Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Ранние репродуктивные потери. Эпидемиология. Классификация 11
1.2 Этиопатогенез ранних репродуктивных потерь 15
1.2.1 Генетические причины 15
1.2.2 Иммунопатология наступления и развития беременности 18
1.2.2.1 Аутоиммунные нарушения 18
1.2.2.2 Аллоиммунные нарушения 22
1.3 Патогенетическая роль NK-клеток в ранних репродуктивных потерях 26
1.4 Применение иммуноглобулинов 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1 Материалы исследования 41
2.2 Методы исследования 45
2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования 45
2.2.2 Генетические методы 47
2.2.3 Иммунологические методы 49
2.2.4 Работа in vitro 54
2.2.5 Статистические методы 57
Глава 3. Результаты собственных исследований 59
3.1 Клиническая характеристика женщин с многократными репродуктивными потерями 59
Глава 4. Генетический и иммунологический статус женщин с многократными репродуктивными потерями 68
4.1 Генетические исследования 68
4.2 Иммунологические исследования 77
4.3 Течение настоящей беременности 82
4.4 Терапия при беременности 85
Глава 5. Работа in vitro 89
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 97
Выводы 106
Практические рекомендации 108
Список сокращений 110
Список литературы 112
- Ранние репродуктивные потери. Эпидемиология. Классификация
- Применение иммуноглобулинов
- Клиническая характеристика женщин с многократными репродуктивными потерями
- Работа in vitro
Ранние репродуктивные потери. Эпидемиология. Классификация
Репродуктивные потери, происходящие в естественном цикле и после применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), являются важной медицинской и социальной проблемой. Согласно данным 2018 г. Российской ассоциации репродукции человека, частота инфертильных браков в нашей стране достигает 24% [29]. При этом, частота невынашивания беременности составляет 15-20% [52, 68], в каждом четвертом случае - привычная потеря второй беременности (3-5%) и в каждом десятом - третьей и последующей беременностей (1-2%) [74, 218].
По мнению современных авторов, различия между бесплодием и невынашиванием беременности (НБ) весьма условны - это единый патологический процесс нарушения деторождения различной степени тяжести, обусловленный в каждом отдельном случае индивидуальными причинами: нарушением гаметогенеза, оплодотворения, имплантации или эмбрионального развития [59, 85] (Рисунок 1).
Общепринятое разделение женщин с привычным невынашиванием беременности (ПНБ) и неудачами ЭКО оспаривает факт зафиксированной биохимической беременности, или доклинической беременности. В этом случае положительный тест на беременность говорит о том, что оплодотворение произошло, но процесс имплантации не завершен, и визуализировать эмбрион не удается. В таких случаях пациенты не отвечают критериям диагноза бесплодия, но в то же время, если клиническая беременность не документирована, пациенты не соответствуют и критериям ПНБ. В некоторых странах официально требуется, чтобы беременность документировалась либо данными ультразвукового, либо гистологического исследования. Таким образом, биохимические потери не включаются в предыдущие неудачи [85, 123]. Рисунок 1 - Общие причины развития патологии при бесплодии и невынашивании беременности (Bashiri A. et al., 2016) [85].
Определение уровня хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в протоколах ВРТ на 12-14 день после переноса эмбрионов имеет большое значение [188, 199]. Показано, что уровень ХГЧ в крови женщины может быть предиктором того или иного исхода цикла ВРТ. Критический уровень ХГЧ крови, который считается рубежом в прогнозировании жизнеспособности беременности - 76 МЕ/мл [182, 199].
Многие исследователи пытались определить значение потери биохимической и клинической беременности. Даже неоднократные потери беременности в первом триместре являются положительным фактором прогноза успеха циклов ВРТ, так же отмечено более высокое качество криоконсервированных эмбрионов у таких пациенток [214]. У женщин с потерей биохимической беременности после ВРТ в анамнезе вероятность наступления клинической беременности в следующем цикле выше, по сравнению с теми, у кого тест на беременность был отрицательный [86].
На данный момент не сформулированным остается определение «многократных или повторных неудач ЭКО». Одни авторы в его основу закладывают количество неэффективных циклов ВРТ [93, 158, 194], другие дополняют информацией о количестве и качестве перенесенных эмбрионов [104, 159].
Еще в начале 21 века неудачную попытку ЭКО определяли, как отсутствие беременности после переноса 10 и более эмбрионов в полость матки в одном цикле [159]. В настоящее время стандартной стала политика переноса не более 2х эмбрионов, в зависимости от возраста женщины и качества эмбрионов [70]. Позднее, повторные имплантационные потери определяли, как отсутствие наступления беременности после 3х попыток ЭКО при переносе незамороженных эмбрионов в полость матки [158]. Margalioth с соавт. [159] считают, что этот термин можно применять после 3х циклов ЭКО при условии переноса эмбриона (-ов) хорошего качества. Так же предполагают, что в основе части случаев имплантационных потерь лежат механизмы, сходные с невынашиванием беременности [41].
По результатам систематического обзора, повторные неудачи ЭКО – это отсутствие имплантации, определяемой по уровню ХГЧ в периферической крови на 14 день после переноса эмбрионов после 2 и более последовательных циклов ЭКО, ИКСИ или криопротоколов, когда общее количество эмбрионов не менее 4 (для эмбрионов на стадии дробления) или не менее 2 (для бластоцист), при этом все эмбрионы должны быть хорошего качества и соответствовать стадии дробления [236].
Имеются также некоторые несоответствия и в определении ПНБ. Так, общества акушеров-гинекологов и репродуктологов в Европе определяют ПНБ как последовательную потерю трех и более беременностей до 24 недель [125, 204], в США - 2 потери до 20 недель [112], согласно последним рекомендациям ESHRE – 2 потери до 24 недель [122].
Следует учитывать, что вероятность рождения живого здорового ребенка снижается после каждого следующего случая прерывания беременности. В ретроспективном когортном исследовании с участием 1020 женщин с 2, 3 и более ранними потерями беременности был проведен анализ анамнестических данных, показателей клинико-лабораторного обследования. Показано, что 40% пациенток имели, по крайней мере, один результат, выходящий за пределы нормальных значений. Примечательно, что такие пациентки встречались с одинаковой частотой среди женщин с двумя, тремя или четырьмя и более потерями [161]. Поэтому в Российской Федерации традиционно к ПНБ относят 2 и более прерывания беременности на сроке до 24 недель [31, 52, 53].
В зависимости от акушерского анамнеза выделяют две формы репродуктивных нарушений: первичную и вторичную. Первичное ПНБ – все беременности завершались выкидышами, вторичное – в анамнезе наряду с выкидышами были пролонгированные до 24 недель беременности, завершившиеся рождением живого ребенка [122, 196]. У женщин, страдающих первичным ПНБ, вероятность выкидыша повышается и составляет 40–45% после третьего самопроизвольного прерывания [13, 45, 52]. Установлено, что если потери беременности предшествовали родам, то прогноз для последующей беременности благоприятный, и наоборот, если потери беременности случились после живорождения [202].
Таким образом, до настоящего времени имеющиеся различия в терминологии влияют на частоту репродуктивных потерь в отдельных странах, результаты клинических исследований, формируют различные подходы к протоколам обследования и терапии у данной категории пациентов.
Применение иммуноглобулинов
Несмотря на большой арсенал современных лечебных мероприятий, число женщин с многократными репродуктивными потерями не уменьшается [33, 52, 68]. У данной категории пациентов применение стандартных протоколов обследования и терапии не приводит к положительным результатам. При иммунологическом обследовании у таких пациенток выявляются различные отклонения – наличие антифосфолипидных антител, нарушение баланса цитокинов T – хелперов 1 и 2 типа [166, 126], снижение абсолютного и относительного содержания регуляторных Т лимфоцитов, цитотоксических лимфоцитов [62], усиление экспрессии активационных маркеров на поверхности Т-лимфоцитов периферической крови, а также повышение уровня TNF-, продуцируемого CD4+ T-лимфоцитами [148], повышение количества и цитотоксичности NK-клеток [106], а также нарушение баланса между активирующими и ингибирующими KIR-рецепторами на их поверхности [155]. Показано, что с неудачами ВРТ ассоциируется повышенная экспрессия CD158, а также CD8 и HLA-DR на поверхности лимфоцитов [23]. Описанные нарушения не бывают изолированными, чаще характерны множественные отклонения, что требует комплексной оценки и применения комплекса мер для их коррекции [23, 120].
Учитывая доказанную ассоциацию привычной потери беременности ранних сроков и неудач ВРТ с иммунологическими нарушениями, различные иммуномодулирующие методы терапии изучались у данных пациенток. Применялись следующие группы препаратов: глюкокортикоиды, внутривенные иммуноглобулины (ВИГ), жировые эмульсии (интралипид), прогестерон. Парентеральное применение иммуноглобулина человека впервые стало известно в 1935 году. Внутривенное введение иммуноглобулинов стало возможным благодаря работе Cohn E.J. с коллегами в 1946 году [195]. И лишь в 1981г. в США препарат был впервые лицензирован для продажи (Bayer) [210]. Далее было обнаружено, что применение ВИГ может быть эффективным при аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуре, а также при ряде других аутоиммунных и воспалительных заболеваний, в том числе рецидивирующей воспалительной полинейропатии, синдроме Гийена - Барре и синдроме Кавасаки. Таким образом были доказаны преимущества использования ВИГ с целью заместительной терапии и пассивной иммунотерапии при инфекционных заболеваниях.
В акушерстве, гинекологии и репродуктологии использование ВИГ ограничено и спорно [58]. Нет клинических рекомендаций, четких показаний и схем применения ВИГ [2, 21]. Первые наблюдения по применению ВИГ при инфекционной патологии при беременности были положительными [107]. Однако, результаты применения у пациенток с ранними репродуктивными потерями остаются противоречивыми по настоящий момент и характеризуются разными авторами от успешных до сомнительных [99, 230, 219]. Впервые ВИГ были назначены пациенткам с ПНБ в случае отсутствия положительного эффекта от преднизолона и гепарина. У пациенток с АФС эффективность ВИГ достигала 70-80% [27, 157]. У женщин с ПНБ неясной этиологии результаты были неоднозначны [232].
В 90-х годах были проанализированы работы по ВИГ с 1988 по 1997гг. Результаты представлены в таблице 7 [110].
По данным анализа 10 контролируемых исследований по лечению ПНБ и многократных неудач ЭКО с использованием ВИГ: в 4-х из них было показано, что частота живорождения выше в группе ВИГ, а в остальных 6-ти такие данные получить не удалось. В пяти работах курс иммунотерапии начинали до наступления беременности, и в 4-х из 5-ти получили положительный результат, в то время как в остальных 5-ти работах ВИГ откладывали до установления факта клинической беременности, и ни в одной из этих работ положительных результатов не получили. Дозы и кратность введения ВИГ заметно различались (таблица 8). В 5-ти исследованиях терапия начиналась на этапе планирования беременности, и в 4 из 5 была доказана эффективность. В 3 исследованиях показания к ВИГ основывались на данных иммунологического обследования и в каждом из них эффективность была доказана. Следует обратить внимание, что только в одном из исследований, определялся кариотип абортусов, т.е. процент потерь беременности ввиду аномального кариотипа не учитывался, а это те потери, на которые метод не смог бы повлиять. Эффективность ВИГ зависела также от вида ПНБ: частота живорождения была выше в группе вторичного ПНБ [232].
В 2007 году публикуется Cochrane обзор [189], по результатам которого ВИГ не повышают частоту живорождения у женщин с ПНБ неясной этиологии. По данным другого мета-анализа, в который вошло около 8000 пациенток с бесплодием неясного генеза и неудачами ВРТ, эффективность ВИГ была доказана только у тех, кому терапия назначалась на основании иммунологического обследования и до наступления беременности [156].
Механизм положительного воздействия ВИГ заключается в нейтрализация антигенов за счет естественного титра антител; иммуноглобулины способны менять баланс цитокинов Тh1-Тh2 [50, 60]. ВИГ запускают благоприятные отсроченные процессы, связанные с иммуномодулирующим действием нормальных антител на Ти В- лимфоциты и макрофаги, снижением интенсивности повреждения мембран клеток ферментами системы комплемента, оказанием цитопротективного эффекта на эндотелий сосудов [92, 62, 65].
Поэтому применение ВИГ в комплексной терапии многократных репродуктивных неудач иммунологической этиологии может быть патогенетически обосновано.
Таким образом, внутривенные иммуноглобулины являются современным, безопасным методом терапии, который широко используется в клинической практике, имеются доказательства эффективности применения ВИГ при многих заболеваниях, использование в акушерской практике, в частности репродуктологии, остается спорным и требует дополнительного изучения.
Клиническая характеристика женщин с многократными репродуктивными потерями
На первом этапе работы проанализированы клинические и анамнестические данные 102 женщин с репродуктивными потерями. Пациентки были разделены на 2 группы: группу 1 составили 61 женщина с ПНБ ранних сроков в естественном цикле, группу 2 - 41 женщина с многократными неудачами ЭКО.
Женщины исследуемых групп были сопоставимы по возрасту (таблица 15), проживали в одинаковых климатогеографических условиях - преимущественно в городе Санкт-Петербурге и Ленинградской области, имели средне-специальное и высшее образование. Профессиональных вредностей при сборе анамнеза выявлено не было. Вредными привычками страдали 8,2% женщин в группе 1, в группе 2 – выявлено не было.
При сборе семейного анамнеза (родословной) установлено: у родственников 1 и 2 линии гинекологические заболевания (миома матки, нарушения менструального цикла, онкология) и нарушения репродуктивной функции (невынашивание беременности, бесплодие) чаще встречались в семьях женщин с бесплодием – 19,5%, а среди женщин с ПНБ - в 9,8% случаев.
Возраст менархе в обеих группах у подавляющего числа женщин был в промежутке 12-14 лет. Нарушения менструального цикла (олигоменоррея, альгодисменоррея) встречались у каждой восьмой женщины в двух группах (Таблица 16).
В структуре гинекологической патологии частота гинекологических заболеваний была одинаково высокой в двух группах и составила 85% (таблица 17). Воспаление придатков, полипы эндометрия чаще встречались в группе 2 (р 0,05). Миома матки малых размеров, аномалии развития матки (седловидная матка) не различались в двух группах. Патология шейки матки (хронический цервицит, эктопия шейки матки) встречалась одинаково часто в обеих группах. У каждой шестой женщины в группе 2 был выявлен синдром поликистозных яичников, у каждой четвертой – НГЭ 1-2 ст. Диагноз хронический эндометрит устанавливался на основании данных иммуногистохимического исследования ткани эндометрия, полученной в результате процедур пайпель-биопсии, гистероскопии, выскабливания полости матки.
У пациенток двух групп в 100% случаев был установлен диагноз хронического эндометрита различной степени выраженности. В группе неудач ЭКО эндометрит слабой степени встречался у 56% женщин (p 0,05), и наоборот в группе с ПНБ эндометрит умеренной степени у 57,2% (p 0,05). Выраженное воспаление в эндометрии было диагностировано у трех пациенток в каждой группе (Таблица 18).
При анализе частоты различных видов хирургических вмешательств были отмечены следующие особенности. У каждой второй женщины с неудачами ЭКО проводили лечебно-диагностическую лапароскопию (p 0,001), при которой в 24,4% случаев был выявлен генитальный эндометриоз 1-2 степени. В группе с ПНБ лечебно-диагностическая лапароскопия проводилась каждой пятой пациентке, эндометриоз был обнаружен в 13,1% случаев.
Операции в полости матки (гистероскопия диагностическая, гистерорезектоскопия) выполняли в 2 раза чаще в группе с неудачами ЭКО, основное показание – полипы и гиперплазия эндометрия (p 0,01).
Пайпель биопсия, как отдельно, так и при операциях, выполнялась в 15 раз чаще женщинам с ПНБ (p 0,001), и наоборот гистеросальпингография, чаще проводилась женщинам с бесплодием (p 0,001) (Таблица 20).
Анализ частоты соматических заболеваний представлен в таблице 21. Частота всех заболеваний не отличалась в двух группах, за исключением заболеваний ЛОР органов (хроническое течение бронхита, тонзиллита, гайморита) (p 0,001) и дискинезии желчевыводящих путей (p 0,05), которые чаще встречались у женщин с ПНБ. Также, у женщин в данной группе был выше средний индекс массы тела (p 0,05).
В зависимости от акушерского анамнеза выделяют две формы нарушения процессов репродукции: первичную и вторичную. Репродуктивные нарушения в обеих группах в большинстве случаев были первичными - 58,5% и 70,5% соответственно в группах 1 и 2.
Частота искусственных абортов, выполненных на сроке до 12 недель беременности была выше в группе 2 (p 0,01). У женщин с ПНБ чаще отмечались ранние гестационные потери – самопроизвольные выкидыши и неразвивающиеся беременности (таблица 23 и 24). Кариотипирование абортусов в группе ПНБ было проведено в 23 случаях, из них в 9 (39,1%) была выявлена хромосомная патология (трисомия по 14, 10, 16 хромосомам, немозаичные триплоидии, в одном случае – синдром Кляйнфельтера). Кариотипирование абортусов в группе с неудачами ЭКО было выполнено в 5 случаях, из них в 2 (40%) был выявлен патологический кариотип (моносомия и трисомия по 16 хромосоме). У пациенток с ПНБ 84,5% беременностей самостоятельно прервались в I и II триместрах, из них в половине случаев произошел самопроизвольный выкидыш с кровянистыми выделениями, а в 38,9% диагностирована замершая беременность.
Частота родов была выше в группе 2 с неудачами ЭКО – 20,8%, из них срочными были 16,7%, все в предыдущем браке; 4,2% пришлось на преждевременные роды. В группе женщин с ПНБ частота родов составила 12%, из них каждые вторые роды были преждевременными, чаще происходили в период 22-28 недель гестации и произошли в настоящем браке. С примерно одинаковой частотой в обеих группах имелись указания в анамнезе на антенатальную гибель плода: в группе 2 – в 28 недель у пациентки была диагностирована хроническая плацентарная недостаточность, гипотрофия плода. В группе 1 случаи антенатальной гибели плода произошли на сроках 22, 25, 26, 28, 33 недели. Из них в трех случаях был обнаружен гнойный плацентит, в 1 – ангидрамнион, хроническая плацентарная недостаточность в двух случаях.
В группе женщин с неудачами ЭКО 69% всех беременностей в анамнезе прервались в сроки до 6 недель, а в группе с ПНБ 88% беременностей – в период до 10 недель. Прерывание беременности во втором и третьем триместрах происходило с частотой около 5% в обеих группах (Таблица 24).
Работа in vitro
В результате проведенного исследования установлено, что цитотоксический эффект NK-клеток в отношении клеток трофобласта был выше в присутствии IL-2 во всех обследованных группах пациентов. Группы здоровых небеременных женщин в ПФМЦ и СФМЦ не отличались от группы здоровых мужчин по цитотоксическому эффекту NK-клеток в отношении клеток трофобласта как в присутствии IL-2, так и без него. Таким образом, способность NK-клеток периферической крови повышать цитотоксическую активность в присутствии активатора (IL-2) в используемой нами модельной системе свидетельствует о возможности применения данной схемы эксперимента для оценки изменений функционального состояния клеток. Отсутствие различий между значениями цитотоксичности NK-клеток у здоровых небеременных женщин и здоровых мужчин указывает на одинаковое функциональное состояние NK-клеток вне зависимости от пола.
Цитотоксическая активность NK-клеток без добавления IL-2 у здоровых небеременных женщин в ПФМЦ была выше, чем у женщин с ФБ. В то же время в группе здоровых небеременных женщин в СФМЦ цитотоксическая активность NK-клеток была снижена по сравнению с соответствующим показателем для группы небеременных женщин в ПФМЦ. Таким образом, цитотоксичность NK-клеток снижалась у небеременных женщин от ПФМЦ к СФМЦ и в СФМЦ не отличалась от цитотоксичности NK-клеток у женщин с физиологической беременностью.
В присутствии IL-2 цитотоксическая активность NK-клеток в обеих группах небеременных женщин была выше, чем при физиологической беременности (Рисунок 11).
Цитотоксический эффект NK-клеток периферической крови здоровых фертильных женщин в ПФМЦ был повышен при инкубации без IL-2 по сравнению с показателем группы женщин с физиологической беременностью. Различий между группой фертильных женщин в СФМЦ и группой женщин с физиологической беременностью не выявлено (Рисунок 12).
Цитотоксичность NK-клеток у фертильных женщин в СФМЦ была снижена при инкубации без IL-2 по сравнению с соответствующим показателем для ПФМЦ (Рисунок 13). Таким образом, цитотоксическая активность NK-клеток у фертильных женщин также, как и у небеременных женщин снижается в ходе менструального цикла от ПФМЦ к СФМЦ, и в СФМЦ не отличается от таковой у женщин с физиологической беременностью. В присутствии IL-2 цитотоксическая активность не различалась в группах фертильных женщин и женщин с физиологической беременностью.
У небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта была повышена в СФМЦ по сравнению с ПФМЦ при инкубации без IL-2 (Рисунок 14). У беременных женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе цитотоксичность NK-клеток в отношении трофобласта снижена по сравнению с соответствующим показателем у небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в СФМЦ как в случае инкубации в присутствии IL-2, так и без него.
У беременных женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе по сравнению с женщинами с физиологической беременностью установлена повышенная цитотоксическая активность NK-клеток в отношении клеток трофобласта (Рисунок 15), требуется дальнейший мониторинг данных пациенток с целью пролонгирования беременности. В группе небеременных женщин с бесплодием и многократными неудачами ЭКО показатель цитотоксичности NK-клеток в отношении трофобласта был снижен по сравнению с соответствующим показателем для небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в ПФМЦ и СФМЦ и не отличался от такового в группе беременных с привычным невынашиванием беременности в анамнезе.
Группа небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезе в СФМЦ отличается повышенной цитотоксической активностью NK-клеток в отношении трофобласта (42,3%) по сравнению с соответствующим показателем для группы небеременных фертильных женщин в СФМЦ (35,8%) при инкубации без IL-2 (Рисунок 16). Для NK-клеток небеременных женщин с бесплодием выявлена сниженная цитотоксическая активность (33,9%) по сравнению с соответствующим показателем у фертильных небеременных женщин в ПФМЦ при инкубации без IL-2 (Рисунок 16).
Таким образом, если в случае небеременных фертильных женщин наблюдается снижение цитотоксической активности NK-клеток от ПФМЦ к СФМЦ, то в группе небеременных женщин с привычным невынашиванием имеет место повышение цитотоксичности от ПФМЦ к СФМЦ.