Нейропептиды в регуляции фертильности женщин Лысова Анна Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Новые воззрения на регуляцию менструального цикла и инфертильность (обзор литературы) 18

1.1 Эпидемиология женского бесплодия 19

1.2 Причины женского бесплодия 22

1.3 Уровни нарушения регуляции менструального цикла женщины 27

1.4 Роль кисспептина в регуляции репродуктивной системы женщины 32

1.5 Принципы аллометрии в выборе лабораторного животного для проведения модельного эксперимента 35

ГЛАВА 2. Клиническая характеристика обследованных пациенток 38

Глава 3. Влияние кисспептина на эстральный цикл крыс:клинико-экспериментальные данные 46

3.1 Влияние блокады кисспептинергических рецепторов на эстральный цикл взрослых половозрелых самок крыс 46

3.2 Роль кисспептина в нормализации эстрального цикла взрослых половозрелых самок крыс 53

ГЛАВА 4. Роль кисспептина в репродуктивной функции женщин детородного возраста 56

4.1 Уровень кисспептина у здоровых небеременных женщин детородного возраста 57

4.2 Уровень кисспептина у здоровых беременных женщин 64

4.3 Уровень кисспептина у женщин с эндокринной формой бесплодия 66

4.4 Кисспептин — маркер эндокринной формы бесплодия и угрозы прерывания беременности на ранних сроках 68

ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов 71

Заключение 82

Выводы 82

Практические рекомендации 83

Список сокращений 85

Список литературы

• Уровни нарушения регуляции менструального цикла женщины
• Роль кисспептина в нормализации эстрального цикла взрослых половозрелых самок крыс
• Уровень кисспептина у здоровых беременных женщин
• Кисспептин — маркер эндокринной формы бесплодия и угрозы прерывания беременности на ранних сроках

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Несмотря на неуклонный рост уровня оказания медицинской помощи, в последние десятилетия в России все еще сохраняются негативные демографические тенденции. В сложившейся ситуации проблема охраны репродуктивного здоровья женщин приобрела важнейшее социальное и геополитическое значение (Радзинский В.Е., Семятов С.М., 2013). Концепцией демографического развития России до 2025 г. охрана репродуктивного здоровья населения страны объявлена приоритетной государственной задачей (Серов В.Н., Сухих Г.Т., 2014; Хамошина М.Б., 2016). Это диктует необходимость научного обоснования и внедрения в практическое здравоохранение лечебно-профилактических технологий, которые будут способствовать повышению репродуктивного потенциала женского населения (Назаренко Т.А., Краснопольская К.В., 2013; Радзинский В.Е., 2014; Крутова В.А., 2014; Сутурина Л.В., 2014; Arce J.C., Nyboe Andersen A., Fernandez-Sanchez M., 2014).

Наряду с низким коэффициентом фертильности женщин и снижением доли повторных деторождений, в настоящее время прослеживается и обратная сторона проблемы — увеличение числа супружеских пар, страдающих бесплодием (Краснопольский В.И., 2014). В России женским бесплодием страдает более 12 млн человек. Доля бесплодных пар достигает 15% от общего числа браков, что представляет серьёзную проблему для здравоохранения, общества и государства (Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., 2010; Лабыгина А.В., 2014; Хамошина М.Б., 2016).

Степень разработанности темы исследования. Социальная и медицинская значимость проблемы бесплодия заставляет ученых всего мира проводить все новые и новые исследования в этой области (Адамян Л.В., Андреева Е.И., Спицын В.Г., 2008; Mahon E, Cotter N., 2015). Рутинные ныне способы его преодоления — стимуляция овуляции и ЭКО — зачастую чрезмерно затратны и не всегда эффективны (Frye C., Bo E., Calamandrei G., 2012; Keith Edmonds D., 2012). В связи с этим исследование свойств кисспептина — нейромедиатора, который оказывает непосредственное регулирующее воздействие на репродуктивную систему женщин, — открыло новые перспективы в понимании причин и поиске средств лечения бесплодия (Каверина И.В., Уласов И.В., Фаворская И.А., 2011; Dungan H.M., Clifton D.K., Steiner R.A., 2013; , , 2015). Обсуждаемая возможность применения кисспептина для регуляции функции гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы человека с диагностической и лечебной целью нуждается в дальнейших исследованиях с целью прояснения точных его механизмов действия и возможной роли агонистов и антагонистов рецептора GPR54 (Miller A., Maletic V. M., Raison C., 2014; Lattes K., Brassesco M., Gomez M., 2015).

Цель работы: улучшить эффективность ранней диагностики и преодоления женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции.

4 В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель ановуляторного бесплодия женщин на половозрелых самках крыс линии Wistar с использованием блокатора кисспептинергических рецепторов;

2. Подтвердить в модельном эксперименте связь нарушения процесса овуляции у самок крыс линии Wistar с блокадой кисспептинергических рецепторов;

3. Разработать референсные значения уровня кисспептина у здоровых женщин детородного возраста вне- и во время беременности, а также у пациенток с женским бесплодием, связанным с отсутствием овуляции;

4. Изучить взаимосвязь между уровнем кисспептина и количественным содержанием гонадотропных и половых гормонов в сыворотке крови женщин в течение менструального цикла и взаимосвязь экскреции кисспептина с количеством овуляторных циклов у здоровых женщин;

5. Разработать и внедрить методику обследования женщин для раннего выявления группы риска развития женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции, и вероятностного прогнозирования возможности овуляции с использованием исследования уровня кисспептина.

Научная новизна. В результате проведенного исследования расширены представления о
патогенезе женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции. Подтверждены и
дополнены существующие представления о значении кисспептина для нейроэндокринной
регуляции функции репродуктивной системы. Установлено, что уровень кисспептина в
сыворотке крови может служить маркером состояния здоровья женщин и оценки их
репродуктивного потенциала. Выявлена взаимосвязь между степенью снижения уровня
кисспептина и риском развития женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции.
Впервые определены референсные значения уровня кисспептина у здоровых женщин. Показана
взаимосвязь между уровнем кисспептина в крови и сроком наступления беременности у
здоровых женщин. Экспериментально подтверждена возможность моделирования

ановуляторного бесплодия на фоне блокады кисспептинергических рецепторов у ранее здоровых половозрелых самок крыс линии Wistar.

Теоретическая и практическая значимость. Разработана научная идея, обогащающая концепцию ранней диагностики и преодоления женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции.

Применительно к проблематике диссертации результативно использованы

информативные методы исследования, экспериментальные методики, включая моделирование ановуляторного бесплодия на самках половозрелых крыс с помощью блокатора кисспептинэргических рецепторов. Экспериментально подтверждена возможность коррекции

5 ановуляторного бесплодия, вызванного блокадой кисспептинэргических рецепторов, введением экзогенного кисспептина. Разработаны прогностические критерии вероятности наступления беременности при регулярной половой жизни. Модифицирована методика обследования женщин с ановуляторным бесплодием. Практическому здравоохранению предложены рекомендации по обследованию и ведению пациенток с ановуляторным бесплодием, представлены референсные значения уровня кисспептина у здоровых женщин (Патент на изобретение №2574669 «Способ экспресс-диагностики женского эндокринного бесплодия»). Создана экспериментальная модель женского бесплодия, связанного с отсутствием овуляции (Патент на изобретение № 2571896 «Способ моделирования женского ановуляторного бесплодия на крысах»). Обоснована перспективность дальнейших исследований в области применения кисспептина для науки и практики.

Методология и методы исследования. Настоящее исследование выполнено в 2014– 2016 гг. в Экспериментальной лаборатории нормальной и патологической физиологии Медицинского университета «Реавиз», г. Самара (зав. лабораторией — д.м.н., профессор Зарубина Е.Г.); в Научно-исследовательской лаборатории по проблемам морфологии «Реавиз», г. Самара (зав. лабораторией — д.м.н., академик РАМТН профессор, Марков И.И.) и в ООО «Независимая лаборатория ИНВИТРО», г. Самара (зав. лабораторией — канд. биохим. наук Желтякова О.В.).

Диссертационное исследование проводили в два этапа: экспериментальный и клинический. На первом этапе выполнено экспериментальное изучение роли кисспептина в регуляции эстрального цикла крыс (модельный эксперимент). Первый этап состоял из 3 частей. В первой части были отобраны 36 половозрелых самок крыс линии Wistar в возрасте 6 месяцев, весом 195,0 ±10,0 г, с синхронизированными эстральными циклами. Все животные были разделены на 2 группы (опыт и контроль).

Оценку фаз эстрального цикла крыс проводили, используя цитологическое исследование влагалищных мазков. Забор влагалищного отделяемого осуществляли с помощью марлевого тампона, ежедневно, на протяжении 4-х недель. Микроскопическое исследование с целью определения индекса созревания (ИС) и кариопикнотического индекса (КИ) выполняли при увеличении 10х20 с окраской материала 0,5% спиртовым раствором метиленового синего. Выбор крыс линии Wistar в качестве модели для эксперимента был определен аллометричностью функционирования репродуктивной системы крысы и человека и общими закономерностями процессов инволюции половой сферы (Salehi M.S. et al., 2013).

В ходе второй части исследования с целью изучения влияния на эстральный цикл крыс блокады кисспептинергических рецепторов животным из опытной группы (18 особей) вводили в носовые ходы блокатор кисспептинергических рецепторов — kisspeptin-234 trifluoroacetatesalt

6 (Sigma, USA), 10 мкл раствора (2х10^-3 моль). Для чистоты моделирования эксперимента в контрольной группе (18 особей) вводили такой же объем 0,9% раствора NaCl (10 мкл). Результаты оценивали путем измерения базальной температуры и микроскопии влагалищных мазков на протяжении не менее 10 суток.

В третьей части эксперимента изучали стимулирующее влияние кисспептина на «заблокированный» эстральный цикл крыс, для чего на фоне пролонгированного в 2 раза диэструса животным из опытной подгруппы вводили 10 мкл раствора kisspeptin-234 (2х10^-2 моль). Животным контрольной группы вводили аналогичный объем 0,9% раствора NaCl. Регистрировали базальную температуру крыс, выполняли микроскопическое исследование влагалищного отделяемого на протяжении 4 дней ежедневно (метод Стоккарда и Папаниколау). Для микроскопии использовали микроскоп «XS-910» (ОМО, Россия, 2011) с увеличением 10х20, оснащенный цифровой насадкой для компьютерной визуализации изображения DCM130 (Shangrao Tele View Optical Instruments, Китайская Народная Республика, 2011). Увеличение фазы диэструса с 2 до 5 дней расценивали как «экспериментальное нарушение эстрального цикла», то есть отсутствие овуляции.

В клиническую часть работы были включены 237 женщин в возрасте от 18 до 35 лет, распределенных по четырем группам. Исследование было выполнено на базе Самарской областной клинической больницы имени В.Д. Середавина (гл. врач — Купцов Д.Н.) и Лечебно-диагностического комплекса «МЕДГАРД» г. Самара (гл. врач — Мокеев А.Г.).

I группу составили 82 женщины, не планировавшие и не имевшие беременностей, живущие регулярной половой жизнью и использовавшие с целью контрацепции презерватив.

Во II группу вошли 85 женщин, ранее не страдавших бесплодием, имевших 1–2 беременности, закончившиеся нормальными родами, и на момент обследования живущих регулярной половой жизнью с использованием презерватива с целью контрацепции.

III группу сформировали из 37 здоровых беременных женщин, имевших 1–2
беременности, включая настоящую.

IV группу составили 33 женщины, страдавшие первичным и/или вторичным бесплодием
неустановленного генеза в течение 5 лет и более. Эти пациентки были обследованы в объеме,
необходимом для ЭКО, в сроки не ранее чем через 1–2 месяца после отмены гормональных
препаратов.

Критериями исключения служили:

пороки развития мочеполовой системы;

острые и обострение хронических специфических и неспецифических воспалительных заболеваний женских половых органов на момент обследования;

болезни эндокринной системы, нарушения питания и обмена веществ;

сниженный овариальный резерв;

онкологические заболевания, в том числе в анамнезе;

аутоиммунные, неврологические, психические заболевания;

соматические заболевания тяжелой и средней степени тяжести, а также любые заболевания в стадии обострения;

наличие зарегистрированных профессиональных вредностей, хронических стрессов, тяжелого физического труда, в том числе труда в экстремальных для организма условиях;

нерегулярная половая жизнь;

изменения в спермограмме у супруга.

Уровень кисспептина сыворотки крови определяли методом иммуноферментного анализа с использованием спектрофотометра Sunrise–Tecan (Австрия, 2013 г.) и набора реактивов кисспептин-54 (метастин) (с экстракцией) (BCM DIAGNOSTICS, США).

Забор крови с целью определения уровня кисспептина выполняли у женщин I и II групп — вне менструации; в III группе — с 12 по 39 неделю беременности с интервалом в 12–14 недель; в IV группе — однократно.

Исследовали уровни гормонов: ФСГ (мЕд/мл=Ед/л); ЛГ (мЕд/мл=Ед/л); прогестерона (нмоль/л); эстрадиола (нмоль/л); пролактина (мЕд/л) методом электрохемилюминесценции на автоматическом анализаторе Cobas с601 (Roche, Швейцария, 2013 г). За референсные значения уровня гормонов крови принимали: в фолликулярную фазу: ФСГ равен 1,37-9,90 мЕд/мл; ЛГ =21,9-56,6 мЕд/мл; пролактин = 79-347 мЕд/мл; эстрадиол = 68-1269 пмоль/л; прогестерон = 0,30-2,20 нмоль/л. В лютеиновую фазу ФСГ равен 6,17-17,20 мЕд/мл; ЛГ =1,68-15,00 мЕд/мл; пролактин = 79-347 мЕд/мл; эстрадиол = 131-1655 пмоль/л; прогестерон = 0,5-9,4 нмоль/л.

Положения, выносимые на защиту:

6. Блокада кисспептинергических рецепторов в эксперименте приводит к нарушению овуляции у молодых половозрелых самок крыс линии Wistar с устойчивым эстральным циклом. Экзогенное введение кисспептина крысам, находящимся в диэструсе, способствует восстановлению овуляции.

7. Содержание кисспептина в крови у здоровых женщин коррелирует с уровнями гонадотропинов и половых гормонов (r=0,98), что подтверждает его важную роль в регуляции функции женской репродуктивной системы. Референсные значения кисспептина у здоровых небеременных женщин составляют 2,5 нг/мл и более.

8. Кисспептин может использоваться в качестве маркера риска бесплодия, связанного с отсутствием овуляции. Двукратное снижение уровня кисспептина в сыворотке крови увеличивает риск ановуляторных циклов в 4 раза (с вероятностью 98%).

Степень достоверности и апробация результатов работы. Статистическая обработка данных была выполнена в автоматическом режиме с применением пакета прикладных программ Statistica for Windows 6,0. При сравнении показателей использовали критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при р <0,05.

Апробация состоялась на расширенном заседании кафедры акушерства и гинекологии с курсом эндоскопической хирургии Медицинского университета «Реавиз» (г. Самара) 18 мая 2016г., протокол №7.

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на: VI Ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых» (Санкт-Петербург, 2015); V Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2014); Международной конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2015). По результатам исследования автором получены патент на изобретение №2574669 «Способ экспресс-диагностики женского эндокринного бесплодия» и патент на изобретение № 2571896 «Способ моделирования женского ановуляторного бесплодия на крысах».

Теоретические положения о роли кисспептина в регуляции функции репродуктивной системы женщины внедрены в учебный процесс кафедр медико-биологических дисциплин, акушерства и гинекологии и в работу клинико-диагностических лабораторий Медицинского университета «Реавиз» (г. Самара, г. Москва).

Разработанные прогностические критерии риска бесплодия, связанного с отсутствием овуляции, внедрены в практическую работу Лечебно-диагностического комплекса «Медгард», г. Самара; СПб ГБУЗ «Городская поликлиника № 77 Невского района», г. Санкт-Петербург; Санкт-Петербургскую Клинику имени Н. И. Пирогова, г. Санкт-Петербург.

Автор лично спланировала исследование, сформулировала его цель и задачи, выполнила обзор литературы по тематике диссертации. В ходе сбора материала участвовала в обследовании и наблюдении 237 пациенток, самостоятельно выполнила экспериментальный этап работы. Эффективно применила методы статистической обработки и анализа полученных результатов исследований, сформулировала выводы и разработала практические рекомендации, опубликовала основные положения диссертации.

По результатам работы автор имеет 13 публикаций, в том числе 7 — в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 207 источников, в том числе 162 иностранных.

Уровни нарушения регуляции менструального цикла женщины

В 1999 году неподалеку от городка Hershey в штате Пенсильвания был открыт новый нейропептид кисспептин. Свое второе название «белок поцелуев» он «получил благодаря известной продукции американской компании по производству шоколада Херши — конфетам Hershey s Kiss» [116]. Лаборатория, где было сделано открытие, находилась неподалеку от одноименной компании. Нейропептид кодируется геном kiSS-1, открытым также в 1999 году. Полагают, что открытый нейропептид, названный «кисспептином», является ключевым «стражем ворот» в контроле репродуктивной функции [83, 202]. В 2013 году «в Сан-Франциско на ежегодной конференции Общества эндокринологии ENDO были представлены первые результаты клинических испытаний нового метода стимуляции яичников перед процедурой ЭКО с помощью кисспептина. Данный метод ученые назвали более безопасным и эффективным по сравнению с уже существующими методиками стимуляции овуляции» [185, 166]. Эксперты подтвердили успех испытаний — благодаря новой методике появился на свет первый младенец. Начало новой эры в мире вспомогательных репродуктивных технологий было положено [118].

Кисспептин и его связанный с G-белком рецептор GPR54 играют ключевую роль в пубертатном развитии и фертильности. Предполагают, что ген kiss-1 отвечает за синтез протеина, запускающего особую функцию гипоталамуса мозга в начале полового созревания. Ген kiss-1 посылает сигнал другому важному гену, называемому GPR54, который, в свою очередь, побуждает в организме производство гормонов, стимулирующих физические признаки полового созревания [116, 124].

Кисспептин, включающий 54 аминокислоты, относится к метастатинам благодаря его способности подавлять метастазирование, и вовлечен также в биологию опухолей [19, 206]. Система кисспептин/GPR54 активирует гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему, но механизмы этого влияния до конца не ясны. Экспрессия мРНК кисспептина обнаружена в гипоталамусе, плаценте, гипофизе, поджелудочной железе, спинном мозге [91, 88]. Предполагают, что половое созревание наступает в результате активации гипоталамус-гипофиз-гонады под влиянием взаимодействия кисспептина и его рецептора GPR-54. Возможно, что взаимодействие кисспептина и его клеточного рецептора GPR54 в мозге является определяющим фактором в активации нейронов, высвобождающих ГнРГ, который, в свою очередь, управляет секрецией ЛГ и ФСГ, вызывающих в итоге овуляцию [116]. Расстройства, нарушающие взаимодействие кисспептина и его рецепторов, приводят к невозможности овуляции. Было показано, что кисспептин оказывает свои эффекты не только на уровне гипоталамуса, но также на уровне гипофиза и яичников. Кисспептин непосредственно стимулирует секрецию ГнРГ из аркуатного ядра гипоталамуса [123, 114]. Полагают, что кисспептин играет ключевую роль в метаболической регуляции фертильности. В случае отрицательного энергетического баланса экспрессия гена kiss-1 снижается [106]. Инактивация мутаций GPR54 ведет к гипогонадотропному гипогонадизму у человека. И наоборот, мутации, активирующие сигнальные пути GPR54, связаны с гонадотропин-зависимым преждевременным половым созреванием [118]. В последнее время обсуждается возможность применения кисспептина с лечебной целью для воздействия на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую систему у человека. Однако крайне необходимы дальнейшие исследования для прояснения точных механизмов и возможной роли агонистов и антагонистов рецептора GPR54 [140, 149].

В 2009 году впервые с помощью кисспептина было проведено исследование возможности восстановления репродуктивной функции у женщин с низким уровнем гормонов в сыворотке крови. Исследование было проведено в лондонском Imperial College и показало хорошие результаты [28].

Более 8 недель этим женщинам делали по две инъекции кисспептина каждую неделю. После введения наблюдалось 48-кратное увеличение уровня ЛГ и 16-кратное увеличению уровня ФСГ. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что кисспептин позволяет мягко «разбудить» репродуктивную систему. Одновременно естественные регулирующие и защитные механизмам организма продолжают свою работу. Результаты исследования были представлены на собрании Общества эндокринологии в Манчестере, Великобритания (the Society for Endocrinology BES meeting) [109, 83]. Однако, для начала клинического применения кисспептина необходимо подтверждение этих данных в результате экспериментальных исследований, а также более масштабных рандомизированных испытаний [136].

Роль кисспептина в нормализации эстрального цикла взрослых половозрелых самок крыс

В ходе первого этапа исследования было установлено, что у всех 36 животных, включенных в исследование, эстральный цикл регулярный, включающий 4 фазы: диэструс (стадия покоя, или межтечки); проэструс (стадия подготовки к течке, или предтечки); эструс (течка); метэструс (стадия послетечки). Длительность эстрального цикла не превышала 5 суток.

В стадии проэструса, продолжающейся около 12 ч, мазок состоял почти из Межтечка (диэструс) — покой вагинального эпителия, обусловленный низким уровнем эстрогенов в организме. В стадии диэструса, составляющей около 2-х суток эстрального цикла (48-51 ч), в мазке у 100,0% животных преобладали слизь и лейкоциты (Рисунок 3). одних эпителиальных клеток, слущенных со стенок влагалища. Он совпадал с наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника и характеризовался гипертрофией и гиперплазией эпителиальных клеток влагалища и последующим отторжением клеток, секретирующих слизь В стадии эструса (длительность около 24-27 ч) в мазке содержались преимущественно чешуйки — безъядерные, ороговевшие клетки, образующиеся из-за расслоения клеток эпителия (Рисунок 5). Этот период в норме сочетался с активизацией полового поведения и по времени примерно совпадал с овуляцией.

Нормальное протекание эстрального цикла у животных, включенных в эксперимент, подтверждалось и динамикой изменения ректальной температуры у крыс в период эстрального цикла. Поскольку эстрогены способствуют снижению ректальной температуры, а прогестерон — ее повышению, то в первой фазе цикла она была более низкой, а во второй повышалась. Непосредственно перед овуляцией наблюдали всплеск эстрогенов, что обеспечивало еще большее снижение температуры. Таким образом, ректальная температура при овуляции была самой низкой на графике. Если нормальная ректальная температура у крыс составляла 38,0-38,1С, то в фазу эструса (иногда проэструса) она составляла в среднем 36,9±0,2С (Рисунок 7), что свидетельствовало о произошедшей овуляции. Выявлено было также достоверное повышение температуры в фазу диэструса (до 38,8-38,9С) по сравнению с фазой эструса, что объясняется функционирующими желтыми телами в период диэструса. 39,5 39 38,5 38 37,5 37 36,5 36 35,5 Диэструс Проэструс Эструс Метэструс Ректальная температура Рисунок 7 — Динамика изменения базальной температуры у крыс с нормальным эстральным циклом Полученные данные у здоровых самок крыс с устойчивым эстральным циклом представлены в Таблице 15.

Кольпоцитологические индексы у крыс линии Wistar до применения блокатора кисспептинергических рецепторов – kisspeptin-234 trifluoroacetate salt (Sigma, USA) Показатель Диэструс Проэструс Эструс Метэструс ИС 0/0/0 0/24/76 0/15/85 65/25/10 КИ 9,6±3,6 75,6±7,2 81,7±6,2 25,6±5,3 Эстрогенная стимуляция Для подтверждения регулярности эстрального цикла у каждого животного было зафиксировано не менее 3-х последовательных циклов. Таким образом, было установлено, что у всех животных как опытной, так и контрольной групп отмечен нормальный регулярный эстральный цикл, совпадающий по продолжительности фаз. Его структура представлена на Рисунке 8. Метэ струс Соотношение фаз эстрального цикла у контрольной и опытной групп крыс линии Wistar до применения блокатора кисспептинергических рецепторов – kisspeptin-234 trifluoroacetate salt (Sigma, USA) После введения в носовые ходы крыс блокатора кисспептинергических рецепторов – kisspeptin-234 trifluoroacetate salt в фазу диэструса у всех 18 животных было отмечено нарушение регулярного эстрального цикла, что выражалось в удлинении фазы диэструса в 3-4 раза по сравнению с исходными значениями.

Уровень кисспептина у здоровых беременных женщин

Эндокринное бесплодие встречается у каждой третьей женщины с бесплодием и проявляется комплексом гормональных нарушений, ведущих к нерегулярности овуляции или ее отсутствию. Эндокринное бесплодие — собирательное понятие, поскольку включает в себя различные нарушения механизмов гормональной регуляции менструального цикла: на гипоталамо-гипофизарно-яичниковом уровне, в системах ТТГ—щитовидная железа, АКТГ— кора надпочечников и других. Независимо от причин эндокринного бесплодия, в основе его развития лежит нарушение функции яичников, проявляющееся стойкой ановуляцией (отсутствием овуляции) или ее нерегулярностью. Нормализация нарушенных функций в большинстве случаев (в 70–80%) приводит к наступлению беременности, в остальных случаях в настоящее время перспективным считают устранение эндокринного бесплодия методом стимуляции овуляции.

Для выяснения роли кисспептина в формировании эндокринной формы бесплодия нами изучен его уровень у женщин, беременность у которых не наступала при регулярной половой жизни со здоровым партнером без применения средств контрацепции в течение 5 лет и более.

Как видно из представленных данных, выраженное снижение уровней ФСГ и ЛГ, а также концентрации в сыворотке крови прогестерона по сравнению с нормальными значениями, отмечено у пациенток IV группы, Низкий уровень ЛГ у них обусловил снижение уровня прогестерона. Уровни эстродиола хотя и ниже, чем у здоровых женщин, тем не менее, не выходили за нижнюю границу референсных значений. Вместе с тем, уровень пролактина несколько выше референсных значений, характерных для женщин детородного возраста, так как эстрогены вырабатываются как в яичниках, так и в надпочечниках женщин (их патологии в данном случае нет) и оказывают стимулирующее влияние на уровень пролактина.

С низким уровнем кисспептина у женщин данной группы коррелирует (r=0,97) снижение в сыворотке крови уровней ФСГ и ЛГ (Таблица 26), что не противоречит современным данным о механизмах влияния кисспептина на выработку гонадотропинов. именно ФСГ и ЛГ, то их снижение приводит к закономерному возникновению нарушений нормального менструального цикла. Измерение ректальной температуры у данной группы женщин на регулярной основе на протяжении года зафиксировало в 100% случаев монофазный характер кривой ректальной температуры. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что у части женщин при эндокринном бесплодии при снижении уровня кисспептина опосредованно снижался уровень ФСГ и ЛГ в крови и нарушалось созревание фолликулов в яичниках, т.е. имелся ановуляторный характер цикла. Лечение женщин с такой формой эндокринного бесплодия должно строиться с учетом особенностей их гормонального статуса и дальнейшего ведения беременности в случае ее возникновения, поскольку, как было установлено ранее, низкие уровни кисспептина в крови могут стать предиктором прерывания беременности на ранних стадиях.

Ранняя диагностика аномалий секреторной функции гонад, выражающаяся в нарушениях процессов овуляции, позволяет в значительной степени сократить количество бесплодных браков и улучшить демографическую ситуацию в популяции. Определение начальных признаков нарушений гормонального статуса и фертильности является актуальной проблемой современной медицины, поскольку естественная убыль населения только в РФ сегодня составляет около 1 млн человек за 3 года. Для прогнозирования бесплодия в настоящее время предложены различные биохимические, инструментальные методы диагностики, однако уже само их количество свидетельствует о недостаточной их эффективности.

Полученные в ходе исследования данные о вариабельности уровня кисспептина у женщин и его влиянии на репродуктивную систему позволяют рекомендовать исследование кисспептина для ранней экспресс-диагностики эндокринной формы бесплодия, связанной с нарушением выработки ГнРг на фоне нарушения центральных механизмов регуляции, а также прогнозировать сроки наступления зачатия при регулярной половой жизни со здоровым партнером. Нами на основании проведенных исследований установлены референсные значения уровня кисспептина для экспресс-диагностики эндокринного бесплодия, которые указаны в Таблице 27. Таблица 27 — Критерии прогноза наступления беременности у женщин с различными уровнями кисспептина Группа женщин Уровень кисспептина Прогноз Здоровые женщины, имеющие детей 18-25 лет N = 25 человек Выше 9,0 нг/мл возможность забеременеть в течение 6 месяцев Здоровые женщины, имеющие детей 18-25 лет N = 62 человека От 7,0 нг/мл до 9,0 нг/мл возможность забеременеть в течение 1 года Здоровые женщины, имеющие детей 25-35 лет N = 46 человек от 4,5 нг/млдо7,0 нг/мл возможность забеременеть в течение 1,5 лет Здоровые женщины, имеющие детей 25-35 лет, N = 31 от 1,8 нг/мл до 4,5нг/мл возможность забеременеть в течение 2 лет Женщины с эндокринной формой бесплодия, N = 33 ниже 1,7 нг/мл необходимо проведение стимуляции овуляции или ЭКО

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод о том, что уровень кисспептина у здоровых женщин колеблется в широких пределах и может оказывать существенное влияние на репродуктивную систему через влияние на формирование овуляторных циклов (через кисспептин-опосредованное снижение уровня ФСГ и ЛГ в крови и нарушение созревания фолликулов в яичниках), что, в свою очередь, регулирует сроки зачатия на фоне регулярной половой жизни со здоровым партнером. Кроме того, кисспептин, по-видимому, принимает участие и в процессах сохранения и вынашивания беременности, что подтверждается увеличением его уровня на фоне беременности. Снижение уровня кисспептина ниже 1,7 нг/мл в сыворотке крови соматически и гинекологически здоровых женщин по данным стандартов обследования согласно приказу Минздрава России от 01.11.2012 №572н (ред. от 17.01.2014) Об утверждении Порядка оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология (за исключением использования вспомогательных репродуктивных технологий)» приводит к возникновению у них симптомов эндокринного бесплодия. Полученные в ходе исследования данные и разработанный на их основе метод (Патент на изобретение №2574669 «Способ экспресс-диагностики женского эндокринного бесплодия») позволяют рекомендовать кисспептин в качестве маркера и диагностического критерия в гинекологии и акушерстве при прогнозировании сроков возможного наступления беременности и при экспресс-диагностике эндокринного бесплодия.

Кисспептин — маркер эндокринной формы бесплодия и угрозы прерывания беременности на ранних сроках

Возможно, что на фоне гиперпролактинемии, управляя высвобождением кисспептина, можно восстанавливать секрецию ГнРГ, перезапуская тем самым овариальный цикл и стимулируя овуляцию [118, 70]. Для подтверждения этой гипотезы нами была проведена вторая часть эксперимента. Сначала половозрелым самкам линии Wistar с устойчивым эстральным циклом был введен, как и в первой части эксперимента, блокатор кисспептинергических рецепторов, что привело к нарушению его воздействия на GPR54–рецепторы, прекращению выработки гонадолиберинов и спровоцировало пролонгацию диэструса. В данном случае блокатор GPR54–рецепторов выступал в качестве конкурентного антагониста по отношению к естественному медиатору кисспептину. При конкурентном антагонизме вещество вступает в конкурентное отношение с естественным регулятором (медиатором) за места связывания в специфических рецепторах. Блокада рецептора, вызванная конкурентным антагонизмом, может быть снята большими дозами вещества-агониста или естественного медиатора.

В связи с этим в эксперименте с половозрелыми самками крыс линии Wistar нам удалось введением раствора кисспептина «разблокировать» заблокированные (блокатором кисспептинергических рецепторов) рецепторы кисспептина и восстановить нарушенную репродуктивную функцию, что свидетельствует о возможности использования кисспептина для лечения ановуляторного бесплодия, связанного с недостаточной продукцией или с нарушением связывания кисспептина со специфическими рецепторами. Об изменении функционального состояния яичников подопытных крыс судили по соотношению эпителиальных клеток в содержимом влагалища у животных. Подтверждением перехода стадии покоя в фазу эструса стало появление соответствующей кольпоцитологической картины (появление «чешуек» — безъядерных клеток в кольпоцитологическом мазке крыс). Кроме того, было зарегистрировано возрастание на фоне введения кисспептина КИ до 80,2%, что свидетельствовало о произошедшей на фоне введения кисспептина овуляции.

Таким образом, была подтверждена важная роль кисспептина в регуляции женской репродуктивной системы, а также возможность использования экзогенного кисспептина для нормализации гормонального баланса у женщин с эндокринной формой бесплодия. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что уровень кисспептина у здоровых женщин колеблется в широких пределах. Этот нейропептид оказывает существенное влияние на репродуктивную систему через кисспептин-опосредованное снижение уровней ФСГ и ЛГ и нарушение фолликулогенеза в яичниках. Это, в свою очередь, влияет на сроки зачатия при регулярной половой жизни со здоровым партнером. Кроме того, кисспептин, по-видимому, принимает участие в регуляции гестационных механизмов, что подтверждается увеличением его уровня на фоне беременности. Снижение уровня кисспептина ниже 1,7 нг/мл в сыворотке крови у соматически и гинекологически здоровых женщин ассоциируется с риском ановуляции.

Полученные в ходе исследования данные и разработанная на их основе методика (Патент на изобретение №2574669 «Способ экспресс-диагностики женского эндокринного бесплодия») позволяют рекомендовать кисспептин для использования в качестве маркера риска и критерия диагностики бесплодия, связанного с отсутствием овуляции, а также для прогнозирования сроков возможного наступления беременности.

В результате исследования разработаны референсные значения уровня кисспептина у здоровых небеременных женщин и критерии для экспресс-диагностики эндокринного бесплодия.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Экспериментальная модель, разработанная на половозрелых самках крыс линии Wistar посредством полной блокады кисспептинергических рецепторов, воспроизводит нарушения эстрального цикла и формирование ановуляторного бесплодия (пролонгации диэструса), что подтверждается изменением кольпоцитологических индексов (КИ, ИС 0/0/0 с 1-го по 7-й день после введения блокатора) и появлением монофазной кривой ректальной температуры.

2. Восстановление овуляции и нормального эстрального цикла, подтвержденное данными кольпоцитологического исследования, на фоне экспериментально воспроизведенного ановуляторного бесплодия происходит через 16 часов после введения половозрелым самкам крыс физиологических доз кисспептина.

3. Референсными значениями кисспептина для здоровых небеременных женщин следует считать показатели, превышающие 2,5 нг/мл, а диагностическим критерием ановуляторного бесплодия – снижение его концентрации ниже 1,7 нг/мл. Кисспептин участвует в обеспечении регуляции гестационных механизмов.

4. Концентрация кисспептина высоко коррелирует (r = 0,98) с количественным содержанием ФСГ, ЛГ, эстрадиолом, прогестероном, а также количеством ановуляторных циклов у здоровых женщин. Установлено, что при снижении уровня кисспептина в 2 раза (с 9,0 до 4,5 нг/мл) риск ановуляторных циклов повышается в 4 раза (с 5,6% до 22,2%).

5. Разработана и апробирована для практического здравоохранения методика обследования женщин для выделения с вероятностью 98% группы риска развития ановуляторного бесплодия. Критерием прогноза ановуляции служит уровень кисспептина ниже 1,7 нг/мл. При уровне кисспептина больше 9,0 нг/мл беременность у здоровых женщин наступает в течение 6 месяцев; при уровне 7,0– 8,9 нг/мл — в течение 1 года; при 4,5-7,6,9 нг/мл — в срок до 1,5 лет; при 2,5-4,4 нг/мл — в течение 2 лет.

Полученные выводы позволяют сформулировать практические рекомендации:

1. Исследование уровня кисспептина может быть использовано для оценки репродуктивного потенциала женщин, риска ановуляции и прогнозирования вероятности наступления беременности. Преимущества данного метода: возможность диагностики в амбулаторных условиях; отсутствие привязки исследования к дням менструального цикла; невозможность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов на фоне влияния внешних и внутренних факторов на репродуктивную систему из-за генетической детерминированности секреции кисспептина в организме женщины; простота методики — исследование проводится на обычном лабораторном оборудовании с применением стандартных наборов реагентов. Результат выдается пациентке или врачу в день исследования.

2. Уровень кисспептина у женщин репродуктивного возраста не зависит от фазы менструального цикла. Для исследования необходимо 5–10 мл венозной крови. Уровень кисспептина определяют в сыворотке крови и сравнивают с референсными значениями (2,5–12,0 нг/мл).

3. Уровень кисспептина в сыворотке крови женщин, детородного возраста целесообразно использовать для выявления группы риска развития бесплодия, связанного с отсутствием овуляции. Ановуляторное бесплодие с вероятностью 95% имеет место при уровне кисспептина ниже 1,7 нг/мл. Указанные показатели позволяют обосновать необходимость стимуляции овуляции или направления на ЭКО.

Перспективы дальнейшей разработки темы. Полученные данные позволяют считать перспективными исследования, посвящённые роли кисспептина в регуляции процессов полового созревания, сохранения беременности, разработке неизвазивных методов лечения ановуляторного бесплодия путем коррекции уровня кисспептина при его дефиците, а также возможности мониторинга колебания уровня секреции кисспептина для диагностики и профилактики нарушений репродуктивной системы женщин.