Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Функциональная активность эндометрия: молекулярные механизмы регуляции фертильности в программе эко (Обзор литературы) 12
1.1. Структура и функции эндометрия 12
1.2. Роль гормонов в процессе имплантации 10
1.3. Эндометрий и «окно имплантации» 20
1.4. Ангиогенез и процесс имплантации 23
1.5. Молекулы клеточной адгезии в процессе имплантации 25
1.6. Процесс имплантации – воспалительная реакция 31
1.7. Пути воздействия на функциональную активность эндометрия
1.7.1. Физический фактор и рецептивность эндометрия 38
1.7.2. Циклическая гормональная терапия и рецептивность эндометрия 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Материалы исследования 45
2.2. Методы исследования 49
2.3. Гинекологическое обследование пациенток .50
2.4. Гормональное обследование пациенток 50
2.5. Ультразвуковое исследование органов малого таза 52
2.6. Оценка инфекционного статуса 52
2.7. Иммуноферментный анализ 53
2.8. Иммуногистохимическое исследование 53
2.9. Протокол стимуляции суперовуляции.. 54
2.10. Методики воздействия на эндометрий перед программой ЭКО 59
2.11. Статистический анализ .59
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Клиническая характеристика пациенток .61
3.2. Результаты клинико-лабораторного обследования 70
3.3. Системные и локальные изменения L-селектина и других маркеров
воспалительно-ангиогенного стресса у пациенток с бесплодием трубного происхождения .75
3.3.1. Результаты исследования L-селектина, вч-СРБ, ИЛ-1, ИЛ-6 в сыворотке крови 75
3.3.2. Построение ROC-кривых и моделей по оценке содержания L-селектина, вч-СРБ, ИЛ-1, ИЛ-6 в сыворотке крови для прогнозирования наступления беременности 78
3.3.3. Оценка экспрессии L-селектина, MEСA-79, рецептора ИЛ-6Р, рецептора ИЛ-1Р в эндометрии
3.4. Показатели контролируемой индукции овуляции, анализа эякулята и эмбриологического этапа программы ЭКО 89
3.5. Роль L-селектина в оценке эффективности программы ЭКО 93
3.6. Клиническая эффективность программы ЭКО в группах исследования .97
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 100
Выводы .110
Практические рекомендации 111
Список сокращений 112
Список литературы
- Эндометрий и «окно имплантации»
- Гинекологическое обследование пациенток
- Результаты клинико-лабораторного обследования
- Показатели контролируемой индукции овуляции, анализа эякулята и эмбриологического этапа программы ЭКО
Эндометрий и «окно имплантации»
Эндометрий человека подвергается циклическим морфологическим изменениям. Комплекс биологических процессов вовлечен в репродуктивные события, включая: регуляция клеточного деления, метаболизм биохимических медиаторов и воспалительный ответ. Определенные молекулярные и клеточные механизмы, с помощью которых стероиды способствуют развитию рецептивного эндометрия, все еще являются объектом дальнейших исследований. Нарушение регуляции этих событий приводит к недостаточной репродуктивной функции, которая включает неудачную имплантацию и маточные кровотечения [38].
В организме человека, регенерация эндометрия после каждого менструального цикла начинается с пролиферации базального слоя, прежде чем уровень циркулирующих эстрогенов увеличится [95]. Пролиферативная активность резко возрастает с увеличением уровня эстрогенов и достигает пика между 8 и 10 днем менструального цикла. Эпителиальные и стромальные компоненты эндометрия высоко чувствительны к стимуляции эстрогенами и их ответ происходит в двухфазном режиме. Эти ответы были широко изучены на физиологическом, морфологическом и молекулярном уровне. Известно, что у мышей ранняя реакция матки на воздействие эстрогенов включает: транскрипцию генов раннего клеточного цикла, гиперемию, инфильтрацию иммунными клетками и пропитывание водой ткани матки. Более поздние ответы включают: дальнейшую инфильтрацию иммунными клетками, увеличение массы матки и индукцию генов конца клеточного цикла, все это приводит к синтезу ДНК и митозу в эпителиальных клетках [88].
Исследования показывают, что у мышей после двухсторонней овариоэктомии может наблюдаться эпителиальная пролиферация эндометрия через 6 часов после воздействия эстрогенами. Эстрогены стимулируют активацию 1-рецептора инсулиноподобного фактора роста (ИФР1Р), что приводит к активации фосфоинозитид 3-киназного (PI3K) / AKT пути и осуществляется тормозящее фосфорилирование гликоген-синтетазы-киназы (GSK-3). Инактивация GSK-3 ограничивает ингибирование фосфорилирования циклин D1 и ведет к ядерной транслокации. Эстроген также индуцирует экспрессию циклина Е- и циклина A-cdk2 киназы, которые способствуют гиперфосфорилированию белков Rb и P107. Гиперфосфорилированные белки не способны ингибировать E2F-опосредованную транскрипционную трансактивацию. В результате происходит активация аппарата репликации ДНК и вступления в S-фазу клеточного цикла, обеспечивающего надежную пролиферацию эпителия матки. Ингибирование пролиферации впоследствии необходимо для успешной имплантации [96]. Предложенные механизмы для торможения пролиферации регулируются прогестероном.
Эстрогены и прогестерон являются доминантными гормональными модуляторами эндометриального развития. Гормональная активность зависит не только от уровня прогестерона, эстрогена и их рецепторов, но также от активности их метаболизма (например, повышение экспрессии энзимов, которые превращают эстрадиол в эстрон сульфат) [69, 80].
Исследования имплантации эмбриона у мышей показали, что наблюдается резкое повышение уровня эстрогенов на четвертый день естественной беременности и совпадает с повышением экспрессии ЛИФ (лейкоз ингибирующий фактор), который является членом семейства ИЛ-6. Эстрогены непосредственно активируют секрецию ЛИФ путем связывания с рецепторами- эстрогенов [180]. ЛИФ является секретируемым гликопротеином, который связывается с рецептором ЛИФ (ЛИФР) и gp130 и активирует нисходящий трансдуктор и активатор транскрипции (STAT). Оба этих рецептора экспрессируются бластоцистой также хорошо, как и маточным люминальным эпителием, осуществляя аутокринно-паракринную регуляцию во время имплантации. Экспрессия ЛИФ происходит в железистом эпителии, а затем в строме в месте прикрепления бластоцисты. Было показано, что у мышей, лишенных ЛИФ, матка не реагирует на присутствие эмбриона и не происходит децидуальной реакции. Эти данные свидетельствуют о том, что эстрогены стимулируют синтез собственных ЭР-, а также начало железистой секреции ЛИФ, которая необходима для формирования «окна имплантации», но впоследствии не требуется для поддержания беременности. Экспрессия ЛИФ также высока у человека во время имплантации эмбриона. В эндометрии у женщин с необъяснимым бесплодием и многочисленными неудачами имплантации часто определяется значительно более низкий уровень ЛИФ в середину секреторной фазы по сравнению со здоровыми женщинами [70].
Одновременно с пролиферацией клеток эпителия эстрогены стимулируют развитие секреторного аппарата клетки, а также синтез рецепторов к эстрогенам и прогестерону. Посредством взаимодействия с рецеторами и осуществляется многостороннее действие гормонов на клетки [30, 107].
Семейство стероидных рецепторов - класс белков, функционирующих в основном на ядерном уровне. По своей сути они являются белками, регулирующими транскрипцию. Стероидные рецепторы в отсутствие лигандов находятся в комплексе с белками теплового шока hsp90. При связывании с гормоном происходит активация рецепторов и диссоциация комплекса белок-рецептор и димеризации рецептора. Димер обладает способностью связываться со строго специфичными для стероидов последовательностями ядерной ДНК, что обеспечивает избирательность в отношении каждого из них и влияние на транскрипцию генов - мишеней [92].
Гинекологическое обследование пациенток
Использование физического фактора в рамках подготовки пациенток к программе ЭКО целесообразно у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и указанием на наличие перенесенных воспалительных заболеваний эндометрия в сочетании с нарушениями маточной гемодинамики. Лечебный эффект физического фактора определяется сочетанием развивающихся под его действием взаимосвязанных процессов. Вероятность их формирования и возникновения определяется: особенностями распределения энергии физического фактора во времени и пространстве; физическими свойствами тканей «мишеней», которые определяют поглощение энергии данного физического фактора; избирательной чувствительностью к данному физическому фактору, определяющий низкие пороги его сенсорного восприятия; функциональными резервами адаптации и реактивности организма [2].
В последние годы в клинике используется электроимпульсная терапия с помощью аппаратно-програмного комплекса «Андро-Гин» в режиме электростимуляции. Значительное возрастание интенсивности кровотока в сосудистом бассейне малого таза на фоне терапии позволяет связать клинический эффект с положительным влиянием электроимпульсной терапии на регионарное кровообращение [39]. Улучшение эхоструктуры эндометрия, повышение частоты наступления беременности у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, выраженный дефиброзирующий эффект на фоне лечения позволяют использовать данный фактор для восстановления репродуктивной функции, а также для подготовки эндометрия к программе ЭКО и ПЭ [26]. Состояние эпителия, эпителиально-стромальные взаимодействия определяют функционирование эндометрия. При хроническом эндометрите эндотелиоциты, которые являются секреторными клетками и имеют существенное значение в межклеточных взаимодействиях, происходит нарушение между стромой и покровным эпителием, что способствует хронизации процесса [13, 19]. Изменения наблюдаемые при хроническом эндометрите, в том числе и склеротические изменения эндометрия, влияют на процессы ремоделирования внеклеточного матрикса в течение менструального цикла и в процессе децидуализации, что имеет принципиальное значение в становлении и нормальном протекании беременности [9, 40, 41].
По данным разных авторов, воспалительные изменения в эндометрии у больных с трубным фактором бесплодия встречаются с частотой от 13,8% до 73,1% [11, 32].
Исследования, проведенные В.С. Корсаком и соавторами [17] при изучении результатов гистологического и микробиологического исследований материала полости матки у пациенток с трубным фактором бесплодия и неудачными попытками ЭКО в анамнезе, показали, что патология, потребовавшая этиопатогенетического лечения, выявляется у 77,5% пациенток. При этом хронический эндометрит и последствия перенесенного эндометрита в виде фиброза стромы были обнаружены у 67,7%.
По сообщениям В.М. Стругацкого [39] всем больным с трубно-перитонеальным бесплодием присущи нарушения гемодинамики в сосудистом бассейне малого таза, прогрессирующие по мере увеличения длительности заболевания.
Хронические воспалительные заболевания внутренних органов приводит к серьезным нарушениям в регионарной сосудистой системе, проявляющимся нарушением притока артериальной крови, резким снижением общего кровенаполнения органов и интенсивности кровоснабжения тканей, нарастанием венозного застоя, а значит – ухудшением снабжения тканей кислородом и нарушением обменных процессов. Чем тяжелее протекает воспалительный процесс, тем значительнее нарушения, как в самой сосудистой системе, так и в окружающих тканях, что препятствует удовлетворительному кровоснабжению половых органов и приводит к глубоким нарушениям их функции, в том числе генеративной [2, 18].
По данным литературы [3, 24] для удачной имплантации необходима адекватная перфузия матки и эндометрия, а у пациенток с нарушением репродуктивной функции отмечается высокая частота изменений гемодинамики в сосудах матки.
В исследованиях В.М. Стругацкого [40] доказано нарушение кровообращения в сосудистом бассейне малого таза у больных с хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также необходимость включения импульсной электротерапии (ИЭ) в комплекс лечебных мероприятий с целью улучшения регионарного кровообращения у данной группы больных. Также выявлено повышение эффективности программы ЭКО и ПЭ при использовании ИЭ у пациенток с хроническим эндометритом.
По данным литературы у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия был выявлен определенный параллелизм между хорошими результатами лечения и улучшением гемодинамических показателей в сосудистом бассейне малого таза при применении аппаратно-програмного комплекса «Андро-Гин», что позволяет связать достигнутый клинический эффект с положительным влиянием физиотерапии на регионарное кровообращение. Выявленная зависимость позволяет прогнозировать эффективность применения физических факторов для восстановления репродуктивной функции [2, 36].
Результаты клинико-лабораторного обследования
Трансвагинальную пункцию яичников (ТВП) производили в амбулаторных условиях под внутривенным общим наркозом. Использовали трансвагинальный датчик ультразвукового аппарата «Bruel & Kjaer» (Дания), снабженный адаптером для прикрепления пункционной иглы, который плотно фиксировался к датчику. Пункцию производили в асептических условиях под контролем УЗ-картины.
С помощью вакуум-аспиратора под давлением 130-160 мм водн. ст. фолликулярная жидкость поступала в стерильные пробирки, в которых находилось 0,5 мл гепарина. Полученную фолликулярную жидкость передавали эмбриологу для идентификации ооцитов и последующего их оплодотворения.
Полученные ооциты, помещали в среду для отмывки содержащую HEPES-буфер, а затем отмывали в культуральной среде. Сразу после помещения ооцитов в среду для культивирования оценивали количество, качество и степень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus.
Оплодот ворение ооцитов осуществляли в стандартных условиях методами ЭКО либо ИКСИ. Полученные преовуляторные ооциты культивировались эмбриологами в специальных термостатах при температуре 37 градусов Цельсия при 5% СО2 в воздухе в стерильной питательной среде – Менезо В2. Сперму мужа подвергали центрифугированию, флотированию и обработке в специальной среде. Через 4-5 часов после ТВП, проводилось оплодотворение полученных ооцитов. Для этого в лунки с ними добавляли надосадочную жидкость со всплывшими сперматозоидами до достижения ими концентрации не менее 100000 активно подвижных сперматозоидов на один ооцит.
Оценку оплодотворения проводили по наличию мужского и женского пронуклеуса в ооците. Пронуклеосы видны в ооците при наблюдении в стереомикроскоп с 80-кратным увеличением. Они появляются, как правило, через 10-16 часов после добавления сперматозоидов в среду с ооцитами и исчезают через 6-8 часов после появления. Если присутствуют оба пронуклеуса, оплодотворение считается нормальным. Если их не удается обнаружить -оплодотворение не состоялось. Если виден один пронуклеус или больше двух -произошло аномальное оплодотворение.
L. Scott и S. Smith (1998) предложили систему оценки критериев зигот на стадии пронуклеусов для определения оптимального потенциала имплантации. Данная классификация определяется как «corrected embryo score» (CS) и представляет собой накопительную систему баллов, основанную на следующих критериях: соприкасаемость / несоприкасаемость пронуклеусов; равный/неравный размер пронуклеусов; выровненные/рассеянные нуклеоли в пронуклеусах; гомогенная/негомогенная цитоплазма. В ходе исследований была выявлена прямая зависимость между величиной CS и исходом лечения бесплодия методом ЭКО, что доказывает эффективность учета пронуклеарной морфологии. Впоследствии накопительная система баллов CS была модернизирована в две системы оценки морфологии пронуклеусов -начальная система оценки зигот и ревизионная система оценки зигот. Начальная система оценки зигот классифицирует пронуклеусы на 5 категорий:
Культивирование эмбрионов и оценка их качества, все манипуляции с половыми клетками и эмбрионами человека проводили на средах фирмы «COOK» (Австралия). Оплодотворение проходило в среде Fertilization medium (Sydney IVF), COOK, R-SIFM-20. На стадии пронуклеусов зиготы помещали в среду Cleavage medium (Sydney IVF) K-SIFM-20 и культивировали индивидуально. На 3-и сутки культивирования эмбрионы переносили в среду Blastocyst medium (Sydney IVF) K-SIBM-20, в которой их культивировали до стадии бластоцисты. Качество эмбрионов оценивали перед каждым переносом.
Перенос эмбрионов осуществляли на 3 и 5 сутки культивирования в два этапа. Выбор дня переноса определялся общим состоянием пациентки (отсутствие синдрома гиперстимуляции яичников средней и тяжелой степени) и эмбриологическими характеристиками (количеством эмбрионов на 3-и сутки культивирования) [92].
Начальная система оценки зигот используется в комбинации с системой оценки качества эмбрионов на третьи сутки культивирования, в которой эмбрионы разделяются на 5 категорий согласно классификации L.Scott (2000):
или большая часть эмбриона в виде фрагментов, или бластомеры мультинуклеированы.
Градация эмбрионов по зрелости является условной и различается в разных лабораториях. В ее основе лежит характер фрагментации эмбриона, форма, размер и количество бластомеров. В нашей работе зрелыми считались эмбрионы, на 2-е сутки развития, достигшие стадии 4-х и более бластомеров (48 часов после ТВП), на 3-е сутки 6-ти и более бластомеров. Зрелые дробящиеся эмбрионы имели не более 10 % фрагментации. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты оценивались согласно классификации D. Gardner (1999).
Стадия развития и величина бластоцисты: 0 - эмбрион не достиг стадии бластоцисты; 1 - Ранняя бластоциста, полость 50%/об; 2 - ранняя бластоциста, полость 50-80%/объема; 3 - полная бластоциста, большая полость; 4 -расширенная (expanded) бластоциста; 5 - выходящая (hatching) бластоциста; 6 -вышедшая (hatched) бластоциста.
Показатели контролируемой индукции овуляции, анализа эякулята и эмбриологического этапа программы ЭКО
По данным европейского соглашения по ЭКО-мониторингу (The European IVF-monitoring programme - EIM) при европейском сообществе репродукции человека и эмбриологии (The European Society of Human Reproduction and Embryology - ESHRE), частота наступления беременности в программе ЭКО в среднем составляет 28,4%, а при сочетанных гинекологических патологиях значительно снижается [199].
Данные литературы, обобщающие клиническую эффективность лечения больных с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, свидетельствуют, что метод ЭКО является наиболее перспективным для реализации репродуктивной функции у пациенток с выраженными изменениями маточных труб [12].
Наибольший удельный вес (до 60-70%) в структуре женского бесплодия принадлежит трубно-перитонеальному фактору. Причины возникновения бесплодия трубного происхождения могут быть самыми различными: воспалительные процессы, послеоперационная травма, спаечный процесс малого таза, эндометриоз [8]. Степень поражения маточных труб зависит от длительности патологического процесса и от индивидуальных реакций организма на повреждение [4].
По данным В.А. Бурлева [4] важным патогенетическим звеном хронического рецидивирующего сальпингоофорита у женщин репродуктивного возраста является воспалительный стресс. Воспалительно-ангиогенный стресс, или ответная реакция брюшины на различные раздражители составляет основу патологического процесса, приводящего к образованию спаек [22]. Известно так же, что хронический эндометрит в большинстве клинических случаев сочетается с хроническим рецидивирующим сальпингоофоритом и является составной частью хронических воспалительных заболеваний женской репродуктивной системы. Ангиогенез на фоне воспаления и, следовательно, репаративные процессы на фоне хронического воспаления приобретают черты патологической регенерации. При распространенном повреждении сосудистых терминалей при хроническом эндометрите происходит нарушение баланса капилляров и мелких сосудов (артериол и венул), что приводит к тканевой гипоксии и дисбалансу ангиогенных факторов. Такое нарушение регуляторных механизмов вызывает неполноценную трансформацию слизистой матки в течение менструального цикла, что ведет к снижению условий успешной имплантации [5, 7, 31, 35, 37].
Повышение эффективности метода ЭКО невозможно без изучения механизмов регуляции имплантации. Успех имплантации зависит от двух важных факторов: качества эмбрионов и эндометриальной рецептивности, которые ответственны за эмбрионально-материнское взаимодействие, необходимое для прикрепления и инвазии бластоцисты в эндометрий. Нарушение рецептивности эндометрия – одна из главных причин неудач ВРТ [29].
Одними из ведущих факторов, обуславливающих нарушения рецептивности эндометрия, являются воспалительные заболевания нижнего отдела полового тракта, хронический сальпингоофорит, врачебные манипуляции [42, 114].
В соответствии с поставленными целью и задачами нами были обследованы 120 пациенток с бесплодием трубного происхождения, обусловленное отсутствием маточных труб по поводу внематочных беременностей или окклюзией маточных труб в связи с воспалительными заболеваниями органов малого таза, а также после оперативных вмешательств на маточных трубах, что соответствовало 1-4 степени спаечного процесса [111].
Для решения поставленных задач работа была выполнена в два этапа. На первом этапе перед проведением цикла ЭКО проводили оценку состояния эндометрия в фазу «окна имплантации» путем определения маркеров «окна имплантации» в сыворотке крови и эндометрии. В результате были разработаны критерии наступления беременности. На втором этапе исследования с учетом полученных данных была набрана группа больных, которым было проведена программа ЭКО на фоне прегравидарной подготовки эндометрия.
На первом этапе исследования был проведен анализ клинико-анамнестической характеристики у пациенток внутри 1 и 2 группы в зависимости от наступления и ненаступления беременности в программе ЭКО, который показал отсутствие достоверных статистических отличий между подгруппами по всему спектру изученных показателей.
Проведенное исследование выявило высокую частоту серопозитивных пациенток к инфекциям TORCH-комплекса. Наиболее значимым показателем инфицированности явилась краснуха, доля которой в группах составила 44 (75,9%) и 30 (88,2%) случаев соответственно. Второе место заняли цитомегаловирус и вирус простого герпеса, частота которых в 1 и 2 группе составила 34 (58,6%), 18 (52,9%) и 28 (48,3%), 22 (64,7%) случаев соответственно. Полученные данные подтверждают роль инфекционного фактора в формировании бесплодия трубного происхождения.
Анализ объема гинекологических оперативных вмешательств у пациенток 1 и 2 группы с бесплодием трубного происхождения и с сопутствующей гинекологической патологией показал, что оперативные вмешательства проводились всем 92 пациенткам. В связи с патологическими изменениями органов малого таза (гидросальпинксы, сактосальпинксы), а также наступлением внематочной беременности, были проведены радикальные операции на придатках матки у пациенток обеих групп. Односторонняя тубэктомия проводилась у 8 (13,8%) из 58 женщин в 1 группе и у 2 (5,9%) из 34 женщин во 2 группе. Двухсторонняя тубэктомия проводилась у 18 (31%) из 58 женщин в 1 группе и у 8 (23,5%) из 34 женщин во 2 группе. Достоверных отличий между группами не выявлено.