Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Проблемы избыточного веса при лечении в программах ЭКО (обзор литературы) 13
1.1 Влияние ожирения на уровень половых гормонов и репродуктивную систему .16
1.2 Инсулин, адипокины и их воздействие на репродуктивную систему в норме и при ожирении .18
1.3 Влияние ожирения на течение и исход беременности 22
1.4 Особенности лечения женщин с избыточной массой тела с использованием современных репродуктивных технологий .24
1.5 Влияние ожирения на рецептивность эндометрия 27
1.6 Влияние ожирения на ранние этапы оплодотворения .30
1.7 Митохондриальный аппарат и репродуктивная система 31
1.8 Окислительный стресс и хроническое воспаление 35
1.9 Окислительный метаболизм в оогенезе и раннем эмбриогенезе .39
1.10 Энергетический метаболизм и состояние митохондриального ретикулума в кумулюсных клетках 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 46
2.1. Материал исследования .46
2.2 Дизайн исследования 47
2.3. Методы исследования .48
2.3.1. Общеклинические методы исследования 50
2.3.2. Гормональное исследование 52
2.3.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза .53
2.3.4. Спермиологическое исследование эякулята .53
2.3.5 Специальные методы исследования .55
2.3.6. Протокол стимуляции функции яичников 61
2.3.7. Трансвагинальная пункция яичников 62
2.3.8 Метод оплодотворения и культивирования дробящихся эмбрионов in vitro 62
2.3.9 Перенос эмбрионов в полость матки 64
2.3.10 Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода 65
2.3.11 Диагностика наступления беременности 65
2.3.12 Статистический анализ полученных данных 65
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 68
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика включенных в исследование супружеских пар 69
3.1.1. Возрастная характеристика супружеских пар 69
3.1.2 Антропометрическая характеристика пациенток .70
3.1.3. Социально-экономические характеристики исследуемых групп 73
3.1.4. Характеристика менструальной функции женщин 73
3.1.5. Репродуктивный анамнез пациенток 74
3.1.6. Характеристика женщин по перенесенным гинекологическим заболеваниям и оперативным вмешательствам 78
3.1.7. Гормональный профиль пациенток, включенных в исследование .81
3.2. Особенности лечения в программе ЭКО у женщин с избыточной массой тела 83
3.2.1. Особенности стимуляции суперовуляции, фолликуло- и оогенеза у пациенток в исследуемых группах 83
3.2.2. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в исследуемых группах 87
3.2.3. Характеристика раннего эмбриогенеза у пациенток исследуемых групп .91
3.3. Ассоциация уровня адипокинов и провоспалительных цитокинов с особенностями фолликуло, оо- и раннего эмбриогенеза 94
3.4. Оценка функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови и антиоксидантной активности у пациенток исследуемых групп 103
3.5. Оценка трансмембранного потенциала митохондрий в клетках кумулюса у женщин с различным ИМТ 106
3.6. Прогнозирование наступления клинической беременности на основании оценки ИМТ, уровня адипокинов и функциональной активности митохондрий МПК .108
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 113
Выводы 127
Практические рекомендации 129
Список сокращений .131
Список литературы
- Особенности лечения женщин с избыточной массой тела с использованием современных репродуктивных технологий
- Общеклинические методы исследования
- Социально-экономические характеристики исследуемых групп
- Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в исследуемых группах
Особенности лечения женщин с избыточной массой тела с использованием современных репродуктивных технологий
Яичник является органом-мишенью для инсулина, который оказывает свое воздействие через рецепторы к инсулину и инсулино-подобному фактору роста 1 (ИПФР-1). Эти рецепторы обнаружены в клетках гранулезы, теки и в стромальной ткани яичника. Инсулин стимулирует стероидогенез в клетках теки и гранулезы, усиливая действие ЛГ за счет индукции экспрессии и увеличения числа его рецепторов [146]. Кроме того, инсулин оказывает свое действие на уровне гипофиза, где повышает чувствительность гонадотрофов к гонадолиберину, что приводит к активации стероидогенеза в яичниках [146]. ИПФР-1 участвует в пролиферации и дифференцировке клеток, контролируя в них биосинтез белка. Часто при ожирении в организме развивается состояние гиперинсулинемии и инсулинорезистентности. В печени и яичниках инсулин ингибирует синтез белка, связывающего ИПФР-1, в результате концентрация ИПФР-1 повышается, что негативно отражается на фолликуло-, оо- и эмбриогенезе. Эти изменения способствуют увеличению частоты ановуляторных циклов, ранних репродуктивных потерь и снижению фертильности у женщин с избыточной массой тела [121, 127]. Адипокины. Адипокины - это белковые молекулы, синтезируемые клетками ЖТ, которые играют ключевую роль в регуляции энергетического метаболизма, контролируя чувство голода и насыщения при потреблении пищи, а также участвуя в регуляции распределения ЖТ. Адипокины определяют чувствительность тканей к инсулину, а также принимают участие в индукции или блокировании каскада воспалительных реакций. Наиболее изученными адипокинами являются лептин, адипонектин, ИЛ-6, фактор некроза опухоли- (ФНО-), резистин. Также список известных адипокинов дополняют ретинол-связывающий белок 4, васпин, висфатин, гепсидин и др., но биологическая роль каждого из них ясна не до конца [26, 122].
При избыточном накоплении ЖТ наблюдается изменение профиля экспрессии адипокинов, что приводит к нарушению метаболических процессов во всех органах и тканях организма.
Недавно было обнаружено, что адипокины оказывают воздействие на все уровни репродуктивной системы, регулируя стероидогенез в яичниках, созревание ооцитов и развитие эмбрионов, а также создают благоприятную среду в матке для имплантации эмбриона и его дальнейшего развития [14]. Адипокины являются своего рода связующим звеном между энергетическим метаболизмом и репродуктивной системой. Показано, что изменение концентрации адипокинов в плазме крови сопряжено с изменением уровня оксидативного стресса. Так, увеличение концентрации ФНО-, ИЛ-6, лептина и снижение концентрации адипонектина ассоциировано со снижением активности антиоксидантной системы [4].
Лептин – это белок, который в основном синтезируется адипоцитами ЖТ, кроме того его синтез отмечается в желудке, плаценте, фолликулярной жидкости и молочной железе [28]. Лептин участвует в регуляции энергетического обмена и контролирует массу тела, влияя на аппетит и порог насыщения при потреблении пищи, а также играет важную роль в репродуктивной функции, при нормальных сывороточных концентрациях оказывая стимулирующее действие на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось. Рецепторы лептина обнаружены в гипоталамусе и гипофизе, что свидетельствует о его участии в секреции гонадотропинов [121]. При этом уровень циркулирующего лептина положительно коррелирует с абсолютной величиной жировой массы организма [29]. Лептин действует на гипоталамус, блокируя синтез и высвобождение нейропептида Y, вызывающего чувство голода, вследствие чего его называют гормоном насыщения. У людей с избыточной массой тела отмечается повышенная концентрация лептина в плазме крови, но при этом подавления аппетита или улучшения метаболических показателей не происходит в связи с развитием к нему резистентности [113].
Интересно, что в течение менструального цикла уровень лептина в сыворотке крови незначительно изменяется. Небольшой подъем концентрации происходит в фолликулярной фазе, а максимальная концентрация совпадает с пиком повышения уровня ЛГ перед овуляцией, что, вероятнее всего, свидетельствует о возможном участии лептина в процессе имплантации [136]. У человека и грызунов в эндометрии и клетках предимплантационных эмбрионов, а также в клетках гранулезы и теки были обнаружены рецепторы к лептину и его мРНК, что указывает на способность лептина влиять на стероидогенез в ткани яичника у млекопитающих [78]. По мере увеличения жировой массы уровень лептина в сыворотке крови и фолликулярной жидкости повышается, что оказывает ингибирующее действие на фолликулогенез, нарушая отбор доминантного фолликула и овуляцию [139].
В исследовании Merhi Z. с соавторами (2013) было обнаружено, что лептин подавляет экспрессию антимюллерова гормона (АМГ) и рецепторов АМГ 2 типа (АМГР-2) в клетках кумулюса и пристеночных клетках фолликула (гранулезе) [77]. Freeman E.W. с соавторами (2007) исследовали динамические показатели уровня АМГ для женщин репродуктивного возраста с ожирением и нормальной массой тела. У женщин репродуктивного возраста с ожирением было отмечено снижение уровня циркулирующего в плазме крови АМГ в среднем на 65%, при этом количество антральных фолликулов было одинаковым в обеих исследуемых группах [21]. Следует отметить, что другими исследователями отрицательной корреляции между ИМТ и АМГ обнаружено не было [45], в связи с чем этот вопрос на данный момент остается открытым. Адипонектин это гликопротеин, который экспрессируется исключительно адипоцитами, при этом его синтез подкожной жировой тканью выше, чем висцеральной [28]. В отличие от других адипокинов, его концентрация в плазме крови при ожирении или абдоминальном распределении ЖТ снижается. Этот парадокс объясняют наличием ингибиторов экспрессии и секреции адипонектина, вырабатываемых жировой тканью [7]. Уровень адипонектина в плазме крови обратно пропорционален массе жировой ткани и показателю отношения ОТ/ОБ [32]. Было показано, что адипонектин тормозит дифференцировку преадипоцитов, тем самым оказывая влияние на рост ЖТ. Адипонектин регулирует энергетический гомеостаз и оказывает противовоспалительный и антиатерогенный эффекты. Недавние исследования показали, что адипонектин приводит к повышению ИПФР-1, повышая чувствительность тканей к инсулину, индуцирующему синтез стероидов клетками гранулезы [15]. Интерлейкин 6 (ИЛ-6) является медиатором воспаления, при этом примерно 1/3 циркулирующего в организме ИЛ-6 вырабатывается адипоцитами. Следует отметить, что в особенно большом количестве ИЛ-6 синтезируется именно в висцеральной ЖТ. В высокой концентрации ИЛ-6 подавляет активность ароматазы в клетках гранулезы, сглаживает преовуляторный пик ЛГ, снижает чувствительность тканей к инсулину [29, 55].
Ингибитор активатора плазминогена (ИАП-1) является важнейшим антагонистом тканевого активатора плазминогена, относится к группе сериновых протеаз и образуется в эндотелиальных клетках, гепатоцитах, но большинство циркулирующего в крови ИАП-1 вырабатывается клетками ЖТ.
Функция ИАП-1 главным образом состоит в том, что этот белок подавляет в крови фибринолитическую активность, а также снижает чувствительность тканей к инсулину. При ожирении повышение ИАП-1 положительно коррелирует с вероятностью развития метаболического синдрома [29, 55].
Общеклинические методы исследования
У всех женщин проводился сбор анамнестических данных с целью изучения наследственности, аллергоанамнеза, получения информации о ранее перенесенных/настоящих инфекционных и соматических заболеваниях, оперативных вмешательствах по поводу экстрагенитальной патологии. Изучались особенности становления и характер менструального цикла (возраст менархе, регулярность и продолжительность менструального цикла, характер менструации), половой функции (время начала половой жизни, количество половых партнеров/браков, методы контрацепции), образа жизни, вредных привычек, условий труда и быта.
Особенно тщательно анализировались данные о характере, клиническом течении и методах лечения ранее перенесенных заболеваний половых органов и органов малого таза, с обязательным предоставлением выписок из медицинских документов с указанием объема выполнения операции, течения послеоперационного периода и результатов гистологического исследования. Тщательно производился сбор анамнеза о репродуктивной функции женщин и мужчин (количество беременностей, уточнялось, в каком браке и с каким партнером они наступили, их исходы и наличие осложнений во время беременностей, родов и в послеродовом периоде, количество детей и их развитие). У каждой пациентки уточняли данные о продолжительности и причинах бесплодия, методах его лечения на предыдущих этапах, сведения о ранее проведенных программах ВРТ (место и дата проведения процедуры, схема стимуляции суперовуляции, количество полученных ооцитов и эмбрионов, день и количество перенесенных в матку эмбрионов, количество криоконсервированных эмбрионов, исход программы и др.).
Перед вступлением в программу ЭКО всем женщинам проводилось измерение длины и массы тела, после чего производился расчет ИМТ по формуле Кетле: ИМТ = масса тела/рост2 (кг/м2), по результатам вычисления которого, согласно рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO guideline), пациентки были распределены в одну из трех групп:
С целью определения характера распределения жировой ткани проводилось измерение объема талии (ОТ) и окружности бедер (ОБ) и определялось их соотношение. Показатель ОТ/ОБ, равный менее 0,85, оценивался как гиноидный тип ожирения с преимущественным отложением жировой ткани в области бедер и ягодиц, более 0,85 – как висцеральный, с преимущественным отложением жировой ткани в области передней стенки живота.
В ходе гинекологического исследования проводился осмотр наружных половых органов с оценкой их развития и анатомических особенностей. При бимануальном исследовании органов малого таза оценивали размер, форму, подвижность и консистенцию матки, ее болезненность при пальпации, наличие образований в области придатков матки, а также признаки спаечного процесса. 2.3.2 Гормональное исследование
Перед вступлением в программу ЭКО/ИКСИ всем пациенткам производилась оценка гормонального статуса в период ранней фолликулиновой фазы (3-5 день менструального цикла (д.м.ц.)) одного из циклов, предшествовавших стимуляции суперовуляции. В плазме крови исследовалась концентрация следующих гормонов: ФСГ, ЛГ, АМГ, Е2, ПРЛ, К, Тсв, ДЭА-С, ТТГ, Т4св, СТГ, 17-ОП. Концентрацию П оценивали в плазме крови в период лютеиновой фазы на 20-22-й д.м.ц. Нормативные показатели концентрации гормонов в плазме крови у женщин репродуктивного возраста представлены в таблице 1.
Всем пациенткам на этапе предварительного обследования на 5-7 д.м.ц. проводилось ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза с целью исключения возможных противопоказаний для начала проведения лечения в программе ВРТ. Исследование выполнялось на ультразвуковом аппарате компании «Brulle Kierre» (Siemens, Германия) с использованием трансвагинального датчика частотой 7,5 МГц. Исследование проводилось при опорожненном мочевом пузыре. Для обеспечения стерильности на датчик одевался одноразовый презерватив.
В ходе исследования оценивались размеры тела матки, ее форма и положение, структура миометрия, полость матки, толщина и структура эндометрия, размеры яичников и их положение относительно матки, количество антральных фолликулов. Определялось наличие свободной жидкости или наличие объемных образований в полости малого таза, оценивалась степень выраженности спаечного процесса.
Частота проведения УЗ-мониторинга определялась схемой протокола стимуляции функции яичников. Первое УЗИ органов малого таза осуществлялось в день планируемого начала лечения на 2-5 д.м.ц., в зависимости от состояния овариального резерва пациентки. Далее УЗ мониторинг фолликулогенеза и роста эндометрия проводился на 5 день стимуляции функции яичников с целью определения даты начала введения препарата ант-ГнРГ, далее - по одному разу в 2-3 дня с целью контроля динамики роста фолликулов и эндометрия и решения вопроса о назначении овуляторной дозы препарата хорионического гонадотропина (ХГ).
Социально-экономические характеристики исследуемых групп
В первой группе беременность завершилась родами у 22 пациенток, из них было 7 двоен. Всего в группе родилось 29 здоровых детей. Частота прерывания беременности в первой группе составила 29% (9), из них было 7 неразвивающихся беременностей и 2 самопроизвольных выкидыша. Во второй группе беременность завершилась родами у 9 пациенток, из них было 3 двойни, в итоге родилось 12 здоровых детей. Потери беременности составили 25% (5), из них 3 неразвивающиеся беременности и 2 самопроизвольных выкидыша. В третьей группе беременность завершилась родами у 8 пациенток, в итоге в группе родилось 8 здоровых детей.
Частота прерывания беременности в третьей группе составила 28,6% (4), из них 3 неразвивающихся беременностей и 1 поздний выкидыш при сроке 20 недель беременности. Частота живорождения в исследуемых группах составила 30,6%, 23,1% и 16,3%, в 1,2 и 3 группах, соответственно (р=0,075). При этом наблюдается тренд снижения частоты живорождения в группе женщин, страдающих ожирением, по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела (2, р=0,059). Анализируя исходы беременностей, мы обнаружили, что по частоте прерывания беременностей исследуемые группы между собой значимо не различались. Всего в процессе исследования родилось 49 здоровых детей. ОШ живорождения у женщин с нормальной массой тела по сравнению с женщинами, страдающими ожирением составил 3.66 (95% ДИ: 1.41-10.26). ОШ живорождения у женщин с нормальной массой тела по сравнению с женщинами с избыточной массой тела составил 1.61 (95% ДИ: 0.66-4.05).
Учитывая большое количество исследований с противоречивыми данными относительно влияния избыточной массы тела на эмбриогенез, нами был проведен анализ взаимосвязи ИМТ с качеством эмбрионов, полученных в ходе лечения в программе ЭКО/ИКСИ. Оценка качества эмбрионов проводилась согласно классификации ESHRE от 2009 г. приблизительно через 72 часа после оплодотворения (3 сутки).
По результатам проведенного анализа было показано, что эмбрионы 3 суток культивирования по морфологическим критериям между исследуемыми группами статистически значимо не различаются (2, р=0,822) (таблица 15).
Следует отметить, что аномальное оплодотворение (формирование более 2-х пронуклеусов) или отсутствие оплодотворения наблюдалось в 7,3% (27 эмбрионов), 9,1% (17 эмбрионов) и 8,9% (14 эмбрионов) в группах исследования №1,2 и 3, соответственно. Статистически значимых различий по частоте патологического оплодотворения между группами обнаружено не было. Таблица 15 Характеристики эмбрионов 3 культивирования жизни у женщин исследуемых групп
Принимая во внимание данные исследований, указывающих на то, что видимые различия основных показателей изменения метаболических процессов могут быть заметны только через 68 часов после оплодотворения, нами была проведена оценка качества эмбрионов на 5 сутки культивирования (Таблица 16).
В группе женщин с нормальной массой тела на 5 сутки оплодотворения эмбрионы хорошего качества составили 55,9%, против 47,5% в группе женщин с избыточной массой тела и 39,2% в группе женщин, страдающих ожирением. Эмбрионы удовлетворительного и плохого качества составили 21,5% и 22,6%, 24,8% и 27,7%, 24,1% и 36,7% в группах №1, 2, и 3, соответственно.
На основании проведенного анализа было показано, что эмбрионов хорошего качества, отобранных по морфологическим критериям, было статистически значимо больше в группе женщин с нормальной массой тела по сравнению с группой женщин, страдающих ожирением (2, р=0,013). Эмбрионов плохого качества было значимо больше в группе женщин, страдающих ожирением, по сравнению с группой женщин с нормальной массой тела (2, р=0,018). Таблица 16 Характеристики эмбрионов 5 суток культивирования у женщин исследуемых групп
Для оценки жизнеспособности эмбрионов у женщин с различными показателями ИМТ была проведена оценка частоты бластуляции у пациенток, перенос эмбрионов которым производился на 5 сутки после оплодотворения. Частота бластуляции составила 60,8%, 62% и 55,8% в 1,2 и 3 группах, соответственно. На основании проведенного статистического анализа было показано, что по процентному соотношению частоты формирования бластоцист пациентки в исследуемых группах между собой не различались (тест 2; группа 1 против группы 2: р=0,809, группа 1 против группы 3: р=0,343, группа 2 против группы 3: р=0,305).
Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов программ ВРТ у пациенток в исследуемых группах
Выявленные в настоящем исследовании тенденции в отношении увеличения суммарной дозы препаратов, затраченных на стимуляцию суперовуляции, а также достоверное снижение числа полученных ооцитов и эмбрионов, частоты имплантации и живорождения у женщин с ожирением по сравнению с женщинами с нормальной массой тела согласуются с результатами большинства работ, изучающих данную проблему [36, 48, 66, 118].
Считается, что различного рода метаболические изменения у женщин с ожирением негативно отражаются на качестве ооцитов и эмбрионов и, таким образом, снижают результативность лечения в программе ВРТ [75, 118, 141]. В связи с этим, в настоящей работе были изучены особенности раннего эмбриогенеза на основании оценки качества эмбрионов согласно морфологическим критериям на третьи и пятые сутки культивирования после оплодотворения у женщин с различным ИМТ. В ходе анализа было обнаружено, что на третьи сутки после оплодотворения эмбрионы по качеству между исследуемыми группами не различались, в то время как на пятые сутки в группе женщин, страдающих ожирением, наблюдалось значимое снижение количества эмбрионов хорошего качества по сравнению с женщинами с нормальной массой тела.
Полученные данные могут свидетельствовать о дисфункции митохондриального аппарата при ожирении, которая начинает проявляться при активации метаболических процессов в эмбрионах на стадии бластоцисты в связи с возрастанием потребности в синтезе энергии для активного роста и имплантации. До стадии морулы потребление глюкозы эмбрионом и его метаболизм находятся на низком уровне. Начиная с момента формирования бластоцисты, резко возрастает потребление кислорода и углеродосодержащих соединений, увеличивается интенсивность гликолиза [76]. Таким образом, эмбрион переходит из состояния метаболического покоя (до стадии бластоцисты) к активному метаболизму на момент имплантации. Высокий уровень метаболизма окислительного характера напрямую зависит от функциональной активности митохондрий, в связи с чем состояние митохондриального аппарата играет определяющую роль в успешном течении этапов развития уже на стадии раннего эмбриогенеза. В случае метаболических нарушений, характерных для избыточного веса и ожирения, наблюдаются как изменения параметров митохондриального дыхания, приводящие к снижению эффективности окислительного метаболизма, так и изменения морфологических характеристик эмбрионов пятых суток культивирования, коррелирующие с их способностью к последующей имплантации и развитию. С другой стороны, отсутствие наблюдаемой корреляции для эмбрионов более раннего срока развития (третьи сутки) говорит о том, что на данном этапе, соответствующем низкому уровню метаболизма, фактически не работает фактор отбора эмбрионов, ассоциированный с их способностью далее поддерживать адекватный стадии развития уровень метаболизма.
В ходе настоящей работы были изучены особенности раннего эмбриогенеза в исследуемых группах в зависимости от концентрации адипокинов в плазме крови. На основании проведенного статистического анализа было установлено, что по совокупности критериев морфологической оценки качество эмбрионов третьих суток культивирования не зависели от содержания адипокинов в плазме крови исследуемых женщин. Иная картина наблюдалась среди эмбрионов пятых суток культивации, где было обнаружено, что у женщин с более низкими показателями лептина, С-реактивного белка, соотношения лептин/адипонектин в плазме крови наблюдалось большее число эмбрионов хорошего качества, и наоборот.
Конечно, только морфологическая характеристика качества эмбриона не исключает наличия у него хромосомной патологии, и перенос эмбриона с носительством хромосомной патологии может негативно отразиться на эффективности программы ЭКО. Таким образом, в дальнейшем необходимо провести верифицирующее исследование качества эмбрионов у женщин с нормальной массой тела и ожирением с использованием предимплантационного генетического скрининга для оценки вероятности развития хромосомной патологии на фоне дисфункции митохондриального аппарата.
На втором этапе настоящей работы, основываясь на предположении, что одним из механизмов, ведущих к репродуктивным неудачам при ожирении, является системное нарушение функционального состояния митохондриального ретикулума, была проведена оценка функционального состояния митохондрий МПК крови у пациенток исследуемых групп. Это исследование позволило охарактеризовать взаимосвязь избыточной массы тела, функциональной активности митохондрий МПК и живорождения.
Проведенный анализ не показал статистически значимых различий по показателям митохондриального потенциала в МПК и антиоксидантной защитной системы между исследуемыми группами, но при этом было обнаружено, что среди женщин, у которых лечение завершилось рождением ребенка, митохондриальный трансмембранный потенциал после стимуляции суперовуляции был достоверно ниже (t-критерий для независимых выборок, р=0,032), а концентрация tGSH выше (t-критерий для независимых выборок, р=0,026). Полученные данные согласуются с нашей гипотезой о том, что высокий трансмембранный потенциал митохондрий и недостаточная активность глутатион-зависимого звена антиоксидантной системы ведет к повышенному синтезу АФК, которые оказывают негативное влияние на качество ооцитов и исход беременности.