Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Папилломавирусная инфекция (обзор литературы) 12
1.1. Распространенность ПВИ 12
1.2. Роль ВПЧ в развитии CIN и РШМ 16
1.3. Современные методы диагностики ПВИ 20
1.4. Принципы современных методов лечения CIN . 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Материалы исследования 37
2.2. Методы исследования 38
2.3. Методы статистической обработки 48
Глава 3. Результаты собственных исследований 51
3.1. Результаты ВПЧ-генотипирования и клиническая характеристика обследуемых женщин 51
3.2. Результаты цитологического исследования 59
3.3. Результаты кольпоскопического исследования 61
3.4. Результаты гистологического исследования 66
3.5. Результаты исследования вариабельности генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов 68
3.6. Результаты исследования экспрессии мРНК генов 69
3.7. Результаты лечения пациенток с CIN, обусловленной ВПЧ 52 и 58 типов 83
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 87
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список сокращений 1
- Роль ВПЧ в развитии CIN и РШМ
- Принципы современных методов лечения CIN
- Методы исследования
- Результаты гистологического исследования
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Активное внедрение новых скрининговых программ по профилактике рака шейки матки (РШМ) не оказало существенного влияния на снижение частоты встречаемости данного заболевания, которое продолжает занимать третье место среди злокачественных опухолей репродуктивной системы у женщин [Parkin D.M. et al., 2005]. По данным Международного агентства по изучению рака ежегодно в мире регистрируются 470 000 новых случаев РШМ, половина из которых заканчиваются смертельным исходом (на женщин от 20 до 34 лет приходится 15% РШМ) [Deirdre P. et al., 2012].
В России РШМ является 2-й наиболее частой формой рака у женщин в возрасте от 15 до 44 лет [WHO/ICO Information Centre on HPV and Cancer, 2016]. За период с 2006 по 2014 гг. прослеживается общий прирост заболеваемости РШМ с 203,9 до 224,3 на 100 000 женского населения. Кроме того, растет показатель запущенности заболевания; удельный вес больных РШМ II-IV стадий составил 60-75% [Доброхотова Ю.Э. и соавт., 2015].
В 95 % случаях РШМ, подтвержденного гистологическими методами исследования, выявляются высокоонкогенные типы вируса папилломы человека (ВПЧ) [Cameron J.E., 2007]. Многочисленные исследования показывают, что спектр генотипов ВПЧ варьирует в различных регионах мира. По данным ВОЗ (2016) РШМ в 73,8% обусловлен ВПЧ 16 и 18 типов. В России данные относительно распространенности различных типов ВПЧ, ввиду ее географического расположения, разноречивы.
Большой научный интерес представляет изучение частоты
встречаемости ВПЧ 52 и 58 типов, которые распространены в странах Азии, обладают высокоонгогенным потенциалом и, в отличие от «европейских» типов, мало изучены. Ряд авторов выявили изменения последовательности генов E7 ВПЧ 58 типа (C632T (T20I) и G760A (G63S)), связанные с повышенным риском развития и со степенью тяжести цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) [Ding T. et al., 2010]. Однако данные
результаты противоречивы и требуют дальнейшего исследования [Azumi I. et al., 2013; Sun Z. et al., 2012].
Принимая во внимание вышеизложенное, актуальным является определение частоты встречаемости ВПЧ 52 и 58 типов, выявление CIN различной степени тяжести и РШМ, обусловленных данными типами ВПЧ, изучение вариабельности генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов, определение наличия вариантов C632T (T20I) и G760A (G63S), связанных с повышенным риском развития и/или со степенью тяжести CIN в когорте российских женщин, определение факторов риска, разработка тактики ведения.
Современные исследования больше фокусируют свое внимание на
изучении типов ВПЧ, значимости вирусной нагрузки,
иммуноцитохимических и иммуногистохимических маркеров в
дифференциальной диагностике степени тяжести CIN. Однако реакция
макроорганизма при ВПЧ-ассоциированных заболеваниях, как
прогностического маркера, не достаточно изучена. При CIN и РШМ происходит изменение уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека в эпителии шейки матки, регулирующих пролиферацию и клеточный цикл, апоптоз, инвазию, рецепторный аппарат клеток, опухолевую супрессию, сигнальный пептид, что является актуальным для оценки риска развития и прогрессирования CIN.
Необходимость решения этих вопросов послужила основанием для проведения настоящего исследования.
Цель исследования
Повышение эффективности диагностики и прогнозирования течения
заболеваний шейки матки, ассоциированных с папилломавирусной
инфекцией, с учетом клинических, молекулярно-генетических и
морфологических особенностей.
Задачи исследования
-
Оценить эффективность ВПЧ-генотипирования (21 тип) в первичном скрининге выявления патологии шейки матки и частоту встречаемости ВПЧ 52 и 58 среди других типов ВПЧ.
-
Оценить результаты цитологического исследования и расширенной кольпоскопии среди ВПЧ-позитивных и ВПЧ-негативных женщин в сравнительном аспекте.
-
Определить частоту встречаемости CIN различной степени тяжести и РШМ у пациенток с ВПЧ 52 и 58 типов.
-
Определить факторы риска возникновения CIN у пациенток с ПВИ, обусловленной ВПЧ 52 и 58 типов.
-
Изучить вариабельность генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов, определить наличие вариантов, связанных с повышенным риском развития и/или со степенью тяжести CIN (C632T (T20I) и G760A (G63S)) в когорте российских женщин.
-
Изучить экспрессию мРНК функциональных генов человека, регулирующих пролиферацию и клеточный цикл (MKI 67 (KI67), CDKN2A (P16)), апоптоз (BCL2, BAG1, BAX), инвазию (CTSL2), рецепторный аппарат клеток (ESR1, PGR, CD68), опухолевую супрессию (PTEN), сигнальный пептид (SCUBE2) и их связь с риском развития и прогрессирования CIN.
-
Разработать тактику ведения пациенток с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки с учетом комплекса молекулярно-генетических маркеров.
Научная новизна Впервые проведено ВПЧ-генотипирование (21 тип) в первичном скрининге патологии шейки матки у женщин репродуктивного возраста, выявлена распространенность ВПЧ 52 и 58 типов среди других типов, определена их роль в возникновении CIN различной степени тяжести и РШМ. Проведен сравнительный анализ результатов цитологического исследования и расширенной кольпоскопии среди ВПЧ-позитивных и ВПЧ-
негативных женщин. Впервые изучена последовательность генов Е6/Е7 ВПЧ
52 и 58 типов в когорте российских женщин, установлена их низкая
вариабельность, не выявлены варианты C632T (T20I) и G760A (G63S),
связанные с повышенным риском развития и/или со степенью тяжести CIN.
Впервые изучена экспрессия мРНК 11 функциональных генов человека (MKI
67 (KI67), CDKN2A (P16)), BCL2, BAG1, BAX, CTSL2, ESR1, PGR, CD68,
PTEN, SCUBE2) и их связь с риском развития CIN. Определены
прогностические маркеры риска развития CIN: мРНК генов MKI67 (KI67),
CDKN2A (P16), PGR, BCL2. На основе изменении уровня экспрессии данных
маркеров проведен многофакторный анализ при помощи бинарной
логистической регрессии с построением модели для выявления пациенток с
риском развития CIN и РШМ. Разработан алгоритм ведения пациенток с
наличием и/или персистенцией высокоонкогенных типов ВПЧ и
плоскоклеточным интраэпителиальным поражением низкой степени тяжести (LSIL).
Практическая значимость
Определена диагностическая информативность ВПЧ-генотипирования
(21 тип) с определением вирусной нагрузки методом ПЦР в режиме
реального времени и целесообразность его включения в алгоритм
обследования женщин репродуктивного возраста. Определены
высокоонкогенный потенциал ВПЧ 52 и 58 типов и факторы риска возникновения CIN в когорте российских женщин. Всем женщинам с наличием ВПЧ высокого риска, независимо от результатов цитологии, следует проводить расширенную кольпоскопию для раннего выявления ВПЧ-ассоциированных заболевании шейки матки. Определена прогностическая значимость изученных маркеров мРНК генов в эпителии шейки матки, связанных с риском развития CIN и доказана целесообразность их включения в комплексное обследование пациенток с персистенцией высокоонкогенных типов ВПЧ и LSIL.
Для выявления пациенток с риском развития неопластических процессов эпителия шейки матки и РШМ можно использовать следующую модель:
Z = 0,8*ln [KI67]/[PGR] + 1,6*ln [P16]/[BCL2] - 4, где
[KI67]/[PGR] - отношение уровней экспрессии мРНК генов KI67 и PGR, [P16]/[BCL2] - отношение уровней экспрессии мРНК генов P16 и BCL2.
Положения, выносимые на защиту:
-
Установлена высокая диагностическая информативность ВПЧ-генотипирования (21тип) с определением вирусной нагрузки методом ПЦР в режиме реального времени в первичном скрининге патологии шейки матки у женщин репродуктивного возраста для выявления группы высокого риска по развитию CIN и РШМ. Определены наиболее распространенные типы ВПЧ: 16, 58, 31, 52, 33 (группа А9). Аномальная цитология у ВПЧ-позитивных женщин встречается в 4.6 раза чаще, чем среди ВПЧ-негативных. Нормальная цитология у ВПЧ-позитивных женщин не исключает наличия поражения эпителия шейки матки и требует проведения расширенной кольпоскопии, что позволяет дифференцировано подходить к дальнейшей тактике ведения пациенток.
-
Определены часто встречающиеся типы ВПЧ при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях различной степени тяжести - 16, 58 и 52. В обследованной когорте российских женщин установлены высокоонкогенный потенциал ВПЧ 52 и 58 типов, низкая вариабельность генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов, не выявлены варианты C632T (T20I) и G760A (G63S), связанные с повышенным риском развития и/или со степенью тяжести CIN.
-
Повышение экспрессии мРНК генов MKI67 (KI67), CDKN2A (P16), снижение экспрессии BCL2 и PGR наиболее выражено при HSIL и РШМ, что может свидетельствовать о стимуляции пролиферативных процессов и подавлении апоптоза. Данные маркеры могут быть рекомендованы в клинической практике в качестве дополнительных методов обследования. Предложена модель бинарной логистической регрессии,
позволяющая выделить группу пациенток с высоким риском развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии и РШМ. При выявлении риска рекомендуется сокращение сроков скрининга или проведение биопсии шейки матки.
Личный вклад автора
Автор участвовал в выборе темы диссертационной работы, клинико-лабораторном обследовании пациенток, сборе биологического материала и лечении, в проведении анализа медицинской документации, в статистической обработке материала и обобщении полученных результатов.
Соответствие диссертации паспорту полученной специальности
Научные положения диссертации соответствуют специальности 14.01.01 – «акушерство и гинекология», полученные в работе результаты соответствуют области исследования по специальности, пунктам 3, 4, 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация диссертации
Материалы диссертации доложены на XVII Всероссийском конгрессе
«Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы»
(Москва, 22-25 марта 2011), на XII Всероссийском конгрессе «Мать и дитя»
(Москва, 20-23 сентября 2011), на курсах усовершенствования врачей
«Диагностика, лечение, профилактика патологии шейки матки.
Кольпоскопия» (Москва, 17-21 декабря 2012), на VII Международном
конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 21-24 января 2013), на XIX
Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая помощь - в
эпицентре женского здоровья» (Москва, 12-15 марта 2013), на курсах усовершенствования врачей «Кольпоскопия и патология шейки матки» (Москва, 3-16 апреля 2013), на Научно-практической конференций с международным участием «Национальный и международный опыт охраны репродуктивного здоровья девочек» (Москва, 4-7 июня 2013), на XXIX Международном конгрессе c курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 7-10 июня
2013), на XIV Всероссийском конгрессе «Мать и дитя» (Москва, 24-27 сентября 2013), на VIII Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 20-23 января 2014), на XX Юбилейном Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая помощь в эпицентре женского здоровья» (Москва, 18-21 марта 2014), на XV Всероссийском форуме «Мать и Дитя» (Москва, 23-26 сентября 2014), Еurogin 2015 (Севилья, Испания, 4-7 февраля 2015), на VIII региональном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 29-июня-1 июля 2015), на XXII Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: диагностика, лечение, профилактика» (Москва, 4-7 апреля 2016), на XXIII Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 11-14 апреля 2016) на XIX Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва,17-20 января 2017).
Диссертационная работа обсуждена на межклинической конференции научно-поликлинического отделения (НПО) (21.04.2016г.) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (09.06.2016г., протокол № 7).
Внедрение результатов исследования в практику
Алгоритмы ведения пациенток с ВПЧ-ассоциированными
заболеваниями шейки матки, основанные на результатах исследования, используются в практической деятельности врачей акушеров-гинекологов НПО ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 5 - в изданиях рецензируемых ВАК Министерства образования РФ.
Структура и объем диссертации
Роль ВПЧ в развитии CIN и РШМ
В Европе наиболее распространенными типами ВПЧ у женщин с CIN и РШМ считаются 16 (61.6%) и 18 (7%), в Китае - 16 (33.3%) и 58 (23.8%), в Мексике - 58 (28.5%), 16 (25.7%) и 18 (13.3%), в Южной Бразилии - 16 (34.7%), 58 (13.8%) и 33 (13.8%) типы [44,61,78,79,139]. Мета-анализ, включающий 14 японских исследований показал, что часто встречающимися типами в Японии являются ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35, 52, 58 типов. N. Munoz et al. (2004) сообщили, что в Юго-Восточной Азии ВПЧ 16 и 18 типов при РШМ выявлялись в 73.5%, в Северной Африке - 76.9% , в Европе - 71.5%. В Юго-Восточной Азии ВПЧ 52 и 58 типов были обнаружены в 6.1% случаях РШМ, в Северной Африке - 1.5%, в Европе (Северной Америке) - 1.1% [32,60]. В Японии ВПЧ 16 и 18 типов встречались реже (58.8%), а ВПЧ 52 и 58 типов были более распространенными (13.7%). Таким образом, ВПЧ 52 и 58 типов в последнее время часто выявляются при CIN и РШМ, но их значение в развитии предраковых заболеваний шейки матки в популяции женщин РФ не изучено.
Молекулярная филогеография является «золотым стандартом» описания генеалогии, трансмисии и распространения вируса в прошлом и мощным эпидемиологическим инструментом определения связи ВПЧ 58 типа с РШМ. Однако в связи с неравномерным распределением определенных для международной популяции уровней заболеваемости, в дополнение к отсутствию информации по некоторым нациям и регионам с высокой распространенностью ВПЧ 58 типа, результаты филогеографического анализа глобального географического распределения ВПЧ 58 типа еще не доложены. Ни в одной из рассмотренных публикаций не было проведено подробной аналитической оценки глобальной филогеографии ВИЧ 58 типа, как и истории миграции вируса. Следует отметить, что для Континентального Китая, являющегося регионом с исключительно высокой распространенностью ВПЧ 58 типа, накоплено недостаточно данных по нуклеотидным последовательностям генома ВПЧ 58 для проведения анализа. Как сформировалась уникальная картина распределения ВПЧ различных типов? Связана ли она с миграцией и эволюцией вариантов ВПЧ, либо с восприимчивостью популяции и региональными различиями программ скрининга? Молекулярная филогеография является подходящим методом разрешения этих вопросов, позволяет не только отслеживать миграцию и распространения «древних» штаммов вируса, но также является и мощным эпидемиологическим инструментом определения связи различных типов ВПЧ с РШМ. В прошлом принципы филогеографии были использованы для анализа ВПЧ 16 типа, результаты которого вдохновили и озадачили нас. В течение долгого времени различия внутри типов ВПЧ считались довольно ограниченными, так как различия нуклеотидных последовательностей гена L1 укладывались в 2%-ный диапазон. Таким образом, эволюция ВПЧ отражает картину миграции и эволюции человека. Однако было проведено только небольшое число исследований, направленных на изучение филогеографии ВПЧ 58 типа. Calleja-Macias I.E. (2005) определил отсутствие четкого сходства филогенетической топологии ВПЧ 58 и 16 типов [30,117,142].
Высокая распространенность ВПЧ 58 типа выявлена у пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки в Южной Бразилии. Частота и генотипирование ВПЧ определялись методом ПЦР у женщин с наличием атипических клеток при цитологическом и/или гистологическом исследовании. Были оценены образцы шейки матки у 256 пациенток, из них 51% оказались ВПЧ-позитивными. Наиболее распространенными генотипами были ВПЧ 16 (34.7%) и 58 (13.8%) типов, далее - ВПЧ 33 (9.72%), 11 (8.33%), 18 (5.55%), 53 (5.55%), и 6 (4.2%). В четырех образцах (5,55%) выявлены несколько типов ВПЧ [79].
В аналогичном исследовании определялась распространенность ВПЧ у 332 женщин Гонконга с наличием атипических клеток в цитологических мазках. Общее количество ВПЧ-позитивных женщин составило 44.3%. ВПЧ был выявлен у 18.6% женщин с воспалительными изменениями шейки матки, 36.4% - с кондиломами, 64.7% - с CIN I, 37.9% - с CIN II, 68. 3% - с CIN III и 77.8% - с карциномой шейки матки. Несколько типов ВПЧ были обнаружены в 31,3% случаях у женщин с нормальной цитограммой и цитограммой воспаления, в 10.5% - с CIN и карциномой шейки матки. Наиболее часто определяющимися типами были ВПЧ 16 (33.3%), ВПЧ 58 (23.8%), ВПЧ 11, 18, 31 (8.8%) и ВПЧ 33 (6.8%). Редко встречающийся во всем мире ВПЧ 58 типа оказался вторым наиболее распространенным генотипом, обнаруженным у пациенток с цервикальной карциномой. Наличие ПВИ, обусловленной ВПЧ 58 типа, показало значительную корреляцию с CIN/карциномой (95% ДИ = 1.22-14.35) и значительную тенденцию увеличения распространенности с увеличением степени тяжести поражения шейки матки [36,50,77]. Таким образом, высокая распространенность ВПЧ 58 типа у пациенток с карциномой шейки матки играет важную роль в области разработки новых методов выявления ВПЧ и вакцин.
Принципы современных методов лечения CIN
Забор материала для цитологического исследования из экзоцервикса и эндоцервикса производили стерильной щеткой – эндобрашем с обязательным прицельным захватом клеток со всех подозрительных участков, включая стык цилиндрического и многослойного плоского эпителия. Материал наносили одним касательным движением щетки в одном направлении по предметному стеклу и фиксировали спреем BIO-FIX. Подсушенные мазки маркировали.
Для оценки теста Папаниколау использовали систему Бетесда (TBSerminology Bethesda System), предложенная Национальным институтом по изучению рака США, пересмотренная в 2011году (таблица 3). Таблица 3
Терминологическая система Бетесда, 2001(TBSerminology Bethesda System) Атипичные железистые клетки Atypical glandular cells AGC Атипичные железистые клетки, похожие на неопластичные Atypical glandular cells, favor neoplastic AGC, favor neoplastic Атипичные клетки плоского эпителия Atypical squamous cells ASC Атипичные клетки плоского эпителия неясного значения Atypical squamous cellsunderterminedsignificance ASC-US Атипичные клетки плоского эпителия, не позволяющие исключить HSIL Atypical squamous cells cannot exclude HSIL ASC-H Цервикальная интраэпителиальная неоплазия 1, 2 или 3 степени Cervical intraepithelial neoplasia grade 1, 2 or 3 CIN 1, 2, 3 Карцинома in situ Carcinoma in situ CIS Высокая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения High grade squamous intraepitelial lesion HSIL Низкая степень плоскоклеточного интраэпителиального поражения Low grade squamous intraepitelial lesion LSIL Не определенные иначе Not otherwise specified NOS Плоскоклеточное интраэпителиальное поражение Squamous intraepitelial lesion SIL При использовании жидкостной цитологии для забора материала использовали щетки со съемной головкой типа Cervix-brush. Перед проведением данной манипуляций тщательно очищали шейку матки от слизи. Конус щеточки вводили в цервикальный канал, остальную часть щеточки прижимали к поверхности экзоцервикса и производили 5 полных круговых вращений - три по часовой стрелке и два - против часовой стрелки. Щеточку с материалом опускали в контейнер с жидкой транспортной средой и тщательно ополаскивали там. При этом нужно было стараться, чтобы «щетинки» cervix-brush полностью погружались в раствор, который "консервирует" собранный биоматериал, препятствует повреждению клеток и позволяет преодолеть бактериальное "засорение". Со щетки снимали наконечник и помещали в контейнер. Далее контейнер доставляли в лабораторию, где тонкий слой суспензии помещали на стекло для цитологического исследования.
Морфологические методы исследования (гистологическое исследование биопсийного материала)
После анализа цитологического заключения, результатов расширенной кольпоскопии и определения наличия или отсутствия ВПЧ, производили прицельную БШМ (по показаниям). Противопоказаниями к проведению БШМ были острые воспалительные заболевания и выраженные коагулопатии. Перед БШМ проводили комплексное клинико-лабораторное обследование пациентки по общепринятой в гинекологической практике схеме и получали согласие пациентки в письменном виде, с указанием возможных осложнений.
БШМ проводили в условиях асептики и антисептики под внутривенной анестезией (в условиях стационара), без анестезии (амбулаторно) или под местным обезболиванием (10% раствор лидокаина-спрей). В асептических условиях шейку матки обнажали в зеркалах и обработали раствором антисептика. Прицельную БШМ производили радиоволновым петлевым электродом, щипцами (конхотом) или скальпелем. Материал брали из наиболее подозрительного участка шейки матки (по результатам расширенной кольпоскопии), при наличии множественных патологических очагов, брали несколько образцов ткани. Важно было, чтобы биоптат получался достаточно большим (около 5 мм в ширину) и наряду с плоским эпителием, захватывали соединительную ткань шейки матки (3–5 мм стромы). Зону биопсии документировали, материал маркировали и отправляли на гистологическое исследование. В лаборатории его фиксировали в парафин или замораживали в термостате. Затем парафиновый блок или замороженный кусочек резали и помещали срезы на стекла, окрашивали и исследовали под микроскопом.
Гистологические образцы оценивались по классификации ВОЗ (2014): плоскоклеточное интраэпителиальное поражение легкой степени - LSIL (CIN 1), тяжелой степени - HSIL (CIN 2-3) и РШМ.
По показаниям с БШМ проводили выскабливание цервикального канала для исключения предраковых поражений и злокачественной трансформации эндоцервикса.
В процессе статистической обработки данных применяли методы описательной статистики, корреляционный анализ, расчеты проводились на компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», и пакетов прикладных программ «Statistica for Windows» v. 7.0, StatSoft Inc. (США) и SPSS v.17.0. Все данные были введены в формат компьютера.
Для качественных данных определяли показатели частоты (%). Данные описательной статистики представлены в виде средних значений (М) и их стандартных отклонений ().
Для количественной оценки уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека использовали метод Сq c нормировкой по 3 референсным генам TBP, B2M и GUSB. За 1 было принято значение уровня экспрессии в контрольной группе. В качестве меры центральной тенденции всех количественных показателей использовали медиану (Me), в качестве интервальной оценки -нижний Q1 (0,25) и верхний Q3 (0,75) квартили.
Методы исследования
Для выявления повышенного риска развития и степени тяжести неоплазии эпителия шейки матки, а также наличия вариантов C632T (T20I) и G760A (G63S), нами изучена вариабельность генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов в 30 цервикальных образцах, из них с ВПЧ 58 типа - 16 (53.3%), с ВПЧ 52 типа -14 (46.7%). Результаты генотипирования ВПЧ 52 и 58 типов подтвердились методом секвенирования по Сэнгеру.
В результате анализа последовательности генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов была установлена их низкая вариабельность. Только в одном цервикальном образце была обнаружена одна нуклеотидная замена - замена тимина (Т) на цитозин (С) в 757 положении (Т757С) (таблица 7).
В результате анализа вариабельности генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов была обнаружена одна нуклеотидная замена, не выявлены варианты C632T (T20I) и G760A (G63S), связанные с повышенным риском развития и/или со степенью тяжести CIN. В обследованной когорте российских женщин установлена низкая вариабельность генов Е6/Е7 ВПЧ 52 и 58 типов.
С целью прогнозирования развития и течения неопластической трансформации эпителия шейки матки была изучена экспрессия мРНК функциональных генов человека, регулирующие пролиферацию и клеточный цикл (MKI 67 (KI67), CDKN2A (P16)), апоптоз (BCL2, BAG1, BAX), инвазию (CTSL2), рецепторный аппарат клеток (ESR1, PGR, CD68), сигнальный пептид (SCUBE2), опухолевую супрессию (PTEN). Были обследованы 225 женщин (из 582), из них 45 (20%) - ВПЧ-негативные (контрольная группа), 180 (80%) -ВПЧ-позитивные (основная группа), которые были разделены на 4 подгруппы: II группа –56 (24.9%) женщин с ВПЧ-носительством (NILM), III группа – 50 (22.2%) с LSIL, IV группа - 55 (24.4%) с HSIL, V группа -19 (8.5%) с РШМ.
Всем пациенткам проводилось определение уровня экспрессии мРНК функциональных генов человека. В качестве маркеров были выбраны гены, регулирующие пролиферацию и клеточный цикл (MKI 67 (KI67), CDKN2A (P16)), инвазию (CTSL2), апоптоз (BCL2, BAX, BAG1), рецепторный аппарат клеток (ESR1, PGR , CD68), опухолевую супрессию (PTEN), сигнальный пептид (SCUBE2). По результатам исследования во II группе выявлено достоверное повышение экспрессии мРНК MKI67 (KI67) в 1,8 раза (р=8,3 х 10-3), CDKN2A (P16) в 1,6 раза (р=4,6 х 10-2), CTSL2 в 1,5 раза (р=3,2 х 10-2) по сравнению с контрольной группой.
В III группе отмечено достоверное повышение экспрессии мРНК MKI67 (KI67) в 1,5 раза (р=4,4 х 10-2) и CDKN2A (P16) в 2,9 раза (р=2,2 х 10-4) по сравнению с контрольной группой.
В IV группе выявлено достоверное повышение MKI67 (KI67) в 2,5 раза (р=5,7 х 10-6), CDKN2A (P16) в 5,9 раза (р=1,2 х 10-7) по сравнению с контрольной группой и снижение PTEN в 1,2 раза (р=2,4 х 10-2 ).
В V группе повышение экспрессии мРНК еще более существенно: MKI67 (KI67) в 10,3 раза (р=1,6 х 10-7), CDKN2A (P16) в 11 раз (р=1,7 х 10-5). При этом отмечается снижение BCL2 в 3,6 раза (р=2,2 х 10-4), SCUBE2 в 2,5 раза (р=2,5 х 10-2), BAG1 и BAX в 1,9 раза (р=7,5 х 10-3 и р=1,6 х 10-2 соответственно), PTEN в 1,4 раза (р=1,4 х 10-3). Значительно (в 25 раз) снижается рецепторный аппарат клеток - ESR1и PGR (р=3,2 х 10-4 и р=3,2 х 10-5 соответственно), по сравнению с контрольной группой (таблица 8). Таблица 8
Для оценки функционального состояния тканей был проведен многофакторный анализ при помощи бинарной логистической регрессии с построением модели. По результатам проведенного нами исследования была выбрана модель, описывающая соотношение уровней экспрессии 4 генов: MKI67 (KI67), CDKN2A (P16), PGR и BCL2. Уравнение регрессии имело вид: Z = 0,8 ln [KI67]/[PGR] + 1,6 ln [P16]/[BCL2] - 4, где [KI67]/[PGR] - отношение уровней экспрессии мРНК KI67 и PGR, [P16]/[BCL2] - отношение уровней экспрессии мРНК P16 и BCL2.
На основании полученной функции для каждого образца была рассчитана вероятность развития неопластической трансформации эпителия шейки матки. Для определения критического значения вероятности (точка cut-off) был выполнен ROC-анализ (рисунок 22). Площадь под ROC-кривой составила AUC=0,984±0,16, p 0,0001, что позволило оценить модель как отличную.
Все женщины контрольной группы по результатам классификации были определены в свою группу. В группу высокого риска развития неопластической трансформации эпителия шейки матки попали 29 пациенток: 5 (8.9%) - из II группы, 9 (18%) - из III группы, 15 (27.3%) - из IV группы.
При сравнении пациенток, попавших в группу риска, с другими пациентками соответствующих групп, установлено, что у них более выражены факторы риска по развитию ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки (ранее начало половой жизни, большое количество половых партнеров, ИППП) (р 0,01). Кольпоскопическая картина у пациенток группы риска в 93.1% случаях характеризовалась наличием слабовыраженных и выраженных изменений, что позволяет рассматривать данный метод, как один из важных методов в диагностике заболевании шейки матки. Частыми типами ВПЧ у пациенток группы риска явились: 16, 58, 31, 52, 33 и в 65.5% случаях выявлено наличие 2 и более типов ВПЧ, а также высокая вирусная нагрузка (у 69% вирусная нагрузка была более 5 lg копий вируса в образце).
Таким образом, пациентки, попавшие в группу риска по развитию неопластической трансформации эпителия шейки матки, имели клинические и лабораторные изменения. Сравнительные данные по группам представлены на таблицах 9,10,11.
Результаты гистологического исследования
Полученные результаты показали, что аномальная цитология среди ВПЧ-позитивных женщин встречалась достоверно чаще и составила 57.1%, при этом ВПЧ 52 и 58 типов встречались при NILM у 17.5%, при АSCUS - 5.6%, при LSIL - 28.1%, при HSIL - 33.3%, при РШМ - 25%, что указывает на их высокоонкогенный потенциал. LSIL, обусловленная ВПЧ 52 типа, встречалась в 11.4% случаях, ВПЧ 58 типа - в 16.7%, при HSIL - 12.7%/20.6%, при РШМ -10%/15% соответственно. Таким образом, полученные нами данные показали, что ВПЧ 52 и 58 типов являются причиной аномальной цитологии у 28.4% пациенток, что требует более тщательного обследования состояния эпителия шейки матки для раннего выявления поражения (расширенная кольпоскопия, БШМ по показаниям).
При проведении расширенной кольпоскопии были выявлены достоверные различия между группами (р 0,05). Косвенные признаки ВПЧ поражения выявлены достоверно чаще во 2 группе: слабовыраженные изменения эпителия шейки матки - 27.6%, выраженные – 25.2%. Слабовыраженные и выраженные изменения эпителия шейки матки, обусловленные ВПЧ 52 и 58 типов, встречались в 53.2%, что позволяет рассматривать данный метод, как один из важных методов в ранней диагностике патологии шейки матки у ВПЧ-позитивных женщин. Следует особо подчеркнуть, что у 25.4% ВПЧ-позитивных пациенток с нормальной цитологией (42.9%) выявлены изменения эпителия шейки матки, требующие проведения БШМ. При гистологическом исследовании биоптатов шейки матки CIN I диагностирована у 26.7%, CIN II – 8.9%, CIN III – 2.2%, плоская кондилома шейки матки – 22.2%, экзофитные кондиломы шейки матки – 20%, ВПЧ – ассоциированный цервицит – 20%. Основными типами ВПЧ при этом явились: 16 (31.1%), 31 (20%), 58 (17.8%), 33 (13.3%), 52 (11.1%), другие типы встречались менее чем в 6.7% случаях, что еще раз подтверждает частую встречаемость и высокоонкогенный потенциал данных типов ВПЧ. Следовательно, основываясь на результатах нашего исследования можно сказать о важности проведения расширенной кольпоскопии при наличии высокоонкогенных типов ВПЧ (особенно 16, 58, 31, 52, 33), для своевременного выявления изменений эпителия шейки матки.
Масштабное исследование было проведено в трех университетских больницах Кореи с участием 40847 женщин, которым проводили цитологическое исследование шейки матки, ВПЧ-генотипирование и расширенную кольпоскопию с 2007 по 2013 года [101]. Полученные результаты совпадают с нашими результатами и также считают расширенную кольпоскопию важным методом диагностики патологии шейки матки, особенно среди женщин с ASCUS или LSIL по цитологии. Кроме того, мета-анализ проведенный Olaniyan O.B. (2002) показал, что расширенная кольпоскопия является высокоинформативный методом для раннего выявления цервикальных интраэпителиальных поражений [111].
Нами была проанализирована взаимосвязь часто встречающихся типов ВПЧ с CIN и РШМ (рисунок 16). Достоверно чаще при РШМ встречался ВПЧ 16 типа (р=0,001). Следует также отметить высокую частоту встречаемости ВПЧ 52 и 58 типов у пациенток с CIN и РШМ по сравнению с другими типами ВПЧ. CIN различной степени тяжести, обусловленная данными типами ВПЧ, встречалась в 31.4% случаях: CIN I – 28.7%, CIN II - 36.7%, CIN III - 30.8%, а РШМ - 25% - выявлялись достоверно чаще, чем субклинические формы ПВИ (р 0,001). Таким образом, полученные нами результаты показали, что часто встречающимися типами ВПЧ при CIN различной степени тяжести явились ВПЧ 16, 58 и 52 типов, обладающие высокоонкогенным потенциалом.
Высокая частота встречаемости и высокоонкогенный потенциал ВПЧ 52 и 58 типов также подтвержден в исследованиях, проведенных в Японии, Китае, Мексике, Бразилии [36,44,50,77,78,79,139]. Основная территория широкого распространения ВПЧ 52 и 58 типов – это Азия, поэтому к данным типам ВПЧ можно применить термин «азиатские» типы. Таким образом, персистенция «азиатских» типов ВПЧ должна настораживать клинициста в первую очередь с позиции риска развития CIN и РШМ.
Исходя из вышеизложенного, мы полагаем, что ВПЧ – генотипирование (21 тип) методом ПЦР в режиме реального времени в виду высокой информативности, следует включить в алгоритм обследования женщин репродуктивного периода для раннего выявления ВПЧ-ассоциированных заболеваний шейки матки. Зарубежные рандомизированные исследования также показали, что скрининговые программы профилактики РШМ должны проводиться с использованием ВПЧ-генотипирования [100]. Эффективность диагностики CIN значительно повышается по сравнению со скринингом, основанном только на цитологическом исследований шейки матки. Кроме того, ВПЧ-генотипирование рекомендуется для дальнейшей оценки аномальных цитологических мазков и при наблюдении за пациентами с патологией шейки матки [99].
Monsonego J. утверждает, что 1/3 случаев РШМ приходится на женщин, которые проходят регулярный скрининг, так как цитологическое исследование является недостаточно чувствительным методом диагностики (менее 70%). В 5% случаях РШМ наблюдается у женщин с аномальной цитологией, которых неправильно наблюдали. Широкое внедрение ВПЧ-генотипирования в первичный скрининг открывает многообещающие перспективы оптимальной защиты. Чувствительность ВПЧ-теста при HSIL превышает 95% [107].