Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Выбор триггера овуляции для оптимизации программ ЭКО (обзор литературы) 10
1.1 Агонист гонадотропин-рилизинг гормона, как альтернатива использованию хорионического гонадотропина человека 10
1.2 Критерии развития СГЯ 17
1.3 Профиль гормонов после введения аГнРГ для финального дозревания ооцитов 19
1.4 Репродуктивные исходы программ ЭКО с использованием аГнРГ 26
1.5 Возможности прогнозирования результатов ВРТ 30
Глава 2.Материалы и методы исследования 41
2.1Материал исследования 41
2.2 Методы исследования 44
2.2.1 Общие клинические методы исследования 45
2.2.2 Лабораторные методы 46
2.2.3 Ультразвуковое исследование органов малого таза 49
2.2.4 Специальные методы исследования 50
2.2.5 Программа ЭКО 53
2.2.6Диагностика развития СГЯ 58
2.2.7 Статистический анализ полученных данных 58
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1 Результаты клинического и лабораторного обследования пациенток 59
3.2 Анализ параметров индуцированного цикла у обследованных пациенток 70
3.3 Гормональный профиль в период стимуляции функции яичников 71
3.4 Характеристика оогенеза и раннего эмбриогенеза 72
3.5 Оценка частоты развития СГЯ 75
3.6 Сравнительная характеристика результатов лабораторных исследований 77
3.7 Оценка исходов программы ЭКО 79
3.8 Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках 80
Глава 4.Обсуждение полученных результатов 87
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список сокращений 104
Список литературы 107
- Агонист гонадотропин-рилизинг гормона, как альтернатива использованию хорионического гонадотропина человека
- Программа ЭКО
- Результаты клинического и лабораторного обследования пациенток
- Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках
Агонист гонадотропин-рилизинг гормона, как альтернатива использованию хорионического гонадотропина человека
Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) в настоящее время является ведущим методом лечения бесплодия. Высокая эффективность программы ЭКО обусловлена получением нескольких зрелых ооцитов, вследствие стимуляции суперовуляции. Завершая стимуляцию функции яичников гонадотропинами, для финального созревания ооцитов вводится триггер овуляции. В качестве триггера овуляции используются два гормона: хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) либо агонист гонадотропин-рилизинг-гормона (аГнРГ).
С момента появления в начале 1960-х годов ХГЧ начали использовать для окончательного созревания фолликулов. Длительное время ХГЧ использовался в качестве суррогата лютеинизирующего гормона (ЛГ). Гомологичность альфа субъединиц ХГЧ и ЛГ, а также схожесть их бета-субъединиц на 85 %, позволяет ХГЧ связываться с рецепторами ЛГ и активизировать их [27,185]. Имеются существенные отличия между периодом полураспада ЛГ и ХГЧ: период полураспада ЛГ составляет приблизительно 60 минут, у ХГЧ он более 24 часов [129]. Кроме того, полностью отсутствует подъем уровня ФСГ, характерный для середины естественного менструального цикла [110]. Для ХГЧ характерен более длительный период полураспада в крови, что приводит к пролонгированному лютеотропному эффекту и влечет за собой развитие большого количества желтых тел и значимое повышение концентрацийэстрадиола [81]и прогестерона.
Указанные изменения могут негативно сказаться на качестве ооцитов и характеристиках эндометрия, в том числе из-за высвобождения вазоактивных веществ, в первую очередь СЭФР (сосудисто-эндотелиального фактора роста) [12,13,158,182].
Практически полное устранение рисков формирования раннего синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) является одним из основных преимуществ использования аГнРГ в качестве триггера овуляции. В основе данного эффекта может лежать недостаточность индуцированной волны ЛГ, в свою очередь, приводящей к снижению функциональной активности желтого тела [45,181,190].
На сегодняшний день основным путем к так называемой клинике, свободной от СГЯ (OHSS free clinic), является программа ЭКО в рамках протокола с антГнРГ с последующей заменой триггера овуляции на аГнРГ, с дальнейшей криоконсервацией эмбрионов и переносом в криопротокол [66,135].
Проведение программ ЭКО в протоколах с аГнРГ исключало возможность использования аГнРГ для финального дозревания ооцитов [79,11184,]. Но, уже в 1990-х годах, когда на фармацевтическом рынке был представлен антагонист ГнРГ третьего поколения для использования в протоколах стимуляции функции яичников, применение аГнРГ в качестве альтернативы ХГЧ для финального созревания ооцитов стало возможным [51,186].
Препараты аГнРГ были первоначально разработаны, с учетом высокого сродства к рецепторам ГнРГ. АГнРГ вытесняет антагонист ГнРГ в гипофизе, активируя рецептор ГнРГ, в результате чего происходит выброс гонадотропина, аналогичный подъему в середине естественного цикла [2,39].
Несмотря на то, что индуцированная волна гонадотропинов эффективно стимулирует овуляцию и созревание ооцитов, имеются различия в отношении продолжительности и профиля волны ЛГ в естественном цикле и при замене триггера овуляции [129,203]. Так индуцированная волна ЛГ состоит из короткого восходящей волны (примерно 4 часа) и более длинной нисходящей волны (примерно 20 часов), суммарно - 24-36 часов. В отличие от индуцированного цикла естественный цикл характеризуется тремя фазами: восходящим коленом продолжительностью 14 ч, плато 14ч и нисходящим коленом 20 часов, в общей сложности 48 часов [110].
Таким образом, общее количество гонадотропинов, выделяемых при введении в качестве триггера овуляцииаГнРГ, значительно ниже по сравнению с естественным циклом, что играет ключевую роль в инициации лютеолиза желтых тел и снижении риска развития СГЯ.
В 1991 году D.A. Imoedemhe и соавт. изучили результаты замены триггера овуляции у 38 пациенток с высоким риском развития СГЯ, у которых уровень эстрадиола был более 4000 пг/мл, и не было зарегистрировано ни одного случая СГЯ [20].
В 1996г.N. Lewit с соавт. проанализировали замену триггера овуляции у женщин с высоким риском развития СГЯ. Анализ был осуществлен у 16 женщин, у которых ранее имели место случаи тяжелого СГЯ. Развития случаев СГЯ при замене триггера овуляции не отмечалось [53].
Сравнение эффективности аГнРГ у пациенток с СПКЯ и без такового диагноза проводилось K. E. O Neill и соавторами в 2015. Не было выявлено отличий в общем количестве ооцитов, или проценте зрелых ооцитов. Не имелось различий в частоте наступления беременности между группами. Не отмечалось разницы между женщинами без СПКЯ (исключая реципиентов донорской яйцеклетки) и женщинам с СПКЯ в отношении уровня имплантации (медиана 50% interquartile range [IQR, 30%–100%] против. 50% [IQR, 50%–100%]; P=0,76, клинической беременности (33% против. 40%, P=0,50), и уровнем живорождения (30%против 33%, P=0,78) в анализах без корректировки и после корректировки по возрасту, ИМТ и паритету (P=0,37, 0,92, и 0,83, соотв.). Ни у одной пациентки из обеих групп не выявлено раннего или позднего развития СГЯ. Пациенткам без овариального ответа в последующем было введено 10 000 МЕ ХГЧ с целью дозревания ооцитов, что привело кразвитию тяжелого СГЯ, требующего госпитализации[154].
Введение ХГЧ в день назначения триггера овуляции (двойного триггера) или после трансвагинальной пункции яичников позволяет осуществлять поддержку лютеиновой фазы при замене триггера, в результате чего репродуктивные исходы сопоставимы с таковыми при применении ХГЧ в качестве триггера овуляции [50,102,168]. У пациенток с высоким риском его развития частота СГЯ снижается [59,172].
По данным работы Мартазановой Б.А. и соавт. выявлена высокая частота развития СГЯ у пациенток с высоким овариальным резервом после применения двойного триггера. В то же время как использование аГнРГ для финального созревания ооцитов и последующего введенияХГЧ в день ТВП эффективно снизило частоту развития СГЯ, особенно его ранних форм [8,13].
M. A. Youssef и соавт. в рамках Кохрановского обзора (2014г.) проанализировали частоту развития СГЯ и ранних репродуктивных потерь в 17 контролируемых рандомизированных исследованиях (n=1847), из которых 4 исследования проводились в программах донор-реципиент [108]. Не было обнаружено достоверных различий по частоте развития СГЯ при использовании аГнРГ и ХГЧ у пациенток с низким риском развития СГЯ (OR 0,79). У пациенток с высоким риском развития СГЯ подобные отличия были существенны (OR 0,06). Авторы отметили, что частота ранних репродуктивных потерь была выше при замене триггера на аГнРГ (OR - 1,74).
В 2013 году Р. Humaidan и соавторы провели двойное проспективное многоцентровое рандомизированное исследование по исследованию замены триггера овуляции у пациенток как с нормальным ответом яичников, так и у женщин с высоким риском развития СГЯ [102]. Исследование включало 390 женщин, в программах ЭКО/ИКСИ и состояло из двух РКИ, в одном исследовании, включались пациенты с высоким, а в другом - с низким риском развития СГЯ. В группе с высоким риском СГЯ в качестве триггера овуляции применялся либо аГнРГ с последующим введением 1500 МЕ ХГЧ (n = 60), либо 5000 МЕ ХГЧ (n = 58). Подобным образом, женщины с низким риском СГЯ были распределены на группу женщин, которым в качестве триггера овуляции применялся аГнРГ с последующим введением ХГЧ по 1500 МЕ в день забора ооцитов и на 5 день после дня забора ооцитов (n = 125) или однократным введением 5000 МЕ ХГ (n = 141). В качестве поддержки лютеиновой фазы применяли стандартные схемы с прогестероном и эстрадиолом. Ни у одной из пациенток из группы с высокого риска, у которых в качестве триггера овуляции был использован аГнРГ, не было случая развития СГЯ, несмотря на дополнительное введение 1500 МЕ ХГЧ, по сравнению с частотой 3,4% в той же группе, у пациенток, у которых в качестве триггера был введен ХГЧ.
Программа ЭКО
Для стимуляции функции яичников в программе ЭКО/ИКСИбыл использованпротокол с антагонистами ГнРГ. Для стимуляции яичников были использованы препараты рекомбинантного ФСГ и/или очищенного чМГсо 2 – 3 дня менструального цикла в дозах 112,5МЕ – 300МЕ, подобранных индивидуально в зависимости отвозраста, массы тела, числа антральных фолликулов, АМГ и предполагающих получение не больше 19 ооцитов. Динамика роста фолликулов оценивалась с помощью УЗ-мониторинга и при необходимости, производилась коррекция дозы препарата в соответствии с ответом яичников на стимуляцию.
Препарат антГнРГ(цетрореликс) в дозе 0,25 мг/сутки вводился подкожно при достижении лидирующим фолликулом размера 14 мм в диаметреили несколькими фолликулами 12-13 мм с целью предупреждения преждевременной лютеинизации фолликулови его введение продолжалось вплоть до дня введения триггера овуляции.
Триггер овуляции вводился по достижении, по меньшей мере, 3 фолликулами диаметра 17 – 18 мм. В качестве триггера овуляции были использованы: 1) препараты хорионического гонадотропина человека в дозе 10 000 МЕ однократно или 2) агонист ГнРГ (трипторелин 0,2 мг) однократно болюсно. В случае использования в качестве триггера овуляции агониста ГнРГ для поддержания нормальной функции желтых тел и формирования рецептивного эндометрия однократно в день ТВП вводился ХГЧ в дозе 1 500 МЕ.
Трансвагинальная пункция фолликулов производилась через 35-36 часов после введения триггера овуляции под внутривенной анестезией приУЗ-контролем в асептических условиях с использованием одноразовой пункционной иглы 19G (Swemed, Sweden или Kitazato, Japan). Аспирированная фолликулярная жидкость помещалась в стерильные пробирки, после чего незамедлительно передавалась эмбриологу для идентификации ооцит-кумулюсного комплекса, оценки степени зрелости полученных ооцитов, оплодотворение ооцитов и культивирования эмбрионов.
Оплодотворение invitro
После аспирации ооциты находились культуре при температуре 37С и 6% CО2. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов до 3-5-х суток производили с использованием сред производства Origio (Дания).
Приотсутствие отклонений вспермограмме по критериям ВОЗ проводилось классическое ЭКО. Преовуляторные МII ооциты оплодотворяли спермой мужапутем инсеминации invitro. Каждый ооцит переносился в планшет, содержащий около 150 000 подвижных сперматозоидов на лунку. Методику ИКСИ применяли по показаниям, связанным с состоянием спермы и во всехслучаях, когда проводили оценку клеток кумулюса. Наличие двух пронуклеусов через 16-18ч после инсеминации или ИКСИ расценивали как нормальное оплодотворение. Оплодотворение считали аномальным при определении одного или более двух пронуклеусов, а при отсутствии двух пронуклеусов – несостоявшимся. Качество эмбрионов оценивалось через 44-48ч после ТВП.
Оценка морфологии и зрелости полученных ооцитов
Оценку зрелости полученных ооцитов в циклах ВРТ проводили перед проведением процедуры оплодотворения. Полученные ооциты оценивались в эмбриологическом блоке 1-го гинекологического отделения по следующей шкале:
GV- (germinal vesicle stage) незрелый диплоидный ооцит. Визуализируется ядро, полярное тельце нет. Клетки кумулюса вокруг ооцита сформировано плотно.
MI- незрелый ооцит на стадии метафазы первого деления мейоза. Ядро и полярное тельце не визуализируется. Клетки corona radiata плотно примыкают к ооциту, кумулюсные клетки незначительно увеличился.
MII- Зрелый ооцит на стадии метафазы второго деления мейоза. Визуализируется одно полярное тельце, ядро отсутствует. Клeтки corona radiate расходятся лучами от ooцитa. Клетки кумулюса увеличиваются в объеме и имеют клеточную структуру.
Дегенеративный ооцит – ооцит окружен незначительным количеством гранулезных клеток, кумулюсные клетки практически отсутствуют.
Оплодотворение проводилось при нормозооспермии путем инсеминации и при патозооспермии посредством ИКСИ. Оценку качества эмбрионов проводили на разных стадиях развития:
1- Стадия зигота (1-ый сутки развития) - через 16-18 часов, при нормально оплодотворившемся ооците визуализируется 2 четко различимых пронуклеуса (2PN). Ооцит, содержавший 3 и более PN, считался аномально оплодотворившимся.
2- Стaдия дробления эмбриона (2-3 дни после оплодотворения) – на 3-и сутки эмбрионы, без морфологических аномалий получали максимальную оценку в 3,5 балла.
3- Стaдия блacтoциcты (5-й день после оплодотворения). Оценка эмбрионов 5-го дня осуществляется согласно классификации D. K. Gardnerи W.B. Schoolcraft (1999г.) [91].
Стадии развития бластоцисты:
0 - Не бластоциста.
1 - Ранняя бластоциста, бластоцель меньше половины объема бластоцисты.
2 - Ранняя бластоциста: бластоцель больше половины объема всей бластоцисты.
3 - Бластоциста полностью развита, большая бластоцель.
4 –Экспандированная бластоциста - Полость бластоцисты становится больше и начинает истончаться ZP.
5 - Бластоциста, начавшая хетчинг, клетки трофэктодермы начинают проникать через ZP.
6 - Бластоциста, закончившая хетчинг и полностью вышедшая из ZP.
Внутриклеточная Масса (ВКМ):
A – Компактно-упакованные с большим количеством клеток.
B – Более свободно сгруппированное среднее количество клеток.
C -Незначительное количество клеток.
Трофэктодерма (ТФЭ):
A - Много клеток с регулярным строением. B - Немного клеток, нерегулярное строение C - незначительное количество клеток.
Перенос эмбрионов в полость матки
На 3 или 5 сутки после культивирования производился перенос 1 или 2 эмбрионов в полость матки с помощью «мягкого» катетера Wallace или Cook под ультразвуковым контролем. Число переносимых эмбрионов выбирали индивидуально, в зависимости от клинической ситуации, но оно не превышало 2-х. Оставшиеся эмбрионы были криоконсервированы.
Криоконсервация оставшихся эмбрионов, пригодных для переноса в полость матки, производилась методом витрификации на 3 или 5/6 сутки развития с использованием систем Cryotech/Cryotop (Japan). Эти эмбрионы использовались позднее в криоциклах на фоне подготовки эндометрия эстрадиолом/микронизированным прогестероном по схеме, применяемой в 1 –ом гинекологическом отделении ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова» Минздрава России.
Поддержка посттрансферного периода и диагностика наступления беременности.
Поддержка посттрансферного периода производилась с использованием микронизированного прогестерона (Утрожестан) в дозе 600 мг (Besins, Франция) интравагинально со следующего дня после ТВП, а в случае применения в качестве триггера овуляции а-ГнРГ в сочетании с эстрадиолавалератом(Progynova; Schering, Германия), 4 мг/сутки со следующего дня после ТВП.
Тестна беременность (-субъединица ХГЧ в крови) осуществляли через 14 дней после переноса эмбрионов. Результат считали положительным при концентрации -ХГЧ в сыворотке крови 20 МЕ/л (биохимическая беременность). На 21й день после переноса эмбрионов проводилась ультразвуковое исследование с целью визуализации плодного яйца в полости матки. Детекция сердцебиений плода при УЗИ проводилась в 5-6 недель беременности (констатация клинической беременности).
Результаты клинического и лабораторного обследования пациенток
Соответственно цели и задачам исследования, был проведен проспективный анализ клинико-анамнестических данных 250 пациенток, обратившихся с целью проведения программы ЭКО и ПЭ в связи с бесплодием.
У всех пациенток тип телосложения соответствовал женскому, имелись правильно развитые вторичные половые признаки.
Возраст пациенток варьировал от 21 до 39 лет и статистически не отличался между группами (P 0,05): Средний возраст женщин I группысоставил - 31,5±3,6 года, II группы – 30,7±3,7 лет.
Средние показатели ИМТ в двух исследуемых групп находились в пределах нормы и составили 22,6±3,3 во I группе и во II группе – 22,2±2,9 (P 0,05). В I группе дефицит массы тела (ИМТ20%) зарегистрирован у 27(21,6%) пациенток, у 72 (57,6%) ИМТ соответствовал нормальным значениям (25,0 ИМТ 20,0), у 26 (20,8%) - наблюдался избыток массы тела (ИМТ25,0).
Во II группе у 25 (20%) пациенток зарегистрирован дефицит массы тела, у 79(66,4%) ИМТ соответствовал нормальным значениям, у 17 (13,6%) пациенток наблюдался избыток массы тела.
Статистически значимых различий при анализе наследственной отягощенности пациенток между группами не выявлено. Родственники 11 (8,8%) пациентки I группы страдали заболеваниями эндокринной системы (сахарный диабет II типа), родственники 8 (6,4%) пациенток - заболеваниями сердечнососудистой системы, у родственников 11 (8,8%) пациенток имели место онкологические заболевания.
Во II группе у родственников 12 (9,6%) пациенток зарегистрированы эндокринные заболевания (сахарный диабет II типа), у родственников 7(5,6%) пациенток – заболевания сердечно-сосудистой системы, у родственников 16 (12,8%) пациенток – онкологические заболевания.
К моменту вступления в программу ЭКО, у всех пациентокотмечался регулярный менструальный цикл. Возраст менархе, длительность менструального цикла и продолжительность менструального кровотечения статистически не различались между группами (P 0,05). Возраст менархе исследуемых пациенток варьировал от 10 до 16 лет и в среднем составил 13,07 ± 0,95 лет и 13,06 ± 0,99 лет в группах соответственно. Продолжительность менструального цикла в среднем составила 28,66 ± 2,16 дня в I группе и 28,98 ± 3,34 дня – во второй. Длительность менструального кровотечения составила от 3 до 8 дней, средняя длительность кровотечения – 4,98 ± 0,98 день и 4,95 ± 1,11 дня.
Перенесенные заболевания: В ходе анализа инфекционной заболеваемости установлено, что в детском и подростковом возрасте 69,6% пациенток I группы и 72,8 % пациенток II группы, перенесли детские инфекции (ОРЗ, грипп, ветряная оспа, краснуха, ангина, корь, эпидемический паротит) с частотой, соответствующей средне-популяционным данным. В структуре перенесенных экстрагенитальных заболеваний, преобладали хронические заболевания мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит) и желудочно-кишечного тракта (хронический гастрит). По представленным данным соматической заболеваемости, у наблюдаемых пациентокне было выявлено статистически значимых различий (табл. №. 6.) Все перечисленные заболевания были в стадии стойкой ремиссии или медикаментозной компенсации и не являлись противопоказанием для проведения стимуляции функции яичников и наступления беременности.
Перенесенные гинекологические заболевания: Исследуемые группы не различались по частоте и структуре гинекологической патологии у пациенток. На ранее перенесенные инфекции передающиеся половым путем (хламидиоз и/или уреаплазмоз) указали 57 женщин (45,6%) первой и 42 женщин (33,6%) второй группы. Доброкачественные фоновые заболевания шейки матки выявлены у 15,2% и 20% пациенток обследуемых групп, соответственно. Наружный генитальный эндометриоз диагностирован у 13 пациенток (10,4%) I группы и 14 пациенток (11,2%) II группы. Доля пациенток, перенёсших хронический сальпингоофорит в I группе, составила 17,6 %, во II группе – 20%. Интерстициальная или субсерозная миома матки менее 5 см имелась у 5,6 % и 6,4% пациенток в I и II групп соответственно.
Перенесенные оперативные вмешательства: Аппендэктомию перенесли 13 пациенток (10,4%) и 10 пациенток (8%) в обследуемых группах, лапаратомию 21 (16,8%) и 18 (14,4%) пациенток. Гистероскопия с раздельным диагностическим выскабливанием слизистой тела матки и цервикального канала была выполнена у 49 (39,2%) и 38 (30,4%) пациенток. Наиболее частым хирургическим вмешательством явились лапароскопии: у 57 (45,6%) и 60 (48%) пациенток. Самыми частыми объемами лапароскопий оказались тубэктомия 37 (29,6%) и 28 (22,4%) и сальпингоовариолизис 23(18,4%) и 20 (16,0%) по поводу внематочной беременности или тубоовариального образования. Оперативные вмешательства на яичниках имелись в анамнезе у 17 (13,6%) и 19 (15,2%) пациентокв группах, соответственно. Консервативная миомэктомия выполнена у 3 (2,4%) и 7 (5,6 %) женщин.
Длительность бесплодия варьировала от 1 до 16 лети статистически значимо не различалась. Она составила в среднем 6, 24±3,55 года в I группе и 5,42±3,39 года во II группе. Первичное бесплодие имелось у 68 (54,4%) женщин I группы и у 75 (60%) женщин второй групп. Вторичным бесплодием страдали 57 (45,6%) и 50 (40%) пациенток, соответственно.
Не было выявлено статистически значимых различий между факторами бесплодия исследуемых групп (таб. 9). Основными фактором бесплодия в обеих группах были мужской фактор (39,2% и 44%, соответственно). Структура причины бесплодия у пациенток двух групп представлены на рис. 5. и 6.
Анализ уровня экспрессии мРНК генов в кумулюсных клетках
Согласно полученным данным ряда исследователей, транскрипционный профиль клеток кумулюса может быть использован для прогнозирования качества эмбрионов и исходов программ ВРТ [125,150,169,167]. Клетки кумулюса в процессе фолликулогенеза находятся в метаболическом симбиозе с развивающимся ооцитом, что делает их привлекательными объектом для проведения исследований по сравнению с фолликулярной жидкостью. Поэтому цель нашей работы состояла в исследовании транскрипционного профиля генов, задействованных в регуляции клеточного цикла и пролиферации, ионного гомеостаза, клеточной адгезии и миграции, энергетическом обмене, тканевой дифференцировки, апоптозе и клеточной сигнализации в образцах кумулюса пациенток при использовании различных тригеров овуляции: а-ГнРГ и ХГЧ. Выбор этих генов был обоснован литературными данными об ассоциации уровня экспрессии этих генов в кумулюсных клетках с качеством ооцитов, потенциалом эмбрионов и исходом программ ВРТ [28,29,31,55, 101,116,132,150,167,187].
Для анализа были отобраны 179 кумулюс-ооцитарных комплексов. Образцы клеток были разделены соответственно на 2 группы в зависимости от использованного триггера овуляции.
Группу 1 составили 86 кумулюс-ооцитарных комплекса, полученных от 17 пациенток, при использовании в качестве триггера овуляции хорионического гонадотропина. Группу 2 составили 93 кумулюс-ооцитарных комплекса, полученных от 18 пациенток, при использовании в качестве триггера овуляции агониста ГнРГ.
При анализе результатов экспрессии мРНК исследуемых генов в кумулюсных клетках в двух группах получены достоверные различия в уровне экспрессии 4 из 13 генов: CALM2, ALCAM, PFKP и TRPM7 (табл.22). В группе с использованием агониста ГнРГ в качестве триггера, было выявлено повышение уровня экспрессии мРНК генов ALCAM и PFKP в 1,4 раза. В тоже время уровень экспрессии мРНК генов CALM2 и TRPM7 был снижен в 1,6 и 1,2 раза, соответственно, по сравнению с образцами кумулюсных клеток, полученных при использовании ХГЧ в качестве триггера овуляции.Различия в экспрессии генов кумулусными клетками в группах триггеров аГнРГ и ХГЧ были выявлены среди генов CALM2 (0,08 vs 0,05; P 0.0001), TRPM7 (0,82 против 0,70; P=0.007), ALCAM (0,26 против 0,37; P=0.0008) и PFKP (3,46 против 4,70; P=0.0005). (Табл. 22).
Относительно генов HAS2 (0,20 против 0,20; P=0,575), PTGS2 (0,81 против vs 1,14; P=0,0741), ITPKA (0,29 против 0,24; P=0,141), GREM1 (0,59 против vs 0,52; P=0,273), SDC4 (0,66 против 0,68; P=0,659), VCAN (12,48 против 13,0; P=0,548), SPSB2 (0,02 против 0,03; P=0,102), TP5313 (0,24 против 0,24; P=0,483) и PGR (0,47 против 0,46; P=785) значимых различий выявлено не было.
Следует отметить, что экспрессия мРНК генов не имела корреляционной связи с уровнем эстрадиола в крови пациенток в день назначения триггера овуляции (P 0,05).
При стратификации образцов в зависимости от формирования бластоцисты получены достоверные различия только для гена TP53I3. Экспрессия мРНК гена TP53I3 была выше в 1,3 раза в клетках кумулюса, из ооцитов которых в дальнейшем были получены бластоцисты по сравнению с кумулюсом, окружающим ооциты, из которых бластоциста не развилась (0,3 против 0,23; P=0,0304).
Таким образом, результаты исследования показали, что экспрессия некоторых генов в группах с различными триггерами овуляции может отличаться. Однако эти различия были менее чем в 2 раза и, возможно, не оказывали существенного влияния на качество полученных ооцитов и эмбрионов.