Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современный взгляд на проблему неразвивающейся беременности 12
1.1. Этиология и эпидемиология неразвивающейся беременности .12
1.2. Проблемы диагностики хронического эндометрита 25
1.3. Особенности ведения пациенток с неразвивающейся беременностью в современных условиях .26
1.4. Применение ультразвукового низкочастотного орошения в акушерстве и гинекологии 31
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 34
2.1. Дизайн исследования и группы наблюдения 34
2.2. Методы исследования 37
2.3. Клиническая характеристика пациенток групп наблюдения 43
ГЛАВА 3. Влияние низкочастотного ультразвукового кавитационного орошения полости матки на системный, локальный иммунитет и состояние микробиоты половых путей у женщин после прерывания замершей беременности .51
3.1. Оценка состояния иммунной системы пациенток с неразвивающейся беременностью при использовании кавитационного орошения полости матки 51
3.2. Показатели иммунитета женщин с неразвивающейся беременностью при использовании стандартной терапии 56
3.3. Особенности состояния иммунной системы женщин с хроническим эндометритом .59
3.4. Реакции локального иммунитета в эндометрии в ответ на проведение процедуры ультразвукового кавитационного орошения полости матки 62
3.5. Состояние микробиоты половых путей у женщин после неразвивающейся беременности 65
ГЛАВА 4. Собенности морфофункционального состояния и рецепторного аппарата эндометрия у женщин с неразвивающейся беременностью при применении комплексного подхода .73
4.1. Морфологическая картина эндометрия у пациенток с неразвивающейся беременностью в анамнезе после проведения ультразвукового кавитационного орошения полости матки .73
4.2. Энергия низкочастотного ультразвука в восстановлении рецепторного поля эндометрия после неразвивающейся беременности 76
ГЛАВА 5. Комплексный подход в восстановлении эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности с использованием низкочастотного ультразвукового кавитационного орошения полости матки .80
5.1. Технологические особенности процедуры кавитационного ультразвукового орошения полости матки после неразвивающейся беременности и при хроническом эндометрите, ассоциированном с неразвивающейся беременностью 80
5.2. Прогнозирование эффективности однократного курса ультразвукового кавитационного орошения полости матки при хроническом эндометрите, ассоциированном с неразвивающейся беременностью 83
5.3. Алгоритм восстановления эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности 87
Заключение 91
Выводы 108
Практические рекомендации 109
Список сокращений 110
Список литературы .
- Особенности ведения пациенток с неразвивающейся беременностью в современных условиях
- Методы исследования
- Показатели иммунитета женщин с неразвивающейся беременностью при использовании стандартной терапии
- Энергия низкочастотного ультразвука в восстановлении рецепторного поля эндометрия после неразвивающейся беременности
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Неразвивающаяся беременность занимает доминирующее положение
в структуре репродуктивных потерь (Радзинский В.Е., 2006, Сидельникова
В.М., 2007). Частота самопроизвольного прерывания беременности в России
достаточно высока – от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей,
при этом около 50% выкидышей приходится на долю привычного
невынашивания беременности (Радзинский В.Е., 2009; Модина М.А., 2009;
Богданова Г.С., 2012). Актуальность этой проблемы связана не только c
масштабами репродуктивных потерь, но и с неблагоприятным
репродуктивным прогнозом – в 27,4% случаях после перенесенной неразвивающейся беременности отмечается привычное невынашивание (Доброхотова Ю.Э., 2010; Меньшенина Т.А., 2012).
Мировым сообществом акушеров-гинекологов принята научная
концепция, согласно которой каждый случай неразвивающейся
беременности принято ассоциировать с хроническим эндометритом (XVIIIFIGO Congress of Gynecology and Obstetrics: Kuala Lumpur, Malaysia, 2006).
Поражение эндометрия при хроническом эндометрите
сопровождается развитием рецепторной недостаточности, снижается чувствительность слизистой оболочки матки к стероидам, отмечается неполноценность циклических превращений эндометрия (Dahmoun M., Boman K, 2009; Hirama Y., Ochiai K., 2010; Mote P.A., Balleine R.L., 2011). Это может привести к нарушению процессов имплантации.
Гиперфункция Th-1 может вести к развитию избыточно выраженных воспалительных реакций в эндометрии даже в условиях низкой концентрации, а особенно при персистенции инфекционного агента, что нарушает нормальные межклеточные взаимодействия и может служить причиной неполноценной имплантации (Сухих Г.Т., Шуршалина А.В., 2010).
Степень разработанности темы исследования
Трудности медикаментозного лечения больных с хроническим эндометритом обусловили поиск новых технологий лечения данного заболевания. В этой связи наше внимание привлекла возможность использования в терапии хронического эндометрита орошения полости матки физиологическим раствором, кавитированным ультразвуком низкой частоты. Метод основан на значительной биологической потенции ультразвуковых колебаний. Бактерицидный эффект низкочастотного ультразвука объясняют кавитационным воздействием микрополостей озвученной среды на стенку бактерий, что приводит к ее тепловому и механическому повреждению. Противовоспалительный эффект связан с сокращением в 2-3 раза фазы гидратации раневого процесса, снижения микробной контаминации и улучшения микроциркуляции (Спирина Ю.В., 2009; Serena T.Lee S.K, Lam K, Attar P, Meneses P, Ennis W., 2009).
Вышеизложенные эффекты низкочастотного ультразвука, а так же внушительный опыт использования данного метода для лечения раневой
инфекции и хронических воспалительных процессов определил наш научный
интерес в изучении возможностей применения энергии ультразвуковых
колебаний для восстановления морфологической структуры и
функциональной активности эндометрия после прерывания
неразвивающейся беременности.
Цель работы – улучшение результатов восстановления эндометрия
после прерывания неразвивающейся беременности на основе применения
комплексного подхода с использованием метода ультразвукового
кавитационного орошения полости матки.
Задачи исследования
-
Изучить клинические особенности течения хронического эндометрита у пациенток после неразвивающейся беременности.
-
Оценить особенности системного и локального иммунитета, микробиоты половых путей у женщин с неразвивающейся беременностью в динамике терапии с использованием кавитационного орошения полости матки.
-
Установить особенности влияния ультразвукового орошения полости матки на морфофункциональное состояние и рецепторный аппарат эндометрия.
-
Разработать и внедрить комплексный подход к ведению пациенток после неразвивающейся беременности с использованием внутриматочного кавитационного орошения в сравнении с традиционной терапией.
Научная новизна исследования
Изучено воздействие энергии низкочастотного ультразвука на рецепторное поле эндометрия, которое заключается в увеличении до нормальных значений уровня экспрессии стромального и железистого пула рецепторов к прогестерону и повышении экспрессии рецепторов к эстрадиолу-альфа в железах эндометрия.
Установлено, что для женщин после прерывания замершей беременности характерен системный воспалительный ответ, проявляющийся повышенным содержанием в периферической крови провоспалительных цитокинов, с последующей активацией локального апоптоза в эндометрии и снижением функционального состояния его рецепторного аппарата.
На основании изучения иммунологических, бактериологических показателей, гистологической и ультразвуковой картины эндометрия разработана математическая модель прогноза эффективности однократного курса ультразвуковой кавитационной терапии в лечении хронического эндометрита (патент № 2506593 от 10.02.2014).
Комплексный подход к ведению пациенток после прерывания неразвивающейся беременности с использованием метода кавитационного орошения полости матки приводит к нормализации морфофункциональной структуры и рецепторного аппарата эндометрия, снижению локального уровня апоптоза и первичных медиаторов воспалительного ответа.
Теоретическая и практическая значимость
Разработан и научно обоснован комплексный подход восстановления эндометрия у женщин после прерывания неразвивающейся беременности и при хроническом эндометрите.
Предложена модель прогнозирования эффективности однократного курса кавитационного орошения полости матки для восстановления эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности.
Методология и методы исследования
Для решения поставленных задач исследование проводилось в два
этапа. На первом этапе в ходе проспективного сравнительного исследования
изучались особенности общего популяционного состава лимфоцитов,
факторов роста и цитокинов, а так локального иммунитета в эндометрии,
состояние микробиоты половых путей и иммуногистохимические
исследования рецепторного аппарата эндометрия
В дальнейшем пациентки с неразвивающейся беременностью слепым
методом были разделены на две группы, в которых для восстановления
эндометрия применялось или не применялось низкочастотное
ультразвуковое кавитационное орошение полости матки.
Положения, выносимые на защиту
-
Применение в комплексной терапии хронического эндометрита ультразвукового кавитационного орошения полости матки нормализует функциональную активность клеток иммунной системы, восстанавливает морфологическую структуру эндометрия, локальные реакции апоптоза, пролиферации и рецепторное поле эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности.
-
Применение разработанного комплексного подхода в терапии хронического эндометрита с применением ультразвукового кавитационного орошения полости матки позволяет эффективно реабилитировать пациенток с неразвивающейся беременностью в анамнезе.
Степень достоверности результатов и апробация материалов диссертации
О достоверности результатов исследования свидетельствуют большая выборка клинического материала, широкий спектр методов исследования, логически выстроенный дизайн исследования, применение современных методов статистической обработки материала и аргументированный анализ полученных результатов.
Основные положения диссертации представлены на международных
конгрессах: VI Международный конгресс по репродуктивной медицине
Казахстанской Ассоциации Репродуктивной Медицины «Современные
подходы к лечению бесплодия. ВРТ: настоящее и будущее». Алматы 7-8
ноября 2014 г., отечественных конгрессах, в том числе с международным
участием: VI Общероссийский семинар «Репродуктивный потенциал России:
версии и контраверсии», Сочи, 7 – 10 сентября 2013 г., Научно-практическая
конференция с международным участием «Нерешенные вопросы
акушерства, гинекологии и перинатологии», Екатеринбург, 14-15 октября 2014 г.: гран-при на конкурсе молодых ученых «Перинатология глазами молодых», I Общероссийская конференция с международным участием «Перинатальная медицина: от предгравидарной подготовки к здоровому материнству и детству», Санкт-Петербург 9–11 декабря 2014 года,
Общероссийская школа «Замершая беременность: от проблем к решениям» в рамках конгрессов: II Общероссийский научно-практический семинар «Репродуктивный потенциал России: уральские чтения», Екатеринбург 23-25 апреля 2015 г., «Ранние сроки беременности. Проблемы ВРТ», Москва, РУДН, 21-23 мая 2015 г.
Основные положения диссертации обсуждены на заседании Ученого Совета ФГБУ «Уральский НИИ ОММ» МЗ РФ 9 июня 2015 года.
Внедрение результатов исследования
-
Комплексный подход к восстановлению эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности с использованием низкочастотного ультразвукового кавитационного орошения полости матки внедрен в клиниках ФГБУ «Уральского НИИ Охраны материнства и младенчества» МЗ РФ, гинекологического отделения ГКБ №7, медицинского центра «Гармония», медицинского центра «Женская клиника».
-
Патент на изобретение «Прогнозирование эффективности использования однократного курса ультразвукового кавитационного орошения полости матки у женщин с хроническим эндометритом»№ 2506593 от 10.02.2014., «Способ оценки локального иммунитета эндометрия» № 2519125 от 11.04.2014.
Публикации по теме диссертации
По теме работы опубликовано 20 научных трудов, из них 8 работ опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней докторов и кандидатов наук.
Личный вклад автора
Основная идея, планирование научной работы, включая
формулировку рабочей гипотезы, методологии, дизайна и общей концепции
диссертационного исследования проводились автором лично. Этому
предшествовал литературный поиск в базах отечественных и зарубежных
источников литературы, осуществленный автором лично. Все лечебные
мероприятия у пациенток с неразвивающейся беременностью в том числе,
вакуум-аспирация плодного яйца и курсы ультразвукового кавитационного
орошения полости матки, а так же морфометрические и
иммуногистохимические исследования эндометрия произведены лично автором. Формирование базы данных, статистическая обработка и анализ полученных результатов исследования, написание и оформление рукописи диссертации проводилось лично соискателем.
Объем и структура диссертации
Особенности ведения пациенток с неразвивающейся беременностью в современных условиях
Проблема репродуктивных потерь остается одной из наиболее актуальных в современном акушерстве [64,75]. Частота самопроизвольного прерывания беременности в России достаточно высока – от 15 до 23% всех зарегистрированных беременностей, при этом около 50% выкидышей приходится на долю привычного невынашивания беременности [76,78].
Неразвивающаяся беременность (замершая беременность, несостоявшийся выкидыш, missed abortion) означает гибель эмбриона (плода) без клинических признаков выкидыша. Причины замершей беременности многочисленны и нередко комплексны.
Хромосомные аномалии у партнеров, пожалуй, единственная не вызывающая сомнений причина неразвивающейся беременности. Гибель эмбриона может быть обусловлена патологическим развитием зиготы, эмбриона, плода или структурными нарушениями в генетической программе развития плаценты. В наблюдениях спонтанных выкидышей, обусловленных хромосомной патологией, весьма характерны различные нарушения развития эмбриона вплоть до его полного отсутствия [76,78,82].
Особая роль в этиологии неразвивающейся беременности принадлежит хромосомным аберрациям. Основное число эмбрионов с аберрантным кариотипом умирают в первые недели беременности. Так, в первые 6-7 недель беременности аномальный кариотип имеют 60-75 % абортусов, в 12-47 недель -20-25%, 17-28 недель - только 2-7 %. Среди хромосомных аббераций у абортусов 45-55 % составляют аутосомные трисомии, 20-30 % - моносомия 45X0, 15-20 % -триплоидия и 5 % - тетраплоидия [110,112].
Аутосомная трисомия ответственна более чем за половину патологических кариотипов. При этом, как правило, эмбрион отсутствует или имеет множественные пороки развития; хорионическая полость пустая и маленькая. Большинство аутосомных трисомий являются результатом отсутствия расхождения хромосом во время первого митотического деления ооцита, причем частота этого явления возрастает с возрастом матери. Следует отметить, что возраст матери не имеет решающего значения для других хромосомных аномалий, являющихся причиной остановки развития беременности [136,39].
В 20-25 % наблюдений с патологией кариотипа имеет место моносомия. Моносомия X вызывает аплазию эмбриона, от которого нередко сохраняется лишь остаток пуповинного тяжа или же сохранившийся эмбрион находится в состоянии выраженной водянки. При моносомии 98 % беременностей заканчиваются выкидышем и только 2% - родами ребенка с синдромом Тернера [122].
Триплоидия и тетраплоидия встречаются с умеренной частотой, но те случаи триплоидии, при которых имеет место двойной родительский компонент, обычно приводят к частичному пузырному заносу, клинически проявляющему себя в более поздние сроки беременности.
Важной структурной патологией хромосом является транслокация (2-10%), которая может передаваться одним из родителей - сбалансированным носителем. Сбалансированную (компенсированную) транслокацию следует подозревать в тех случаях, когда в анамнезе у супругов есть указания на повторные неразвивающиеся беременности или самопроизвольные выкидыши. Среди прочих видов нарушений кариотипа - различные формы мозаицизма, двойные трисомий и другая редкая патология [85].
Хромосомная патология человека зависит не только от интенсивности мутационного процесса, но и от эффективности отбора. С возрастом отбор ослабевает, поэтому чаще встречаются аномалии развития. Среди всех неразвивающихся беременностей 60% обусловлены бластопатиями и связаны главным образом с хромосомными аномалиями или пороками развития, вызванными неблагоприятными внешними факторами. Бластопатии, приводящие к смерти зародыша в первые недели беременности, классифицируются следующим образом [85, 66, 65, 68].
В 9,3 % наблюдений имеют место изменения, затрагивающие весь эмбрион и тем самым приводящие к его смерти.
Эмбриопатии чаще проявляются врожденными пороками, обычно в виде грубых нарушений развития эмбриона. Однако часть эмбриопатии также может вызвать внутриутробную смерть эмбриона (плода) [136].
В числе причин неразвивающейся беременности следует выделить эндокринные факторы - нарушение образования и гипофункцию желтого тела, связанную с дефицитом прогестерона и слабую децидуализацию стромы эндометрия. Развитие ранних этапов беременности (имплантация и плацентация) осуществляется путем тесного взаимодействия погружающейся бластоцисты, а затем - хориального мешка с окружающим цитотрофобластическим щитом, с децидуализированным или гравидарным эндометрием. То есть процессы цитотрофобластической инвазии и перестройки стромальных клеток эндометрия в децидуальные тесно сопряжены [98,99,100].
Децидуальные клетки принимают участие в обеспечении питания эмбриона, предотвращения иммунологического отторжения, продукции гормонов и осуществлении местного гомеостаза [128,113]. Вместе с тем, остается неясной роль децидуальных клеток в отношении цитотрофобластической инвазии, несмотря на преобладающее мнение о сдерживающем эффекте децидуализации на глубину проникновения цитотрофобласта в эндометрий [117,85].
Неполная или слабая инвазия цитотрофобласта в прилежащий эндометрий способствует уменьшению числа и объема гестационных изменений маточно-плацентарных артерий и снижению маточно-плацентарного кровообращения. Следствием этого может явиться смерть эмбриона и отслойка трофобласта [128,98].
Недостаточность первой волны инвазии цитотрофобласта нередко сочетается с хромосомными аномалиями, что является следствием дефекта ответственного за этот процесс гена либо нарушения общей генетической программы развития эмбриона и плаценты [65,66].
Не при всех эндокринных заболеваниях наблюдается внутриутробная смерть эмбриона (плода). Гиперандрогения (синдром Штейна - Левенталя, адреногенитальный синдром), гипо- и гиперфункция щитовидной железы способствуют недостаточной подготовке эндометрия к беременности и неполноценной имплантации плодного яйца, что требует проведения специфической гормональной коррекции. Нередко смерть эмбриона (плода) возникает при наличии сахарного диабета у матери, что диктует необходимость подготовки к планируемой беременности [82, 66,68].
Методы исследования
С целью фиксации и пермеабилизации клеток добавляли 100 мкл формальдегид-содержащего фиксирующего раствора Cytofix/Cytoperm. Инкубировали 20 мин при комнатной температуре в темноте, центрифугировали 5 мин при 500 g и удаляли супернатант. Добавляли 1 мл раствора Perm/Wash, содержащий сапонин, инкубировали 10 мин при комнатной температуре в темноте, центрифугировали 5 мин при 500 g и удаляли супернатант. Для окрашивания внутриклеточных цитокинов добавляли 4 мкл моноклональных антител к цитокинам IFN--FITC/IL-4-PE, инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки отмывали в 1 мл раствора Perm/Wash, ресуспендировали в Cell FIX и анализировали на проточном цитометре с использованием программного обеспечения «Cell Quest».
Интенсивность реакций апоптоза в мононуклеарах крови и биоптате эндометрия оценивали по одновременному связыванию клетками двух маркеров – аннексина V (AnV) и пропидиум йодида (PI) с помощью набора реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I («BD Pharmingem», США) методом проточной цитометрии в программе «CELL Quest». В каждом образце анализировали 10000 событий. Результаты выражали в процентах от общего числа клеток. Аннексин V применяли для выявления лимфоцитов, вступивших в апоптоз (AnV+-клетки). Пропидиум йодид использовали в качестве маркера жизнеспособности клеток (AnV-PI--клетки) и клеточного некроза (AnV-PI+-клетки). Забор материала ткани эндометрия осуществляли методом пайпель-биопсии на 7-9-й день менструального цикла до и после терапевтического воздействия.
Биоптат эндометрия путем механического измельчения доводили до гомогенизированного состояния, из полученного гомогената на градиенте плотности выделяли фракцию мононуклеаров.
Содержание медиаторов межклеточного взаимодействия в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа согласно рекомендациям производителей реагентов: -уровень про- и противовоспалительных цитокинов (IFN-, IL-6, IL-8, TNF-,IL-4 – с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия); - концентрацию С-реактивного протеина (CRP)– с использованием реактивов фирмы «Biomerica» (США). - содержание p-53, Bcl-2 – при помощи тест-систем «Bender MedSystems» (Австрия). Детекцию результатов исследования осуществляли на иммуноферментном анализаторе «Multiskan МСС/340» фирмы «Labsystems» (Финляндия). Cтатистическую обработку результатов исследований проводили с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel» (2007) и «Statistica for Windows 6.0» (StatSoft, США). В случае подчинения распределения признака закону нормального распределения данные представляли в виде средней величины (М) и стандартной ошибки средней (m). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в независимых группах осуществляли с использованием процедуры однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). При отклонении распределения признака от закона нормального распределения, данные представляли в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей, Р25-Р75). Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков осуществляли с помощью непараметрического критерия Краскела-Уоллиса (Kruskel-Wallis),при отклонении нулевой гипотезы в ходе анализа проводили попарное сравнение групп. Проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий количественных признаков в зависимых группах (до и после лечения) осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона. Для показателей, характеризующих качественные признаки, указывали абсолютное значение и относительную величину в процентах, проверку статистических гипотез осуществляли с использованием критерия хи-квадрат (2). Критический уровень значимости различий (p), при котором нулевая гипотеза об отсутствии различий отвергалась и принималась альтернативная, устанавливали равным 0,025 (критерий Краскела-Уоллиса) и p 0,05 (критерий Вилкоксона).
Направление признаков определяли методом корреляционного анализа с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r).
Разработка прогностической модели проводилась с использованием пакета прикладных программ «Квазар» [42,161].При помощи общего дискриминантного анализа, который дает возможность по имеющейся (обучающей) выборке объектов, характеризующихся совокупностью показателей с наибольшим относительным информационным весом, строить дискриминантные функции (решающие правила), наилучшим образом разделяющие объекты обучающей выборки и позволяющие относить каждый новый объект к тому или иному классу (метод распознавания образов) [12,162].
Для определения эффективности прогностических критериев рассчитывали показатели чувствительности (процентное выражение частоты истинноположительных (ИП) результатов у больных) и специфичности (процентное выражение частоты истинноотрицательных (ИО) результатов у здоровых) разработанных способов: чувствительность = (ИП/больные)100%; специфичность = (ИО/здоровые) 100%. Эффективность разработанных способов прогнозирования выражали отношением истинных (соответствующих состоянию обследуемых пациентов) результатов тестов к общему числу полученных результатов: Эффективность = (ИП+ИО)/(ИП+ЛП+ИО+ЛО) 100%, где ЛП – ложноположительные результаты (количество здоровых, имеющих положительный результат); ЛО – ложноотрицательные результаты (количество больных, имеющих отрицательный результат).
Проверку устойчивости и работоспособности математических моделей осуществляли на независимой экзаменационной выборке, состоявшей из 28 женщин с неразвивающейся беременностью или хроническим эндометритом, наблюдавшихся в ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России.
Показатели иммунитета женщин с неразвивающейся беременностью при использовании стандартной терапии
Согласно настоящему исследованию у всех женщин с неразвивающейся беременностью имело место повышение спонтанного уровня Т-лимфоцитов, экспрессирующих провоспалительные (IFN-) и регуляторные (IL-4) цитокины, что указывает на избыточную продукцию внутриклеточных факторов, опосредующих, как Th1-, так и Th2-путь иммунного ответа. С другой стороны, значительное увеличение содержаниеCD3+IL-4+-клеток в условиях стимуляции, свидетельствует о включение защитных механизмов, направленных на подавление клеточно-опосредованного иммунного ответа. Тем не менее, снижение индекса поляризации цитокин-продуцирующих клеток (CD3+IFN-+/CD3+IL-4+) индуцированными лимфоцитами, отражало снижение функционального резерва иммунокомпетентных клеток.
Согласно полученным результатам исследования, на воспалительную направленность клеточных реакций у женщин с неразвивающейся беременностью указывало повышение продукции провоспалительных медиаторов TNF-, IL-8, а также С-реактивного протеина, что согласуется с данными ряда отечественных и зарубежных авторов [15,92,71,118].Однако в нашем исследовании концентрации IFN-оставались низкими, вероятно, за счет цитотоксической реакции Т-лимфоцитов, на опосредованный антителами лизис инфицированных клеток Т-лимфоцитами, макрофагами, полиморфно-ядерными лейкоцитами. Следовательно, повышение продукции TNF-, IL-8 и CRP является следствием стимуляции макрофагов и нейтрофилов эндотоксином грамотрицательных бактерий к продукции [5].
Повышенное содержание клеток, находящихся на стадии некроза и снижение абсолютного количества CD8+-лимфоцитов, экспрессирующих маркер готовности клеток к апоптозу, подтверждало наличие воспалительного процесса у женщин, что согласуется с данными ряда отечественных и зарубежных авторов [7,63,69,74].
В отличие от пациенток с неразвивающейся беременностью, при развитии у женщин хронического эндометрита изменения в продукции внутриклеточных цитокинов были менее выражены: регистрировалось только повышение спонтанного уровня CD3+IL-4+-клеток, обладающих противовоспалительной активностью. Однако снижение концентрации IFN- сопровождалось увеличением содержания всех провоспалительных медиаторов, включая повышение синтеза IL-6. Низкочастотный ультразвук обладает выраженным бактерицидным действием [4,30]. Считается, что основной фактор обуславливающий гибель бактерий, вирусов и грибов в ультразвуковом поле – это кавитация.
Бактерицидный эффект низкочастотного ультразвука объясняется также повреждающим действием самих ультразвуковых волн на клеточную мембрану микроорганизмов, разрывами ее оболочки, набуханием и последующем их разрушением и окислительному действию кислорода, который активизируется ультразвуком. Адаптационные возможности микрофлоры к действию низкочастотного ультразвука очень ограничены или совсем отсутствуют. В результате ультразвуковой обработки флора частично погибает, остальная меняет свои культуральные свойства [4,116,139].
После проведения кавитационного орошения полости матки у всех женщин с неразвивающейся беременностью и пациенток с хроническим эндометритом восстановилась нормальная микрофлора половых путей. Количество облигатных анаэробных микроорганизмов статистически значимо снижалось. Наиболее чувствительными к воздействию 101 низкочастотного ультразвука явились бактерии-ассоцианты бактериального вагиноза– Gardnerella vaginalis/ Prevotella bivia/ Porphyromonas spp., Eubacterium spp. и. и Ureaplasma (urealyticum+parvum).
При стандартной схеме лечения у женщин с неразвивающейся беременностью сохранялся дисбаланс вагинальной микробиоты. Качественный и количественный состав микроорганизмов не изменяется. Применение комплексной терапии у женщин с неразвивающейся беременностью вызывало статистически значимое снижение процентного содержания В-клеток, а также цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD95. При этом достоверно уменьшалось общее количество мононуклеаров, вступивших в апоптоз, в том числе, находящихся на его поздней стадии. Снижалась концентрация провоспалительных медиаторов IL-6 и CRP относительно первоначального уровня.
Увеличивалось, сниженное до лечения, значение индекса поляризации цитокин-продуцирующих лимфоцитов при стимуляции до показателей условно здоровых женщин. Несмотря на отсутствие значимых различий в некоторых показателях иммунитета до и после проведенной терапии у женщин с неразвивающейся беременностью повышенная спонтанная продукция внутриклеточных цитокиновIL-4 и IFN-, снижалась до уровня условно здоровых женщин. Уменьшалось количество индуцированных CD3+IL-4+ -клеток до значений группы сравнения. Установлено, что проведение комплексной терапии не оказывало существенного влияние на продукцию некоторых цитокинов и медиаторов: содержание сывороточного IFN- у женщин с неразвивающейся беременностью сохранялось на низком уровне, а концентрация IL-8 и TNF- статистически значимо превышала параметры группы сравнения.
Энергия низкочастотного ультразвука в восстановлении рецепторного поля эндометрия после неразвивающейся беременности
Статистически значимых различий в гистологической картине условно здоровых женщин не выявлено (p 0,05).
В сравнении с этими данными, во второй группе пациенток с неразвивающейся беременностью, которым проводилась стандартная терапия без кавитационного орошения полости матки, гистологическая картина ранней стадии фазы пролиферации без признаков стромальной лимфоидной инфильтрации отмечалась только в 25,0% случаев, картина эпителия желез эндометрия в фазе пролиферации со стромальной лимфоидной реакцией наблюдалась в 12,5% случаев, децидуализация стромы эндометрия наблюдалась в 6,25% случаев. Гистологическая картина атрофического эндометрита выявлена у двух пациенток (6,25%), кистозного эндометрита – у четырех пациенток (12,5%), в 37,5% случаев наблюдения выявлена гистологическая картина гипертрофического эндометрита.
После проведенной стандартной терапии у женщин второй группы достоверно чаще, чем в первой группе пациенток, в лечении которых применялось ультразвуковое кавитационное орошение полости матки, регистрировался гипертрофический эндометрит (p 0,0001). В третьей группе женщин с хроническим эндометритом после ультразвукового орошения полости матки частота восстановления гистологической картины до полного соответствия фазе менструального цикла без признаков воспалительной реакции стромы составила всего 31,8%. В 22,7% случаев отмечались лимфоидная инфильтрация стромы, картина атрофического эндометрита выявлена в 13,6% наблюдений, картина кистозного эндометрита в 9,1% случаев, гипертрофический эндометрит сохранялся у 22,7% женщин. Несмотря на отсутствие значимых различий в признаках воспаления эндометрия относительно группы контроля, гипертрофический эндометрит у женщин третьей группы после проведенной терапии сохранялся значительно чаще, чем у пациенток первой группы (p 0,01).
В контрольной группе большинство женщин демонстрировали гистологическую картину эпителия желез в фазе ранней пролиферации (83,3%), у остальных пациенток на фоне соответствия развития желез эндометрия фазе менструального цикла отмечалась единичная лимфоидная инфильтрация стромы.
Таким образом, гистологическая картина, соответствующая ранней стадии фазы пролиферации без признаков воспалительной реакции стромы отмечалась в 65,8% в группе женщин, которым проводилось кавитационное орошение полости матки сразу после прерывания неразвивающейся беременности. Это значительно превышает соответствующие результаты в группе сравнения, где орошение не применялось. В этой группе только 25% образцов эндометрия соответствовали фазе пролиферации без стромальной лимфоидной реакции, а гистологическая картина эндометрита в следующем цикле после аспирации плодного яйца верифицирована в 56% случаев.
Для оценки значения фактора времени начала терапии выделена группа небеременных пациенток, уже страдающих хроническим эндометритом на фоне привычного невынашивания беременности, терапия кавитационным орошением которым проводилась, таким образом, отсрочено. В этой группе удалось добиться восстановления морфологической структуры эндометрия с хронологическим соответствием его фазе пролиферации без воспалительной реакции стромы у 31,8% пациенток. Это значительно выше, чем в группе пациенток, которым орошение полости матки не проводилось – 25,0% (рисунок 6). Положительная динамика, заключающаяся в исчезновении перигландулярных и периваскулярных лимфогистиоцитарных воспалительных инфильтратов с сохранением незначительной лимфоидной инфильтрацией стромы, отмечена еще у 20,7% женщин.
Таким образом, эффективность метода в группе пациенток с хроническим эндометритом составила 54,5%, что значительно ниже, чем в группе женщин, где лечение начато сразу после вакуум – аспирации плодного яйца – 65,8 %.Таким образом, раннее начало ультразвуковой кавитационной терапии увеличивает возможности репарации эндометрия после прерывания неразвивающейся беременности.
Энергия низкочастотного ультразвука в восстановлении рецепторного поля эндометрия после неразвивающейся беременности Для оценки механизмов реализации лечебного воздействия ульразвукового кавитационного орошения полости матки на эндометрий методом иммуногистохимии определялась экспрессия рецепторов к эстрадиолу – альфа (ER-) и рецепторов к прогестерону (PR), а так же маркера пролиферации – Кi67 в динамике терапии (рисунок 7). Рисунок 7 - Уровень экспрессии ER, PR и Ki67 в стромальных клетках и эпителии желез эндометрия в группах наблюдения - p 0.05 в группах сравнения; -р 0.01 в группах сравнения; - p 0.05 с контролем; -p 0.01 с контролем.
Выявлена потенция кавитированых жидких сред в восстановлении уровня экспрессии ER преимущественно в железах эндометрия до уровня, сопоставимого с контрольными значениями. Стромальный пул ER на фоне орошения достоверно не изменялся. Это может объясняться более поверхностным воздействием на ткани ультразвуковых волн, однако здесь требуются дальнейшие исследования. В первой группе пациенток, которым проводилось кавитационное орошение полости матки в железах эндометрия определялась достоверно более высокая экспрессия ER 188,54±1,97 баллов - по сравнению с 177,01±5,29 баллами (р=0,024) во второй группе пациенток, которым данная процедура не проводилась.
Уровень экспрессии ER в строме эндометрия статистически значимо не отличался в группах наблюдения, но был значимо ниже контрольных значений – в первой группе 135,9±9,94 балла против 176,8±6,12 баллов в контроле (р=0,0081), во второй группе 147,02±7,14 балла против 176,8±6,12 баллов в контроле (р=0,027).
Отмечался статистически значимо более высокий уровень экспрессии PR в строме и в железах эндометрия в первой группе женщин, получавших кавитационное орошение полости матки после прерывания неразвивающейся беременности. Экспрессия PR в строме составила в первой группе 159,09±4,82 баллов против 143,01±8,19 балла во второй группе (р=0,012). Экспрессия PR в железах эндометрия составила 196,18±1,94 баллов в первой группе против 181,66±3,18 балла во второй группе (р=0,0037).
Следует отметить, что значения экспрессии PR в строме и на железах в первой группе статистически значимо не отличались от контрольных значений.
Уровень экспрессии Ki67 в строме и железах был статистически значимо выше в группе женщин, не получавших кавитационного орошения полости матки. Экспрессия Ki67 в строме составила в первой группе 107,45±2,93 баллов, во второй группе 115,66±3,86 баллов (р=0,041), экспрессия Ki67 в железах составила соответственно 145,63±5,43 баллов против 168,33±14,59 баллов, что значительно выше контрольных показателей 132,51±4,25 балла (р=0,006). Следует отметить, что во всех группах наблюдения в фазу пролиферации уровень экспрессии Ki67 в железах эндометрия выше, чем в строме.
Таким образом, уровень экспрессии маркера пролиферации Ki67 в строме и железах эндометрия был статистически значимо выше в группе пациенток, не получавших кавитационного ультразвукового орошения полости матки. Это пациентки, страдающие хроническим эндометритом. Роль хронического воспаления в генезе повышения пролиферативной активности желез и стромы эндометрия подчеркивалась многими исследователями [2,6,15]. Хронический воспалительный процесс на уровне паракринной регуляции приводит повышению синтеза факторов роста (TFR-, EGF, FGF,VEGF и др.), усиливает межклеточные и стромально-паренхиматозные нарушения, активирует процессы неоангиогенеза, что стимулируют пролиферацию клеток и может способствовать развитию опухолевого процесса. Преимущественно автономный путь регуляции пролиферации при хроническом воспалении подтверждается более низкой экспрессией эстрогеновых рецепторов во второй группе наблюдения.
В целом, хронический воспалительный процесс в железистых и стромальных клетках функционального слоя эндометрия способствует снижению уровня экспрессии рецепторов прогестерона и в меньшей степени – рецепторов эстрогенов [86,121].
Таким образом, использование метода кавитационного орошения полости матки у женщин с неразвивающейся беременностью приводит к восстановлению эндометрия за счет нормализации его морфо-функциональной структуры, снижения локального уровня первичных медиаторов воспалительного ответа и восстановления рецепторного поля эндометрия.
Наилучших результатов в плане восстановления морфо-функциональной структуры эндометрия удалось добиться, используя метод в первом цикле после прерывания неразвивающейся беременности.