Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Влияние морфофункционального состояния эндометрия на эффективность программы эко и пэ уженщин с повторными неудачами имплантации ванамнезе (обзор литературы) 11
1.1. Методы комплексной оценки функционального состояния эндометрия в программах ВРТ 11
1.2. Провоспалительный фон в эндометрии как фактор успешной имплантации
1.3. Морфологические и молекулярно-генетические маркеры рецептивности эндометрия и их роль в процессе имплантации у женщин программы ЭКО..33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Материалы исследования 49
Критерии включения и исключения. 49
Дизайн исследования 521
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Общеклинические методы исследования 53
2.2.2. Гормональное исследование 55
2.2.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза 56
2.2.4. Специальные методы исследования 57
Аспирационная пайпель-биопсия эндометрия 57
Гистологическое исследование биоптатов эндометрия 57
Иммуногистохимическое исследование 58
Молекулярно-генетическое исследование 59
2.3. Этапы проведения программы ЭКО и ПЭ з
2.4. Циклическая гормональная подготовка эндометрия .64
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 65
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 67
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток 67
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования
3.2.2. Характеристика циклов стимуляции суперовуляции у обследованных женщин 77
3.2.3. Морфологическая, иммуногистохимическая и молекулярно-генетическая
оценка рецептивности эндометрия 79
Профиль экспрессии генов 87
3.4. Показатели рецептивности эндометрия в зависимости от эффективности реализации программы ЭКО и ПЭ .93
Сравнительный анализ исходов программы ЭКО и ПЭ в исследуемых группах Иммуногистохимическое исследование 97
Транскрипционный профиль 99
Создание многофакторной прогностической модели для оценки эффективности программы ЭКО 105
ГЛАВА 4. Циклическая гормональная подготовка эндометрия перед проведением программы эко 110
Заключение 1285
Выводы.
Практические рекомендации 139
Список сокращений .140
Список литературы 1
- Провоспалительный фон в эндометрии как фактор успешной имплантации
- Общеклинические методы исследования
- Характеристика циклов стимуляции суперовуляции у обследованных женщин
- Иммуногистохимическое исследование
Провоспалительный фон в эндометрии как фактор успешной имплантации
Неудачи имплантации и преэмбрионические потери остаются ограничивающим фактором в повышении эффективности методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и составляют около 85% от общего числа потерь беременностей, в то время как самопроизвольное прерывание беременности на ранних сроках происходит примерно в 15% случаев [117]. Следует отметить, что 2 из 3 циклов ЭКО не приводят к успеху и около 75% переносимых эмбрионов останавливаются в развитии до момента имплантации или на ранних этапах беременности [90].
Повторные неудачи имплантации (ПНИ) определяют как отсутствие наступления беременности после двух последовательных циклов ЭКО/интрацитоплазмотической иньекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) или переноса криоконсервированных эмбрионов, в каждом из которых переносили эмбрионы хорошего качества, соответствующие дню культивирования (не менее четырех эмбрионов на начальных стадиях дробления и не менее двух бластоцист) [135,140]. Большинство исследователей сходятся в том, что при переносе морфологически качественных эмбрионов одной из значимых причин неудач программ ВРТ является нарушение рецептивности эндометрия [41,51,135]. Рецептивность эндометрия (от английского receptivity-восприимчивость, чувствительность) определяют как комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с четкими временными и пространственными константами, определяющими способность эндометрия к имплантации [26]. Морфофункциональное состояние эндометрия имеет решающее значение для успешной имплантации эмбриона и, следовательно, его изучение является одной из приоритетных задач для исследователей в области репродуктивной медицины. В результате повреждающего действия каких-либо первичных этиологических факторов, а именно, инфекционного, с развитием хронического эндометрита, наиболее часто ассоциированного с трубно-перитонеальным бесплодием, дисгормонального, с развитием гиперпластических процессов при эндокринном бесплодии, а также сочетанных, приводящих к формированию полипов и внутриматочных синехий, формируются патологические изменения в эндометрии, сопровождающиеся нарушением его рецепторного аппарата [24]. В то же время отсутствие органической патологии эндометрия не исключает его функциональную неполноценность, которая в ряде случаев может являться причиной бесплодия неясного генеза, ПНИ [54,61,74,108,111,113124,133,137]
Перед проведением программы ЭКО и ПЭ для определения патогенетического лечения и тактики предгравидарной подготовки необходима комплексная оценка состояния эндометрия с использованием как инвазивных, так и неинвазивных методов исследования. К неинвазивным методам относят высокоразрешающую трансвагинальную ультрасонографию, ультрасонографию в режиме 3D и комбинации трансвагинального цветового допплеровского картирования и импульсной допплерометрии с эхографией в реальном масштабе времени [17].
Широкое применение трансвагинального ультразвукового исследования эндометрия (УЗИ) в программах ВРТ в связи с его неинвазивностью, высокой разрешающей способностью и доступностью позволяет достаточно точно оценить состояние эндометрия на протяжении менструального цикла, а также в циклах стимуляции суперовуляции. Метод основан на поглощении и отражении ультразвуковых волн тканями различной толщины, плотности и структуры. Для оценки состояния эндометрия используются такие эхографические параметры как толщина и структура, соответствующие дню и фазе менструального цикла.
Ультразвуковая структура эндометрия - «тройная линия» (многослойный) с толщиной более 7 мм в настоящее время рассматривается в качестве одного из прогностических критериев успешной имплантации [35,40,56] (рисунок 1). За толщину эндометрия принимается максимальное значение передне заднего размера М-эхо. Адекватность толщины эндометрия оценивается в день введения триггера овуляции в циклах стимуляции суперовуляции и в циклах заместительной гормональной терапии в день назначения прогестерона [75]. Интересно, что первое сообщение, описывающее взаимосвязь между ультразвуковой толщиной, структурой эндометрия и частотой наступления беременности было отклонено в 1989 году журналом “Fertility and Sterility” и опубликовано спустя год в другом журнале [72].
Общеклинические методы исследования
Ингибирующее действие TNF- на пролиферацию клеток плаценты препятствует инвазии трофобласта, контролируя рост плаценты соответственно нормальному развитию плода. С другой стороны, под воздействием TNF- происходит активация макрофагов, оказывающих стимулирующий эффект на процессы апоптоза клеток трофобласта. Избыточное скопление макрофагов в области плацентарного ложа и стимуляция процесса апоптоза клеток трофобласта является одним из факторов уменьшения инвазии трофобласта в маточно-плацентарные артерии [112]. Недостаточное проникновение трофобласта в децидуальную оболочку матки способствует прерыванию беременности, а также развитию преэклампсии, внутриутробной задержке роста плода [22]. Процесс инвазии трофобласта связан с ремоделированием тканей экстрацеллюлярного матрикса, находящегося под контролем матриксных металлопротеиназ (MMP) [96]. MMP относится к семейству цинк-зависимых эндопептидаз, функция которых связана с обменом белков межклеточного матрикса [79]. MMP состоят из нескольких подсемейств, в том числе коллагеназы, желатиназы, стромелизины [95]. Эти ферменты играют ключевую роль во многих физиологических процессах, таких как морфогенез, эмбриональное развитие, ремоделирование ткани, миграция, адгезия, апоптоз, ангиогенез, дифференцировка и пролиферация клеток. В основном MMP продуцируются в неактивном состоянии и в присутствии их специфических ингибиторов — тканевых ингибиторов матриксных металлопротеаз (TIMP), секретируемых децидуальными клетками, теряют свою активность [2]. Konac E. и соавт. выявили значительное снижение экспрессии в эндометрии мРНК желатиназы А (MMP-2) и TIMP-3 у женщин с бесплодием неясного генеза и неудачами имплантации по сравнению с фертильными [54].
Простагландины (ПГ), относящиеся к группе эйкозаноидов, которая также включает простоциклины, тромбоксаны и лейкотриены, играют важную роль в различных репродуктивных процессах, таких как менструация, овуляция и имплантация [128]. Известны 2 изоформы циклооксигеназы (ЦОГ-1 и ЦОГ-2), являющиеся важными ферментами, ответственными за синтез различных ПГ. ЦОГ-2, экспрессия которой регулируется стероидными гормонами, IL-1, TNF- и IFN играют важную роль в имплантации эмбриона и децидуализации через синтез ПГ [111]. ЦОГ-2 способствует синтезу из арахидоновой кислоты простагландина Е2, который активирует ароматазу, переводящую андрогены в эстрогены [57].
Гены гомеобокса (“домашнего хозяйства”), кодирующие транскрипционные факторы, регулируют молекулярные и морфологические маркеры, экспрессируемые в период “окна имплантации”, в том числе пиноподии, интегрин 3, IGFBP-1, рецепторы простагландинов. HOX гены, необходимые регуляторы морфогенеза и дифференцировки тканей эмбриона, так же имеют важное значение для роста эндометрия, дифференциации его клеток, рецептивности и децидуализации [77]. Увеличение экспрессии мРНК HOXA10 и HOXA11 происходит в эпителиальных и стромальных клетках эндометрия в среднюю и позднюю секреторную фазы, достигает пика во время “окна имплантации” и совпадает с высоким уровнем эстрогенов и прогестерона [121]. Кроме того, на ранних сроках беременности децидуальная оболочка продолжает экспрессировать высокие уровни мРНК HOXA10 и HOXA11. При таких заболеваниях как гидросальпинкс, лейомиомы, эндометриоз, синдром поликистозных яичников, связанных с неудачами имплантации, происходит снижение экспрессии мРНК HOXA10 и HOXA11 в эндометрии [59].
Таким образом, имплантация эмбриона – четко организованный процесс, который регулируется чрезвычайно сложным, постоянно меняющимся репертуаром молекул, вступающих в “игру” в свое время одна за другой, оставаясь во взаимодействии. Cвоевременная паракринная, аутокринная и интракринная регуляция экспрессии эмбриональных и эндометриальных факторов играет важную роль в определении жизнеспособности эмбриона. С каждым годом список и роль различных молекул в регуляции имплантации расширяются. Однако, учитывая, что молекулярные маркеры для определения «идеального» периода восприимчивости эндометрия до сих пор не найдены, поиск потенциально информативных биомаркеров продолжается. По-видимому, не существует какого-то одного универсального маркера. Необходим комплексный подход, учитывающий множество факторов, что требует глубокого знания генных сетей, задействованных в процессах имплантации. Применение современных методов диагностики на геномных, секретомных и протеомных уровнях прольет больше света на процессы, происходящие в эндометрии и привнесет новые подходы к предотвращению неудач имплантации.
Характеристика циклов стимуляции суперовуляции у обследованных женщин
Из 129 обследованных женщин 57,4% (74) перенесли 1 до 3 лапароскопических вмешательств, из которых 20,2% (26) приходилось на реконструктивно-пластические операции на маточных трубах, 17,8% (23) женщинам была выполнена двухсторонняя тубэктомия. Следует отметить высокую частоту гистероскопии и РДВ, имеющуюся в анамнезе у 65,1% женщин.
Таким образом, более половины обследованных нами женщин были среднего репродуктивного возраста от 30 до 36 лет. Частота вторичного бесплодия была несколько выше первичного и составила 57,4% против 42,6% соответственно. Средняя продолжительность бесплодия женщин, включенных в исследование составила 5,7±3,6 года. У 34,9% женщин данный цикл ЭКО был первый. 43,4% обследованных женщин имели один безуспешный цикл ЭКО, 21,7 % пациенток- два-три предшествующих цикла ЭКО в анамнезе. Менструальный цикл характеризовался своевременным менархе у 74,4% пациенток. На момент обследования все 100% женщин имели регулярный менструальный цикл, что являлось критерием включения пациенток в исследование и позволило исключить бесплодие эндокринного генеза, а также было необходимо для точности диагностики средней секреторной фазы менструального цикла. Трубно-перитонеальный фактор бесплодия сопровождался cпаечным процессом в малом тазу I-II степени у 41,1 % обследованных женщин. Основными причинами поражения маточных труб явились ранее перенесенные воспалительные заболевания органов малого таза, среди которых преобладали инфекции, передающиеся половым путем у 53,5% женщин и хронический сальпингоофорит у 41,9% женщин. Наиболее частыми исходами предыдущих беременностей у женщин с вторичным бесплодием были исскуственные аборты и внематочные беременности, которые имели 44,6% и 35,1% женщин соответственно. Осложненный акушерский анамнез в виде самопроизвольных выкидышей и неразвивающихся беременностей был выявлен у каждой пятой женщины (21,6% и 23,0% соответственно), что незначительно выше частоты невынашивания беременности в популяции. Среди обследованных женщин более половины (57,4%) перенесли от одного до трех лапароскопических вмешательств на органах малого таза. Диагностическая гистероскопия и РДВ была выполнена ранее 2/3 женщинам.
В раннюю фолликулярную фазу в цикле, предшествующем проведению аспирационной пайпель-биопсии эндометрия, всем обследованным женщинам проводилось предварительное гормональное обследование (таблица 12). Таблица 12 Сравнительный анализ гормонального статуса обследованных женщин
Представленные в таблице данные демонстрируют, что гормональный статус всех обследованных женщин был в пределах нормативных значений.
Сравнительный анализ концентраций половых стероидных гормонов, гонадотропинов, пролактина, андрогенов, гормонов щитовидной железы, АМГ в плазме крови не выявил достоверных различий между исследуемыми группами (р 0,05).
Следует отметить, что средний уровень АМГ (одного из маркеров овариального резерва) в I и II группе составил 2,1±0,4 и 2,2±0,5 нг/мл соответственно, что совместно с результатами УЗИ свидетельствует о том, что у всех обследованных женщин имелся сохраненный овариальный резерв.
При проведении стимуляции функции яичников проводилась оценка стартовой, суммарной дозы препаратов и длительности их введения. В день назначения триггера овуляции при ультразвуковом мониторинге проводилась оценка толщины эндометрия (таблица 13).
Медиана стартовой дозы препарата рФСГ в I и II группе составила 150 (150-225,0) и 150,0 (150-200,0) соответственно и достоверно не различалась между исследуемыми группами. Суммарное количество рФСГ, затраченного на цикл стимуляции во II группе оказалось несколько выше, чем в I группе, что, однако, не являлось статистически значимым (р=0,103). Длительность стимуляции суперовуляции не имела межгрупповых различий, медиана в обеих группах составила 10 дней. Толщина эндометрия в день введения триггера овуляции у женщин в исследуемых группах была от 9 мм до 13 мм.
Параметры I группа Ранняя стадия фазысекреции (n=58) II группа Средняя стадия фазысекреции (n=71) Количество преовуляторных фолликулов 9,0 (7,0-12,0) 10,0 (7,0-13,0) Количество аспирированных ооцитов 8,0 (5,0-11,0) 8,0 (4,0-11,0) Количество зрелых ооцитов 6,0 (4,0-10,0) 6,0 (3,0-9,0) Количество оплодотворенных ооцитов 5,0 (3,0-7,0) 5,0 (3,0-8,0) Медиана количества преовуляторных фолликулов в день введения ХГ в I и II группе составила 9,0 (7,0-12,0) и 10,0 (7,0-13,0) соответственно. Медиана количества полученных, зрелых и оплодотворенных ооцитов достоверно не различалось между группами и в обеих группах составила 8, 6, 5 ооцитов соответственно. Процент полученных зрелых ооцитов от числа аспирированных составил в I и II группе 86,1% и 82,7% cоответственно.
Таким образом, при анализе параметров фолликуло - и оогенеза статистически значимых межгрупповых различий выявлено не было.
Среднее количество перенесенных эмбрионов в I и II группах, все из которых были хорошего качества, составило 1,8±0,5 и 1,8±0,7 соответственно и статистически достоверно не различалось.
У всех женщин в I и II группе перенос эмбрионов был произведен на пятые сутки на стадии бластоцисты, что свидетельствует о высоком потенциале развития эмбрионов. Оценка качества бластоцист осуществлялась на основании классификации Gardner D.K. и Schoolcraft W.B [66].
Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что исследуемые группы были сопоставимы по параметрам фолликуло-, оогенеза и раннего эмбриогенеза. 3.2.3. Морфологическая, иммуногистохимическая и молекулярно-генетическая оценка рецептивности эндометрия Всем обследованным женщинам в цикле, предшествующем проведению программы ЭКО, проводилось гистологическое, иммуногистохимическое, молекулярно-генетическое исследование биоптата эндометрия в день менструального цикла ЛГ+7-8 (“окно имплантации”). При гистологическом исследовании биоптата эндометрия ранняя стадия фазы секреции была выявлена у 43,6% женщин, средняя стадия фазы секреции диагностирована у 53,4% женщин, у 3% женщин наблюдался эндометрий поздней стадии фазы пролиферации и они были исключены из дальнейшего анализа в связи с малочисленностью группы (рисунок 8).
Рисунок 8. Распределение обследованных женщин по группам на основании данных гистологического исследования
Таким образом, несмотря на взятие образца эндометрия в период предполагаемого “окна имплантации” в 46,6% случаев выявляется несоответствие фазы развития эндометрия предполагаемому “окну имплантации”.
При ИГХ-исследовании проводилась оценка уровней накопления прогестероновых (ПР) и эстрогеновых рецепторов (ЭР) в эпителии и строме эндометрия (таблица 15-18, рисунок 9,10).
Иммуногистохимическое исследование
Частота имплантации была значимо выше в I группе по сравнению со II и составила 31,5% против 18,6% соответственно (p=0,05). Частота наступления беременности в I группе была почти в 1,5 раза выше чем во II группе (44,8 % против 33,8 %), однако, разница между группами не была достоверной (p=0,210). Частота самопроизвольных выкидышей в I-ой группе была ниже и составила 3,8 % против 12,5%, но различия также не достигали статистической значимости. Эктопическая беременность наступила у 1 пациентки II группы (4,2%). Примечательно, что и в анамнезе у 4 пациенток II группы отмечалось по три повторных эктопических беременности, тогда как в I группе таких пациенток не было. Рождением живого ребенка завершились 96,2% беременностей в I-ой группе и 83,3% - во II-ой группе.
Таким образом, при анализе эффективности реализации репродуктивной функции у пациенток двух групп выявлено, что у женщин с диагностированной ранней секреторной фазой программа ЭКО была более результативной. Наблюдаемое нами повышение частоты имплантации у женщин с ранней секреторной фазой, может косвенно свидетельствовать о десинхронизации процессов развития эмбриона и эндометрия в цикле стимуляции.
В результате проведения контролируемой стимуляция суперовуляции под влиянием экзогенных гонадотропинов происходят определенные изменения в развитии и состоянии эндометрия, характеризующиеся опережением его созревания, изменением временных границ “окна имплантации” и, как следствие, нарушением восприимчивости к эмбриону. В ряде проведенных клинических исследованиях, оценивающих воздействие стимуляции суперовуляции на рецептивность эндометрия в сравнении с естественным циклом, были выявлены преждевременная секреторная трансформация эндометрия, а также изменение уровней экспрессии генов рецептивности, что может приводить к нарушению синхронизации возникновения “окна имплантации” и времени переноса эмбриона [38,68].
Предполагают, что опережение развития эндометрия по критериям Noyes дню более чем на три дня менструального цикла, не приводит к клинической беременности [153].
В исследовании Van Vaerenbergh I. и соавт. во всех образцах биоптатов эндометрия, взятых в день проведения ТВП, было выявлено опережение развития эндометрия на 2-4 дня [84].
Следует отметить, что существенной особенностью настоящего
исследования является разобщенность во времени проведения пайпель-биопсии эндометрия и программы ЭКО по этическим причинам. Проведение инвазивной диагностической процедуры в день забора ооцитов в цикле стимуляции суперовуляции связано с отсутствием убедительных данных о негативном влиянии данной процедуры на исходы цикла ЭКО.
Тем не менее, полученные нами данные свидетельствуют, что морфологическое исследование биоптатов эндометрия, полученных в период предполагаемого “окна имплантации” в цикле, предшествующем проведению программы ЭКО, имеет важное прогностическое значение.
Очевидно, секреторная трансформация эндометрия под действием высоких концентраций эстрадиола в стимулированном цикле происходит быстрее, чем в естественном цикле и приводит к более адекватной синхронизации процессов созревания эндометрия и развития эмбриона и, соответственно, более благоприятному исходу программы ЭКО у женщин с выявленной в предшествующем цикле ранней секреторной трансформацией эндометрия.
В то же время, согласно нашим данным, у женщин, чей эндометрий соответствовал средней секреторной фазе в предшествующем естественном цикле, в циклах стимуляции суперовуляции морфологическое опережение созревания эндометрия и смещение "окна имплантации" на более ранние сроки оказывают негативное влияние на частоту наступления беременности.
Таким образом, нельзя исключить наличие определенной запрограммированности сроков созревания эндометрия, возможно, имеющую генетически обусловленную природу.
С учетом полученных нами данных о различной эффективности программы ВРТ в зависимости от скорости созревания эндометрия дальнейший поиск предикторов успешной имплантации проводили раздельно в исследованных группах. В качестве потенциальных предикторов были рассмотрены результаты иммуногистохимического исследования и транскрипционный профиль мРНК.