Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Вагинальная атрофия в постменопаузе: клиническая картина, патогенез и терапия (обзор литературы) 11
1.1. Патогенез заболевания 11
1.2. Клиническая картина и диагностика 16
1.3. Микробиоценоз влагалища и локальный иммунитет при вагинальной атрофии 18
1.4. Профилактика и лечение вагинальной атрофии 22
1.5. Вопросы терминологии и безопасности локальной гормональной терапии. 30
1.6. Качество жизни женщин в постменопаузе 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1 Материалы исследования 39
2.2 Методы исследования
2.2.1 Общеклинические исследования 40
2.2.2 Оценка качества жизни, эмоционального благополучия и сексуальной функции 41
2.2.3 Индекс вагинального здоровья 43
2.2.4 Оценка интенсивности вагинальных симптомов по 5-ти бальной шкале (D. Barlow)
2.2.4 pH-метрия вагинального отделяемого 44
2.2.5 Индекс созревания эпителия влагалища 44
2.2.6 Микроскопическое исследование отделяемого влагалища 45
2.2.7 ПЦР диагностика микробиоценоза влагалища 45
2.2.8 Исследование профиля мРНК генов иммунного ответа в содержимом влагалища методом ОТ-ПЦР 46
2.2.9 Ультразвуковое исследование органов малого таза
2.2.10 Маммография 47
2.2.11 PAP-тест 48
Согласно полученным результатам РАР-теста у пациенток в группах лечения отсутствовали противопоказания для назначения локальной МГТ. 49
2.2.12 Методы статистической обработки полученных данных 49
Глава 3. Данные собственных исследований 51
3.1 Клиническо-анамнестическая характеристика обследуемых женщин в постменопаузе 51
3.2 Состояния слизистой влагалища у женщин в постменопаузе 58
3.3 Микробиоценоз влагалища у женщин в постменопаузе 58
3.2 Результаты рН-метрии у женщин в постменопаузе. 77
3.4 Локальный иммунитет слизистой влагалища у женщин в постменопаузе . 80
3.5 Оценка качества жизни, эмоционального состояния, сексуальной функции женщин в постменопаузе 87
Глава 4. Результаты низкодозированной локальной гормональной терапии у женщин с вагинальной атрофией в постменопаузе 92
Глава 5. Обсуждение полученных результатов 113
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список сокращений и условных обозначений 134
- Микробиоценоз влагалища и локальный иммунитет при вагинальной атрофии
- Оценка качества жизни, эмоционального благополучия и сексуальной функции
- Состояния слизистой влагалища у женщин в постменопаузе
- Локальный иммунитет слизистой влагалища у женщин в постменопаузе
Микробиоценоз влагалища и локальный иммунитет при вагинальной атрофии
Снижение эстрогенов в перименопаузе и постменопаузе приводит к уменьшению количества лактобактерий и изменению состава микрофлоры в целом. Согласно данным Hillier S. L., Lau R. J., при детальном анализе микрофлоры влагалища 73 женщин в постменопаузе, не принимавших гормональную терапию, у 49% не были выявлены лактобациллы, а среди тех, у которых они обнаруживались, концентрация последних была в 10 – 100 раз меньше, чем у женщин в пременопаузе. Только у 13% женщин в постменопаузе, не принимающих гормональную терапию, преобладают лактобациллы в микрофлоре влагалища. В отличие от женщин в пременопаузе, наиболее распространенными микроорганизмами являются анаэробные грамотрицательные палочки и грамположительные кокки [105].
В более ранних отечественных исследованиях были получены данные, которые свидетельствовали об отсутствии массивной колонизации влагалища УПМ, в частности энтерококками, стрептококками, кишечными палочками [7].
Данный анализ приводился с использованием микробиологического исследования, которое включало культуральную диагностику и микроскопию мазков вагинального отделяемого, окрашенных по Граму [7].
В основном, предыдущие исследования, посвященные изучению вагинальной микрофлоры, были проведены с использованием бактериологических методов. Однако, большинство видов микроорганизмов ( 90%) не поддаются культивированию в стандартных аэробных условиях [23][54][16]. Для детальной характеристики микрофлоры влагалища требуются молекулярные методы исследования (ПЦР-диагностика, секвенирование гена 16S рРНК) [23][34]. Эти исследования позволяют распознать множество бактерий, которые не могут быть идентифицированы с помощью традиционных методов культивирования [24][68][23]. На сегодняшний день, молекулярные подходы к изучению микрофлоры влагалища были сосредоточены на женщинах репродуктивного возраста, в основном в возрасте от 18 до 45 лет [115][30][142]. В Российской Федерации на основании проведенных исследования были разработаны диагностические панели «Фемофлор 16» для оценки состояния вагинального микробиоценоза у пациенток репродуктивного возраста [11].
К сожалению, при отсутствии четких критериев оценки вагинальной нормофлоры для пациенток в постменопаузе и появлении бактериальных представителей нехарактерных для пременопаузы, анализ состояния микроценоза осуществляется с позиции репродуктивного возраста, что служит поводом для назначения антибактериальных препаратов, что потенциально нарушает хрупкую микроэкологию влагалища постменопаузальных женщин [103]. Таким образом, вопрос отсутствия четких критериев оценки состояния микробиоты влагалища у женщин в постменопаузе требует дальнейшего, более глубокого изучения. Переход микробиоты от преобладания лактобацилл в сторону грамотрицательных анаэробов и грамположительных кокков может играть определенную роль в воспалительном процессе у женщин репродуктивного возраста [97]. Аналогичную картину следовало бы ожидать у пациенток в постменопаузе. Однако отечественные исследователи получили противоположные данные, которые свидетельствуют об отсутствии воспалительной реакции. Было выявлено, что в мазках у женщин в постменопаузе количество лейкоцитов не превышало 10 в поле зрения. Было выдвинуто предложение о неправомочности термина «атрофический вагинит», который подразумевает наличие воспаления [7].
В последующих исследованиях, в которых изучалось состояние локального иммунитета влагалища посредством биопсии его стенок, у больных с «атрофическим вагинитом» была выявлена активация эфферентных компонентов Т-клеточного звена иммунитета, имеющих корреляционную связь со степенью тяжести урогенитальных расстройств (УГР). В эпителии и в подслизистой соединительной ткани биоптатов влагалищной стенки выявлены скопления лимфоидных клеток, связывающих моноклональные антитела, представляющие натуральные киллеры (CD56), клетки супрессорно цитотоксического ряда (CD14). Число клеток, связывающих моноклональные антитела, достоверно различалось в зависимости от степени тяжести УГР и выраженности атрофических процессов во влагалищной стенке. Установлена также корреляционная зависимость степени тяжести УГР и выраженности реакций клеток супрессорно-цитотоксического ряда и натуральных киллеров [2].
С учетом появления более современных методов диагностики, позволяющих оценить экспрессию мРНК генов иммунного ответа, были получены данные в поддержку наличия воспалительного процесса у женщин в постменопаузе. В работах Adam Dahn и Monette M. отмечается, что замещение лактофлоры условно-патогенной влияет на развитие иммунного ответа, а именно на экспрессию мРНК генов цитокинов во влагалище. В работе Monette M. показано снижение экспрессии генов цитокинов IL8 и IL19 во влагалище после лечения препаратами, содержащими эстрадиол (E2), что указывает на уменьшение воспалительной реакции. Также было продемонстрировано изменение экспрессии генов провоспалительных цитокинов IL2, L6 и противовоспалительных IL4, IL10, что тоже подтверждает вышесказанное. В исследовании Adam Dahn, в котором впервые проводилось сравнении экспрессии генов в клетках влагалища у постменопаузальных женщин с преобладанием УПМ в биотопе влагалища и нормальной микрофлорой, было отмечено значительное снижение (8-9 кратное) экспрессии мРНК IL-1 у пациенток с БВ, что оказалось неожиданным [58][25]. Данный факт может свидетельствовать о снижении способности ответа организма на инфекционные агенты или же не восприимчивость к УПМ. И такая точка зрения может объяснить, почему многие случаи преобладания УПМ в микроценозе влагалища протекают бессимптомно. С другой стороны клинические данные зарубежных авторов свидетельствуют об увеличении встречаемости УПМ в микрофлоре влагалища в популяции постменопаузальных женщин, что поддерживает гипотезу об угнетении защитных механизмов после менопаузы [131]. Однако, с учетом отсутствия четких критериев оценки состояния микробиоты влагалища у женщин в постменопаузе данный вопрос требует дальнейшего изучения.
Таким образом, современные метод исследования микробиоты влагалища и генов цитокинов, основанных на ПЦР-РВ, позволят качественно и количественно изучить спектр выявляемых микроорганизмов, генов цитокинов у женщин в постменопаузе и изучить взаимосвязь между биоценозом влагалища и развитием воспалительной реакции.
Оценка качества жизни, эмоционального благополучия и сексуальной функции
Взятие биологического материала с боковой стенки влагалища осуществляли путем соскоба стерильным урогинекологическим зондом. Собранные образцы помещали в транспортную среду, содержащую физиологический раствор. Осаждение клеток и бактериальных агентов проводили путем центрифугирования при 13000G течение 10 мин. Выделение ДНК и РНК из биологического материала проводилось с использованием реагентов для выделения нуклеиновых кислот ПРОБА–НК (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
Методом ПЦР-РВ с использованием ФЕМОФЛОР проводили количественная оценка биоценоза влагалища, учитывалась общая бактериальная масса (ОБМ), количество и доля Lactobacillus spp.; L. crispatus; L. acidophilus; L. iners; L. jensenii; L. gasseri; L. johnsonii; L.vaginalis; семейство Enterobacteriaceae; Staphylococcus spp.; Enterococcus spp.; Prevotella bivia/Porphyromonas spp.; Eubacterium spp.; Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp.; Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.; Lachnobacterium spp./Clostridium spp.; Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.; Peptostreptococcus spp.; Atopobium vaginae; Mycoplasma hominis; Ureaplasma urealyticum; Candida spp.; Candida albicans. ;Streptococcus spp.; Streptococcus agalactia;Gardnerella vaginalis; Mycoplasma genitalium; Ureaplasma parvum; Actinomycetes spp.; Bifidobacterium; Anaerococcus spp.; Staphylococcus aureus; E.coli. Амплификацию осуществляли в режиме “реального времени” на приборе «ДТ-964» («ДНК-Технология», Россия). Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле амплификации по каналам FAM, HEX и ROX. Обработка результатов осуществлялась автоматически с помощью программного обеспечения к приборам.
В рамках данной работы для классификации типа микробиоценоза оценивали долю лактофлоры. При доле лактобацилл в ОБМ 80% и выше такой микробиоценоз условно называли «нормоценозом», а при полном отсутствии лактофлоры или доле менее 80% - «дисбиозом». При изучении видовой структуры лактобактерий влагалища доминирующими считали тот вид, доля которого в составе лактофлоры составляла более 50%.
Исследование профиля мРНК генов иммунного ответа в содержимом влагалища методом ОТ-ПЦР Для изучения состояния локального иммунитета исследовали профиль мРНК генов цитокинов: IL1B, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL18, TNF, TGFB, CD45, CD68, TLR4, GATA3, CD69 и референсного гена B2M. Субстрат для данного анализа собирался с боковых стенок влагалища и помещался в пробирки со специальной транспортной средой (лизирующий раствор набора «Проба НК», «ДНК-Технология», Россия). Дальнейшая обработка биологического материала методом количественной ОТ-ПЦР и амплификация генов циокинов методом ПЦР-РВ осуществлялась согласно инструкции («ДНК-Технология», Россия)). Реакции амплификации целевых и референсных генов ставили в двух повторах. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт» с применением парафина. Был применен метод сравнения пороговых циклов (метод Cq с нормировкой на референсные гены) с вычислением нормировочного фактора (NF) для каждого образца как среднее арифметическое значенийCp референсных генов.
Выделение нуклеиновых кислот для определения экспрессии мРНК проводили с использованием комплекта реагентов ПРОБА–НК (ООО “НПО ДНК-Технология”, Россия). Образцы для ПЦР диагностики до начала исследования хранили при температуре -70С. Эхография органов малого таза осуществлялась с помощью продольных и поперечных сечений аппаратами сложного сканирования с использованием трансвагинального датчика. В процессе исследования определялось расположение матки, ее размеры, оценивалась структура миометрия, выявлялось наличие миоматозных узлов, их размер, расположение, наличие эхо-признаков аденомиоза. Особое внимание обращалось на состояние срединного маточного эха (М-эхо), оценивалась его эхогенность, структура, измерялась величина переднезаднего размера. За норму М-Эха принимали отражение от стенок полости матки и эндометрия, не превышающие 4-5 мм. При исследовании яичников, помимо их размеров, обращали внимание на толщину капсулы, количество фолликулов. Эхография производилась до начала терапии для исключения противопоказаний для назначения локальной МГТ.
Результаты исследования не выявили противопоказания для назначения терапии локальной гормональной терапии в группах лечения.
Рентгеномаммографическое исследование проводилось пациенткам в двух проекциях до начала назначения препаратов, содержащих эстриол. Данные маммографии свидетельствовали об отсутствии противопоказаний для назначения локальной МГТ.
Материал для PAP-теста с помощью цервикальной щетки брали с экзоцервикса, с участка на границе многослойного эпителия и цилиндрического эпителия цервикального канала и из нижней трети эндоцервикса. После забора материала его окрашивали основными красителями гемотоксилином или оранжевым, а затем кислым красителем чаще эозином. В результате окраски определяли изменения ядер, цитоплазмы клеток. Описание клеточного состава было классифицировано по терминологической системе Бетесда (таб. 5). Исследование проводилось до назначения локальной МГТ.
Состояния слизистой влагалища у женщин в постменопаузе
В ходе проведенного исследования изучали состояние кислотно-щелочного состояния вагинального отделяемого. В среднем рН влагалища находился в диапазоне от 4,2 до 7,5 (в среднем 5,7±0,8). При сравнительной оценке рН влагалища у пациенток в зависимости от ИСЭВ было выявлено увеличение данного показателя у пациенток основной группы. У женщин с ВА рН составил 6,5±0,7, в группе сравнения – 5,1±0,6 (p 0,0001).
Известно, что имеется взаимосвязь между ИСЭВ, который определяет наличие атрофии, и рН влагалища. В некоторых зарубежных источниках, авторы утверждают, что рН-метрия является равноценным методом диагностики ВА по сравнению с цитологическим исследованием стенки влагалища с последующей оценкой индекса созревания эпителия: если рН влагалища 5, то данное наблюдение констатирует факт наличия ВА у женщин в постменопаузе. Таблица 23
При оценке рН влагалища в качестве возможного диагностического маркера ВА был применен ROC-анализ с целью изучения диагностической чувствительности и специфичности данного показателя. Площадь под ROC-кривой составила AUC=0,818 [95% ДИ 0,748-0,887], p 0,0001, что позволило оценить модель как очень хорошую (рис. 7). Пороговое значение рН влагалища составило 5,5. Чувствительность и специфичность предложенной модели в области порогового значения составила 76% и 65%.
При рассмотрении результатов корреляционного анализа Пирсона для рН вагинального отделяемого и видами лактобацилл, было выявлено, что наибольшая взаимосвязь прослеживается между рН и L. crispatus. В то же время обращает на себя внимание, тот факт, что прослеживается отрицательная корреляционная связь между кислотно-щелочным балансом во влагалище и долей L. acidophilus и L. vaginalis (таб. 25). pH вагинального отделяемого у женщин в постменопаузе находится в диапазоне от 4,2 до 7,5. У женщин с подтвержденной ВА pH влагалища достоверно выше, чем у женщин из группы сравнения. При нормоценозе рН вагинального отделяемого ниже, чем при дисбиозе. Проведенный ROC-анализ показал, что рН-метрия вагинального отделяемого является информативным диагностическим маркером ВА, однако уступает по значимости цитологическому исследования стенки влагалища с подсчетом ИСЭВ. У пациенток с более низким рН вагинального отделяемого чаще встречались L. crispatus и L. iners.
В доступной литературе отсутствуют однозначные данные об особенностях локального иммунитета у женщин в постменопаузе. Традиционно в качестве скрининга для определения воспалительной реакции в нижних отделах полового тракта применяется метод микроскопии мазков по Граму с подсчётом количества лейкоцитов в поле зрения. В нашей работе оценивалось состояние локального иммунитета на основании подсчёта количества лейкоцитов в мазках отделяемого влагалища. Результаты представлены в таблице 26. У пациенток из групп наблюдения отсутствовала выраженная лейкоцитарная реакция. При сравнении количества лейкоцитов при микроскопии мазков вагинального отделяемого не было найдено статистически значимых различий между пациентками с ВА и без, а также в зависимости от состояния микроценоза влагалища. Таблица 26
Результаты микроскопии мазков у женщин в группах наблюдения (количество лейкоцитов в поле зрения). Показатели НормоценозМедиана(25-75 процентиль) ДисбиозМедиана(25-75 процентиль) Группа 1 Группа 2 Р-уровень Группа 1 Группа 2 Р-уровень Количество лейкоцитов 5,0 (2,0-0,0) 3,5 (2,0-6,0) 0,324 5,5 (2,0-0,0) 5,0 (3,0-5,0) 0,777 Сравнения между группами проведены по критерию U-тест Манна-Уитни. В рамках нашего исследования также всем пациенткам была проведена оценка экспрессии мРНК генов иммунного ответа. При сравнении транскрипционных профилей генов иммунного ответа у женщин в постменопаузе с ВА и без было установлено, что у пациенток 1 группы была снижена экспрессия IL1B (р=0,0001), IL12A (р 0,0001), IL18(р 0,0001), TNF(р 0,0001), TGFB(р 0,0001), GATA3 (р 0,0001) и повышена IL10 (р 0,001) и CD69 (р=0,021) по отношению к группе сравнения (таб. 27). Таблица 27 Уровни экспрессии мРНК цитокинов в вагинальных мазках в группах наблюдения Показатели Группа 1Медиана (25-75 процентиль) Группа 2Медиана (25-75 процентиль) Р-уровень
Уровень мРНК генов IL12A (в 1 группе р=2х10-6, во второй группе р 0,0001), IL18 (в 1 группе р=7,4х10-7, во второй группе р 0,0001), TGFB (в 1 группе р=5х10-6, во второй группе р=0,01), CD68 (в 1 группе р=1,7 х10-7, во второй группе р 0,0001), GATA3 (в 1 группе р=0,018, во второй группе р 0,0001) был выше при нормоценозе в обеих группах наблюдения. В 1 группе при нормоценозе также была повышена экспрессия IL1B (р=0,00096), TNF (р=0,00037), а во второй группе отмечали снижение уровня экспрессии IL6 (р 0,0001), IL10 (р=0,031) при нормоценозе. Таблица 29
Локальный иммунитет слизистой влагалища у женщин в постменопаузе
Дефицит эстрогенов у женщин в постменопаузе приводит к разнообразным изменениям, влияющим почти на все органы и системы в организме [121]. Влагалище, вульва, половые губы, мочевыводящие пути имеют высокую концентрацию рецепторов эстрогена, и, следовательно, являются очень чувствительными биологическими индикаторами уровня женских половых гормонов в сыворотке крови [107][120].
Симптомы ВА являются вторым маркером наступления менопаузы [6]. Потеря эстрогенов в постменопаузальном периоде является основной причиной развития вагинальной атрофии у женщин [43]. Согласно полученным результатам исследования, у пациенток с ВА ИМТ был достоверно ниже по отношению к женщинам без атрофии слизистой влагалища, что согласуется с данными литературы. Факторы, влияющие на концентрацию эстрогенов в крови у женщин в постменопаузе разнообразны и сложны, зависят от массы тела, принципов питания (диеты), физических упражнений, курения, этнической принадлежности и генетических полиморфизмов [113][77][129][59][15][37][19][84]. Во многих работах подтверждается наличие прямых корреляционных связей между ИМТ и уровнем циркулирующих эстрогенов [113]. Концентрация свободного эстрадиола в два-три раза выше у женщин при избыточной массе тела и ожирении по сравнению с более стройными представительницами слабого пола [14]. Также имеет значение прогрессивное снижение полового гормон-связывающего глобулина на фоне увеличения ИМТ, которое более выражено у женщин в постменопаузе [38]. Результаты, полученные в нашей работе, подтверждают, что повышенный ИМТ защищает от развития ВА.
Данные литературы по распространенности ВА противоречивы. Наблюдательные исследования подтвердили высокую распространенность ВА и сообщают, что она развивается у 27% - 59% женщин в пери- и постменопаузе [70]. Согласно результатам проведенного нами исследования, у 62% женщин в постменопаузе была выявлена ВА. По нашим данным преобладающими жалобами у женщин в постменопаузе были зуд (42,6%), жжение во влагалище (47,1%), немного реже женщин беспокоили раздражение во влагалище и наружных половых органах (38,2%), боль (38,2%), а также выделения из половых путей (23,5%) и неприятный запах выделений (25,7%). Наиболее распространенным симптомом была сухость во влагалище, которую испытывали 63,2% женщин, что согласуется с данными других исследователей [108][128]. В отличие от классических менопаузальных симптомов – приливов жара, которые подвергаются обратному развитию спустя 5-10 лет после наступления менопаузы, проявления ВА у большинства женщин носят прогрессирующий характер [121][19]. По мере увеличения возраста пациенток и длительности постменопаузы распространенность ВА увеличивалась. Несмотря на это, частота встречаемости вагинальных симптомов имела хаотичный характер и не увеличивалась прямо пропорционально распространенности ВА. Классическим объяснением возникновения атрофии слизистой влагалища и вагинальных симптомов в период постменопаузы является отсутствие стимулирующего воздействия эстрогенов на созревание эпителия. В исследовании Griebling TL, Liao Z, Smith PG. изучали взаимосвязь гормонзависимых изменений иннервации влагалища у женщин в постменопаузе. В биоптатах вагинальной стенки определяли плотность распределения симпатических и парасимпатических волокон. Авторы показали, у пациенток, не получавших МГТ, относительно более высокую плотность аксонов симпатической и парасимпатической иннервации на единицу площади. На фоне МГТ отмечалось снижение плотности сенсорных, симпатических и парасимпатических аксонов, что объясняет уменьшение вагинального дискомфорта при применении гормональной терапии. Более выраженный эффект был получен у пациенток, использовавших топические эстрогены [70]. В нашем исследовании наличие симптомов дискомфорта во влагалище у пациенток в постменопаузе возможно объясняется повышением порога болевой чувствительности на фоне увеличения плотности ноцицептивных нервных волокон во влагалищной стенке.
Однако, несмотря на широкую распространенность симптомов, ассоциированных с ВА, по данным North American Menopause Society лишь 25% женщин с симптомами вагинальной атрофии обращаются за медицинской помощью [91]. Существует несколько причин, объясняющих сложившуюся ситуацию. Некоторые женщины редко связывают беспокоящие их вагинальные симптомы с последствиями возрастного дефицита женских половых гормонов. В результате они редко или вовсе не обращаются за помощью к гинекологам по поводу данного состояния [119][100]. По оценкам онлайн-опроса, проведенного в 6 странах Европы, 45% женщин в постменопаузе сообщили о наличии вагинальных симптомов [100], но только 4% связывали данные жалобы с ВА, связанной с менопаузой. В тоже время женщины испытывали трудности при обсуждении подобных деликатных проблем. По данным международного исследования “Women s Voices in the Menopause” многие женщины (30%), которые страдали от негативных последствий ВА сообщили, что испытывают смущение (60%) при обсуждении интимных вопросов; 52% женщин убеждены, что «другие люди не хотят слышать об их проблемах"; а 49 % женщин полагали, что это естественная часть старения и с ней необходимо смириться [99][82]. К тому же на сегодняшний день данная проблема недостаточно освещается в СМИ. По данным James A. Simon менее половины женского населения (37% -42%) в Соединенных Штатах и Канады были удовлетворены имеющейся информацией о ВА [139].