Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления об этиопатогенезе, клинике и лечении миомы матки (обзор литературы) 11-34
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования обследованных больных 35-43
ГЛАВА 3. Результаты исследования 44-80
3.1. Общеклиническое и гинекологическое обследование больных миомой атки позднего репродуктивного возраста 44-50
3.2. Клиническая характеристика больных миомой матки, прошедших предоперационную консервативную терапию 51-55
3.3. Результаты комплексного лечения у больных миомой матки позднего репродуктивного возраста 56-71
3.4. Иммуногистохимическая характеристика миоматозных узлов у больных позднего репродуктивного возраста 72-78
3.5. Морфофункциональные особенности эндометрия у больных с миомой матки позднего репродуктивного возраста 78-80
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 81-94
Выводы 95-96
Практические рекомендации 97
Список сокращений 98
Список литературы
- Клиническая характеристика больных миомой матки, прошедших предоперационную консервативную терапию
- Результаты комплексного лечения у больных миомой матки позднего репродуктивного возраста
- Иммуногистохимическая характеристика миоматозных узлов у больных позднего репродуктивного возраста
- Морфофункциональные особенности эндометрия у больных с миомой матки позднего репродуктивного возраста
Клиническая характеристика больных миомой матки, прошедших предоперационную консервативную терапию
До настоящего времени имеются разные взгляды на природу этого заболевания: истинная ли опухоль или так называемое опухолевидное образование, представляющее собой очаговый гиперпластический процесс миометрия («регенераторный пролиферат») [36].
Еще в 1979г. И.А. Яковлева и Б.Г. Кукутэ, проведя анализ пролиферативной активности миоцитов в миоматозных узлах, выявили, что в большинстве миоматозных узлов (они составляют около 75% от всех случаев) строма преобладает над паренхимой, а митотическая активность миоцитов практически равна 0 (митозы отсутствуют), зато в других узлах миомы (их около 25%) миогенные элементы более многочисленные, но не атипичные, и митотическая активность повышена [24,46,89,145].
По мнению авторов [10], именно вторая группа миом чаще клинически проявляет себя симптомом быстрого и множественного роста, что позволяет выделить два клинико-морфологических варианта: простую и пролиферирующую миому матки. В своих работах авторы [37] подтвердили целесообразность выделения этих двух вариантов и выработали клинико-морфологические критерии их диагностики (очаги неоваскуляризации с низкорезистентным и высокоскоростным кровотоком, выявленные методом цветового доплеровского картирования в узлах пролиферирующей миомы, и повышение пролиферативной активности миоцитов при иммуноморфологическом и плоидометрическом исследовании этих же узлов, в отличие от узлов простой миомы) [8,15,26].
По данным ряда клинико-морфологических исследований, простая миома матки является доброкачественной, неактивной, медленно растущей опухолью с преобладанием соединительно-тканных элементов, фенотипической трансформацией миоцитов и снижением кровотока в миометрии и миоматозных узлах [34,87,107]. Пролиферирующая миома матки является доброкачественной, активной, множественной, быстрорастущей опухолью с повышенным пролиферативным потенциалом и часто сопровождается пролиферативными процессами в эндометрии, опухолевидными образованиями, доброкачественными, и злокачественными опухолями яичников [32]. По мнению автора [26], пролиферирующие миомы матки встречаются у каждой четвертой больной. Миогенные элементы в пролиферирующих миомах не атипичны, но более многочисленны, чем в миомах без признаков пролиферации. В простых миомах митозы практически отсутствуют, а в пролиферирующих митотическая активность повышена. Исследователи считают, что выделение двух форм миомы матки по особенностям гистогенеза имеет большое практическое значение при выборе врачебной тактики.
Первое и наиболее важное открытие, позволившее по-новому взглянуть на природу лейомиомы, стало выявление у лейомиомы свойства моноклональности. Каждая моноклональная миома может ассоциироваться с различнымихромосомными транслокациями, дупликациями и делециями. Многие узлы миомы содержат цитогенетические отклонения, в то время как мышечная оболочка матки имеет нормальный кариотип - обычно они включают хромосомы 7, 12 и 14. Большинство мутаций появляется в генах, отвечающих за клеточный рост или ответственных за архитектурную транскрипцию [175]. Моноклональность доказывается гомозиготностью изоформ глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы в клетках миомы у гетерозиготных пациенток и также подтверждается исследованиями Х-связанного гена фосфоглицерокиназы различных клеток лейомиомы. Стало ясно, что миоматозный узел растет из одной клетки, а при наличии в одной матке нескольких узлов каждый из них развивается независимо друг от друга. Выделяют две теории образования клетки-предшественника миомы матки. Первая - онтогенетическая; вторая основывается на том, что вторичная соматическая мутация в нормальной клетке миометрия способствует образованию клетки-предшественника миомы матки.
Патофизиология миомы матки на сегодняшний день остается изученной не полностью. Миому матки принято считать гормонзависимой опухолью миометрия. Чаще миома возникает в репродуктивном возрасте, когда отмечается высокая гормональная активность яичников, и регрессирует после наступления менопаузы, когда быстро снижается уровень половых гормонов. Влияние стероидных гормонов лежит в основе теирии «клональной экспансии миомы». Узлы миомы восприимчивы к эстрогенам и прогестерону, но не отмечено увеличения концентрации циркулирующих гормонов в сыворотке крови.
Развитие опухолевых новообразований - результат ускоренной клеточной пролиферации, опережающей тормозящий эффект апоптоза. Доказано, что апоптоз приостанавливается в миомах матки [127]. Основным гормоном, оказывающим решающее значение в формировании и росте миомы матки, является прогестерон. Прогестерон вызывает стремительное увеличение экспрессии bcl-2 (основной маркер подавления апоптоза) в клетках миомы, достигая максимальной концентрации bcl-2 в секреторную фазу. Эстрогены лишь незначительно влияют на концентрацию bcl-2. Следовательно, прогестерон способен влиять на рост миомы посредством блокирования апоптоза, что приводит к увеличению интервала жизни клетки. В нормальном миометрии чрезмерного образования bcl-2 в присутствии прогестерона не отмечено. Иммуногистохимические исследования показали, что до 90% клеток пролиферирующих лейомиом матки содержат активные рецепторы прогестерона [5,12,13,73,128].
В миомах отмечен повышенный синтез ароматазы р450 [32,60]. В свете этого, на ряду с воздействием циркулирующих эстрогенов на ER, большое значение в потенциировании действия эстрогенов на миоциты может иметь местная конверсия циркулирующих андрогенов в эстрогены [106].
Кроме того, в патофизиологии роста миом было обнаружено синергичное взаимодействие эстрогеновой и прогестероновой стимуляций. Было также установлено возрастание количества PR в результате повышения количества эстрогенов. Исследование в искусственных условиях показало, что прогестерон активирует экспрессию эпидермального фактора роста, а эстрогены увеличивают также экспрессию его рецепторов [122].
PR класса А и В относятся к семейству ядерных рецепторов, которые при связывании с лигандом активируют транскрипцию [106]. Отличие структуры PR А от PR В незначительное, однако последние являются более сильными активаторами транскрипции и реализуют долгосрочные эффекты. PR А в большей степени отвечают за краткосрочные эффекты, а в определенных условиях могут быть вообще неактивны и выступать в качестве лигандзависимого репрессора для других стероидных рецепторов, в том числе PR В [122]. Ответ тканей зависит не только от типа поступающего СМПР, но и соотношения в них PR A:PR В.
При связывании СМПР с PR происходит конформация рецептора в активную форму, и он связывается с промоторным участком соответствующей ДНК. Это событие может активировать транскрипцию напрямую, и тогда СМПР действует как агонист прогестерона. Но иногда для проявления биологического эффекта к упомянутому дим еру должен присоединиться кофактор. Это может быть коактиватор, который усиливает процессы транскрипции [122], или косупрессор, который блокирует транскрипцию, и в результате реализуются антагонистические свойства СМПР [211,212].
В последнее время все больше внимания уделяется внутритканевым паракринным системам регуляции клеточного роста и дифференцировки.
Сначала появились данные о том, что содержание рецепторов к прогестерону в ткани миомы выше в 3-4 раза, а к эстрадиолу в 2 раза по сравнению с интактным миометрием [2]. Кроме того, в миометрии в равных количествах экспрессируются А и В типы рецепторов прогестерона. И вдобавок прогестерон связывается преимущественно с В типом, который в 40% наблюдается на поверхности миоматозных узлов [89].
Итогом последних исследований стало выявление в разных отделах женского полового тракта полипептидных факторов роста. Стало известно, что поддержание роста миомы осуществляется аутокриннопаракриновой регуляцией разных факторов роста утеротропного действия эстрогенов, а также способностью миомы на ранних этапах своего формирования к приобретению автономности за счет самостоятельной секреции этих факторов [90].
Результаты комплексного лечения у больных миомой матки позднего репродуктивного возраста
Для определения состояния шейки матки всем пациенткам производили расширенную кольпоскопию, забор мазков на онкоцитологическое исследование из экто- и эндоцервикса, исследование флоры из цервикального канала и влагалищного отделяемого. Кольпоскопия шейки матки проводилась по стандартной методике с помощью 3% раствора уксусной кислоты и 3% раствора Люголя на аппарате «Olympus» (Япония).
Магнитно-резонансная томография (МРТ) малого таза была проведена дважды до и после лечения на томографе со сверхпроводящим магнитом с полем 1 тесла (Т) и резонансной частотой для протонов 42 МГц («Magnetom Harmony», фирма «Siemens Medical Systems», ФРГ) по стандатрной методике.
При гистероскопии использовалосьоборудование фирмы «Karl Storz» (Германия), а в качестве расширяющей полость среды - стерильный изотонический раствор хлорида натрия (500-1000 мл) по стандартной методике.
В качестве анестезиологического пособия применяли эндотрахеальный внутривенный наркоз. Лапароскопическое обследование и лечение проводили с помощью оборудования фирмы KARLSTORZ (Германия). Операцию проводили под видеомониторным контролем. Гемостаз достигали биполярной коагуляцией.
Всех больных информировали о необходимости проведения хирургического лечения, целесообразности использования того или иного объема и доступа операции, возможных интра- и послеоперационных осложнениях, необходимости осуществления гемотрансфузий (по показаниям).
Длительность операции определялась как временной промежуток между началом выполнения хирургического разреза и наложением последнего шва на операционную рану. Интраоперационную кровопотерю при проведении лапаротомических и влагалищных операций рассчитывали гравиметрическим методом в варианте взвешивания материала, при проведении лапароскопических вмешательств - по разнице объема выведенной и введенной в брюшную полость жидкости. Дополнительную оценку кровопотери осуществляли на основе послеоперационных уровней гемоглобина и гематокрита.
У всех больных во время операции производился забор эндометрия для последующего гистологического исследования. Взятие образцов выполняли в сравниваемые фазы менструального цикла.
Массу удаленного макропрепарата определяли путем взвешивания. В послеоперационном периоде проводили динамический лабораторный контроль на основании клинических анализов крови, анализов мочи, гемостазиограммы и биохимических показателей крови, контрольного ультразвукового исследования. Комплексное морфологическое исследование Комплексное морфологическое исследование включало в себя следующие методы: гистологический и иммуногистохимический.
Морфологическое исследование макропрепаратов, удаленных в ходе операции, проводили в патологоанатомическом отделении ГКБ № 33 на базе кафедры патологической анатомии МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (зав. отделением - главный патологоанатом г. Москвы О.В. Зайратьянц).
Проведено комплексное гистологическое, иммуноморфологическое и морфологическое исследование удаленных миом и эндометрия в ходе проведенных операций после курса терапии СМРП (1 группа) и аГнРГ (2 группа) в сравнении с 10 лейомиомами после операций у женщин без предоперационной гормональной терапии (контрольная группа).
От 3 до 6 образцов ткани из разных участков каждой лейомиомы, а также аспираты эндометрия, полученные после гормонального лечения, фиксировали в 10 % нейтральном формалине и по общепринятой методике заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином, эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. В ходе иммуногистохимического исследования использовали 7 первичных моноклональных антител: к рецепторам эстрогенов (rabbit monoclonal antibody, IgG [SP1], Cerm, Spring Bioscience, USA), рецепторам прогестерона (rabbit monoclonal antibody, IgG [SP2], Cerm, Spring Bioscience, USA), маркеру пролиферации, ядерному белку Ki-67(mouse monoclonal antibody, IgGl [MM1], Leica, UK), маркеру митозов, ядерному белку фосфогистону H3(Phosphohistone НЗ [РННЗ], rabbit polyclonal antibody, Cell Marque, Inc., USA), маркеру апоптоза, активной (расщепленной) Kacna3e-3(apoptosis-related cysteine peptidase 3 [active], rabbit monoclonal antibody, IgG [E83-77], Nerm, GeneTex, Inc., USA), ингибитору апоптоза bcl-2(Bcl-2 [124], mouse monoclonal antibody, IgGl, Cell Marque, USA), индуктору апоптоза Bax (Bax-antibody [E63], rabbit monoclonal antibody, IgG, GeneTex, USA). Применяли систему детекции Novolink Polymer Detection System (Leica, UK) со стандартным контролем.
Использовали фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и специального реактива (диаминобензидина). Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы в участках локализации антигена. Для таких антигенов, как рецепторы к эстрогенам и прогестерону, Ki-67, фосфогистону НЗ - это ядра клеток, для других -цитоплазма (активная каспаза-3) и/или цитоплазма и ядра клеток (Вс1-2, Вах).
Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных специфических антител (путем их замены неиммунным реактивом - бычьей сывороткой) или специфических антигенов. Положительный контроль - с использованием гистологических препаратов рака молочной железы.
Для оценки экспрессии Ki-67, фосфогистона НЗ и активной каспазы-3 подсчитывали процент клеток с положительной реакцией ( на 1000 клеток в 10 репрезентативных полях зрения при х400). Результаты реакций с антителами к ER и PR, bcl-2 и Вах оценивали с помощью полуколичественного морфометрического метода, вычисляя коэффициенты экспрессии (КЭ) . КЭ рассчитывали для каждого наблюдения по формуле:
КЭ = Х(БхП)/100, где Б - интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П — процент окрашенных ядер или клеток для каждого значения Б (изучали по 1000 клеток в 10 полях зрения с наиболее выраженной реакцией при х 400).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ Windows 10 и MS Excel 2010 и Statistica 8. Достоверность отличий в группах определялась по t-критерию Стьюдента, различия считались достоверными при р 0,05. Корреляционные связи оценивались методом корреляции рангов Спирмена.
Иммуногистохимическая характеристика миоматозных узлов у больных позднего репродуктивного возраста
Также вызывает интерес клинический случай. Пациентка К., 43 года, поступила в клинику в экстренном порядке с жалобами на обильные кровяные выделения из половых путей.
Из анамнеза: обильные менструации последние 6 лет, Р-1 А-0. Лапароскопия, цистэктомия слева по поводу зрелой тератомы в 2011 г., ВМК (Мирена) с 2011 г. в связи с интрамуральным расположением двух узлов миомы (4 и 2 см) и аденомиозом. Гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание слизистой матки в марте 2013 г. Гистология: секреторный эндометрий. Жалобы: обильные болезненные менструации в течение 6 лет со снижением НЬ до 90 г/л. Размер матки по УЗИ: 70x87x75 мм, из задней стенки узел — общий размер 44x41 х42 мм, из передней стенки — узел 20 мм.
Начало приема улипристала ацетата в дозе 5 мг ежедневно с 25.04.13, кровотечение остановлено на 3-й день. 15.05.13 поступила вновь с болевым синдромом и скудными кровянистыми выделениями из половых путей. По данным УЗИ — интерстициально-субмукозный узел (тип II) — заподозрена миграция узла в сторону полости матки. Учитывая отсутствие репродуктивных планов пациентки в возрасте 43 лет, с минимально инвазивной целью несмотря на размер узла (40 мм) запланирована и проведена гистерорезекция интерстициально-субмукозного узла типа П. В два этапа произведена резекция узла полностью. Заключение: в течение 20 дней приема препарата произошла миграция узла.
Классический пример, описанный многими авторами был продемонстрирован у пациентки А., 48 лет. Из анамнеза: Р-3. А-8. В 2009 г.- ГРС субмукозного узла (подготовка аГнРГ). Жалобы: обильное маточное кровотечение. В течение 2-х лет менометроррагия. Размеры матки: 65x50x60 мм, множество узлов, исходящих из задней стенки, один из которых деформирует полость матки 30 мм. НЬ при поступлении - 84 г\л.
В этом разделе будут рассмотрены результаты комплексного гистологического, иммуноморфологического и морфологического исследований удаленных миоматозных узлов в ходе проведенных операций после курса терапии СМРП (1 группа) и аГнРГ (2 группа) в сравнении с 10 лейомиомами после операций у женщин без предоперационной гормональной терапии (контрольная группа).
Морфологическая характеристика узлов миомы (N=214): нами были выявлены следующие гистологические варианты миомы матки: Результаты гистологического исследования соответствовали выявленным молекулярно-биологическим изменениям. Они показали, что, несмотря на свойственный лейомиомам полиморфизм строения даже в пределах одного гистологического варианта (в частности, простых лейомиом, включенных в исследование) [19], в группе, получавших СМРП, были более выражены склероз и гиалиноз стромы и периваскулярных зон роста с сужением просвета артерий и редукцией микроциркуляторного русла, а также псевдокапсулы опухолей (рис.17). При этом, однако, не выявлялись нередкие для простых лейомиом обширные поля склероза и гиалиноза. 73
Кроме того, в сходных по строению участках лейомиом 1, 2 групп и группы сравнения обращал на себя внимание заметно меньший размер опухолевых лейомиоцитов и их ядер в опухолях 1 и 2 группы, что позволяет предположить уменьшение степени гипертрофии клеток лейомиом после курса терапии СМРП и аГнРГ.
По результатам иммуногистохимического исследования общей группы обследованных больных нами были получены следующие данные: Коэффициент пролиферация (Ki-67) и митотическая активность (Фг НЗ) клеток лейомиомы составили (N=60): Ki 67= 0,73±0,27; Фг Н3=0,12±0,11 и статистически значимо можно говорить об усилении показателей в сравнении с контрольной группой (N=10): Ki 67 - 0,37±0,19; Фг Н3=0,02±0,21. Выявлена тенденция к повышению экспрессии рецепторов nporecTepoHa(N=60): PR=81,1±7,9% (КЭ=1,74±0,21) по сравнению с контролем (N=10): PR= 67,4±3,3% (КЭ=1,58± 0,17). Частота апоптоза в клетках лейомиомы составило СЗ - 0,18±0,72% (N=60).
Иммуногистохимическое исследование групп, прошедших предоперационное гормональное лечение, продемонстрировало в лейомиомах 1 и 2 группы тенденцию к повышению экспрессии PR ядрами опухолевых лейомиоцитов при сохранении ER. В лейомиоме 1 группы PR экспрессировали 79,8±8,8% ядер клеток опухоли (КЭ=1,99±0,26), во 2 группе - PR экспрессировали 81,1±7,9% ядер клеток опухоли (КЭ=1,74±0,21), а в группе сравнения — только 67,4±3,3% (КЭ=1,58± 0,17). ER экспрессировало меньшее число ядер опухолевых лейомиоцитов, чем PR (рис.16).
Морфофункциональные особенности эндометрия у больных с миомой матки позднего репродуктивного возраста
Обнаруженная тенденция к повышению экспрессии PR клетками лейомиомы после терапии улипристалом и аГнРГ, возможно, представляет собой компенсаторный процесс. Несмотря на четырехкратное повышение активности процессов апоптоза клеток лейомиом в наблюдениях 1 группы, обнаружено лишь незначительное и статистически недостоверное снижение экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 и повышение — индуктора апоптоза Вах. В результате индекс Bax/bcl-2 увеличивается минимально, и необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизмов выраженной индукции апоптоза улипристалом.
Таким образом, молекулярно-биологические механизмы подавления роста и уменьшения размеров лейомиом под влиянием нового селективного модулятора PR улипристала ацетата заключаются в снижении пролиферативной и митотической активности клеток опухоли в сочетании с индукцией их апоптоза и нарушениями продукции экстрацеллюлярного матрикса, а также уменьшением степени их гипертрофии. Обнаруженная тенденция к повышению экспрессии PR опухолевыми клетками представляет собой, вероятно, компенсаторный процесс. Сохранение высокого уровня экспрессии bcl-2 в сочетании с незначительным повышением экспрессии Вах при выраженной индукции апоптоза позволяет предположить влияние улипристала на различные пути его регуляции.
Несмотря на ограниченное количество пациенток в исследовании, мы наблюдали значительно более высокую частоту возникновения апоптоза в клетках лейомиом, подвергнутых воздействию улипристала ацетата до операции в сравнении с лейомиомамипациенток, получавших лечение аГнРГ, а также лейомиомами без предоперационного гормонального лечения [41] . Апоптоз, вероятно, может являться важным, хотя и не единственным механизмом угнетающего действия СМРП на миому матки. Могут существовать другие факторы, например, уменьшение скорости кровотока в маточной артерии [9,198]. При изучении морфологических особенностей эндометрия больных миомой матки после терапии улипристалом в течение 13 нед отмечались изменения архитектоники железистого эпителия, включая кистозное расширение желез. В клетках эндометрия была усилена вакуолизация, встречались митозы и признаки апоптоза, выявлялись измененные сосуды стромы. Из 30 вошедших в исследование пациенток у 1 была простая гиперплазия эндометрия без атипии, а в 3 случаях — полипы эндометрия [42] . По аналогии с другими СМРП, улипристала ацетат индуцирует доброкачественные изменения эндометрия. Через полгода после лечения у всех пациенток описанные изменения слизистой полости матки исчезли. Не отмечалось признаков дисплазии или злокачественной трансформации.
Проведенное нами исследование продемонстрировало, что применение СМРП улипристала ацетата в дозировке 5 мг более эффективно, чем инъекции аГнРГ бусерелина ацетата один раз в месяц у пациенток с миомой матки в качестве предоперационной подготовки.
На основании анализа полученных нами новых данных и данных литературы, концепцию развития миомы матки можно представить следующим образом. Миоматозный узел растет в результате неправильного деления одной гладкомышечной клетки. Все клетки в узле являются идентичными. Моноклональная экспансия описана многими авторами [3,37,38,39,50,64,66,122,161].
Патогенез миомы матки включает звенья: клеточная пролиферация миометрия, апоптоз, склероз, фиброз. Опухолевый рост является следствием нарушения баланса между клеточной пролиферацией и апоптозом. Клетки миомы матки обладают значительно более высокой митотической активностью, чем клетки неизмененного миометрия. Ключевые факторы патогенеза миомы матки: половые стероидные гормоны — физиологические регуляторы клеточной пролиферации миометрия. В отличии от нормального миометрия миома матки содержит гораздо больше прогестероновых рецепторов, вследствие чего ткань миомы матки чрезвычайно чувствительна к эстрогенам и прогестерону. Прогестерон играет ключевую роль в контроле роста миомы так как является сильным митогеном (индуктором пролиферации). Стимуляция пролиферации в миоматозных узлах происходит в результате сочетанного действия эстрадиола и прогестерона. Поэтому предоперационное применение СМРП и аГнРГ патогенетически обосновано в качестве комплексного лечения миомы матки у женщин позднего репродуктивного периода.
Проведенное нами исследование способствовало повышению показателей репродуктивного здоровья женщин. Учитывая тот факт, что применение СМРП у женщин с нереализованной репродуктивной функцией приводит к значительному уменьшению размеров миомы, минимизируя объем проводимого оперативного лечения, снижая возможные интраоперационные риски, и в некоторых случаях, приводя к значительному уменьшению объема матки и узлов, возможно остановить развитие заболевания, что приведет к регрессу симптомов и сохранению репродуктивной функции. Применение СМРП может явиться предпосылкой для дальнейшего консервативного терапевтического воздействия в репродуктивном периоде.