). При изучении уровня экспрессии фактора лейкемия ингибированных клеток (LIF) было выявлено достоверное повышение в 13,8 раз в группе I (Ме=0,61, р 0,01, при экспрессии рецепторов лейкемия ингибирующего фактора отмечалось снижение в 2,3 раза (Ме=0,61, р=0,022). Также были изучена экспрессия толл-подобных рецепторов, являющихся ключевым звеном врожденного иммунитета. Было выявлено достоверное повышение уровня экспрессии TLR2 (Ме=2,00, р=0,014).
При дальнейшем анализе было выявлено снижение экспрессии HOXA 10 в 2,3 раза (Ме=0,43, р 0,01).