Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Особенности послеоперационного спаечного процесса у больных миомой матки (обзор литературы) 10
1.1. Современные представления о развитии спаек у гинекологических больных 10
1.1.1. Представление о патогенезе развития спаек 11
1.1.2. Влияние биологически активных веществ на активность образования спаек 14
1.1.3. Структура вновь образованного соединительнотканного волокна 16
1.1.4. Классификация спаечного процесса 17
1.1.5. Профилактика образования спаек .20
1.1.6. Хирургические техники, направленные на предупреждение развития спаек 21
1.1.7. Классификация противоспаечных препаратов 22
1.1.8. Применение гемостатических препаратов с доказанной противоспаечной активностью 25
1.2. Заболеваемость миомой матки в структуре гинекологической патологии .26
1.2.1. Современные представления об этиологии и патогенезе миомы матки .26
1.2.2. Классификация миомы матки по клиническим и морфологическим признакам 29
1.2.3. Диагностика миомы матки 30
1.2.4.Различные тактики лечения больных миомой матки: медикаментозное, хирургическое, альтернативные способы .31
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования .36
2.1. Общая характеристика клинических групп 36
2.2. Клинический метод исследования 37
2.3. Описание техники лапароскопической миомэктомии 38
2.4. Морфологический и иммуногистохимический методы исследования 39
2.5. Молекулярное исследование 41
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Характеристика больных первой группы 45
3.1.1. Клинико-анамнестические данные .45
3.1.2. Интраоперационная характеристика больных .53
3.1.3. Опыт применения противоспаечных и гемостатических препаратов у больных первой группы во время лапароскопий 57
3.1.4. Клиническое наблюдение применения противоспаечного препарата с последующей контрольной лапароскопией .59
3.1.5.Динамическое наблюдение больных первой группы после миомэктомии .64
3.1.5.1. Ранний послеоперационный период 64
3.1.5.2. Отдалённый послеоперационный период 68
3.1.6. Результаты морфологического исследования 69
3.1.6.1. Исследование узлов миомы матки 69
3.1.6.2. Исследование ткани спайки и брюшины 71
3.1.7. Результаты иммуногистохимического исследования 72
3.1.7.1. Окраска на Ki-67 .73
3.1.7.2. Окраска на MMP 2 75
3.1.7.3. Окраска на TIMP 77
3.1.7.4. Окраска на маркёр коллагена первого типа 80
3.1.7.5. Окраска на маркёр коллагена третьего типа 81
3.1.7.6. Окраска на VEGF 84
3.1.7.7. Окраска на C-KIT 87
3.1.8. Результаты молекулярного исследования .90
3.2. Характеристика больных второй группы .92
3.2.1. Клинико-анамнестические данные .92
3.2.2. Интраоперационная характеристика больных (на момент бывшей ранее миомэктомии) 99
3.3. Характеристика больных третьей группы 101
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных данных 105
Выводы 118
Практические рекомендации 120
Список сокращений 121
Список литературы
- Профилактика образования спаек
- Описание техники лапароскопической миомэктомии
- Клиническое наблюдение применения противоспаечного препарата с последующей контрольной лапароскопией
- Интраоперационная характеристика больных (на момент бывшей ранее миомэктомии)
Профилактика образования спаек
Это образование из гладкомышечных элементов моноклонального происхождения с последующим фиброзированием в условиях тканевой гипоксии. Миома растет, как генетически неверный пул клеток из одной первичной клетки, в которой произошел генетический сбой [159, 167, 170, 173]. Проведено много исследований факторов риска, предрасполагающих к появлению миомы матки: это возраст более 40 лет, негроидная раса, наследственность (наличие миомы матки у родственниц первой, второй линии родства), отсутствие беременности в анамнезе. Тогда как более 5 беременностей, постменопауза, длительный прием оральных контрацептивов, медроксипрогестерона (депо-Провера), курение [155, 156] снижают риск возникновения миомы матки.
Генетическая предрасположенность к развитию заболевания доказана эпидемиологическими и цитогенетическими данными. Доказано участие в процессах дифференциации и пролиферации в клетках миомы двух генов 12q15 и 6p21 [61, 71]. В большом исследовании, в которое входило пости 100 семей, было выявлено, что миома матки встречается чаще у женщин с семейным анамнезом [114]. Исследования Американских ученых выявило расовые отличия в частоте встречаемости заболевания: у афроамериканок миома матки встречалась гораздо чаще, чем у белых американок, не зависимо от социального статуса, росто-весовых показателей и качества медицинского обслуживания [154].
У женщин с синдромом Рида (наличие множественных кожных лейомиом и миомой матки), изучали возможный тип наследования предрасположенности к заболеванию: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный или Х сцепленный доминантный. Однако авторы так и не нашли достоверных подтверждений определенного типа наследования [114,154–156,166,180].
Описаны два типа клеток – предполагаемых предшественников миомы: недифференцированные клетки мезенхимы и гладкомышечные клетки миометрия. Недифференцированные клетки мезенхимы претерпевают пролиферативные процессы и дифференцируются в гладкомышечные в период с 12-й по 31-ю неделю антенатального развития. А мезенхимальные клетки завершают процессы трансформации уже к 14-й неделе внутриутробного развития. Таким образом, эти клетки более подвержены воздействию стероидов, биологически активных веществ (цитокинов, ФНО) со стороны женского организма. И именно эти клетки становятся предшественниками миомы матки, которые после менархе оказываются под постоянным воздействием собственных гормонов [83, 109].
В литературе существуют различные мнения о роли стероидов в развитии миомы матки, но многочисленные исследования подтверждают, что половые гормоны являются стимуляторами роста миомы. В последнее время появилось много сторонников прогестероновой теории [101,157]. Согласно которой прогестерону выделяют ключевую роль в запуске каскада нарушений, предшествующих развитию опухоли. Первый механизм – блокирование эстрогеновых рецепторов, второй – активация самих прогестероновых рецепторов.
Существует множество приверженцев синергического влияния гормонов (эстрогенов и прогестерона), биологически активных веществ (факторов роста, цитокинов, иммунореактивного инсулина), которые за счет аутокринно паракринного влияния на пролиферативную активность клеток предшественников, оказывают митогенное воздействие. Особенно значимыми являются ростовые факторы семейства эпидермальных (ЭФР, 3-ТФРр, ИПФР, ФРФ) и сосудисто-эндотельиальные (ЭФР, адреномедуллин) факторы. Ростовые факторы оказывают локально воздействие на межклеточные связи, а сам экстрацеллюлярный матрикс является субстанцией, влияющей на дифференцировку, пролиферацию и организацию окружающих клеток [94, 110, 203]. Миома диаметром 1 – 2 мм может кровоснабжаться за счет диффузии из окружающего миометрия, но миома большего размера нуждается в собственных сосудах. Неоангиогенез – важный момент в патогенезе миомы. Опухоль способна продуцировать стимулирующие неоангиогенез факторы, которые обуславливают врастание сосудов в опухолевый очаг путем миграции в него эндотелиальных клеток из ткани и их размножения. Ангиогенез происходит следующим образом: под воздействием эстрогенов и прогестерона происходит разрушение базальной мембраны, увеличение проницаемости эндотелия, миграция и пролиферация и «созревание» эндотелиальных клеток и ремоделирование сосудов [95].
Кроме того, в патогенезе миомы матки играют определенную роль изменения иммунологической реактивности организма, особенно при наличии хронических очагов инфекции. Точкой приложения повреждающего фактора является сосудистая стенка. Механизм запуска этой реакции неспецифичен. Иммунная система представляет собой систему, контролирующую процессы регенерации, дифференцировки клеток, роста тканей (в частности, миометрия), а главное – иммунная система осуществляет в организме строгий контроль над двумя основными процессами жизнедеятельности клеток: пролиферацией и апоптозом [134]. В результате нарушения баланса процессов пролиферации и апоптоза в миометрии возникает очаговая (локальная) гиперплазия миометрия. Подтверждением этому является повышение экспрессии в лейомиоме протоонкогена bcl-2 (фактор торможения апоптоза) и Ki-67 (маркер клеточной пролиферации) [47, 225]. Установлено стимулирующее влияние прогестерона и ингибирующее воздействие эстрадиола на экспрессию bcl-2 в миоматозных узлах. Таким образом, значительная экспрессия bcl-2 в клетках миомы по сравнению с нормальным миометрием может быть одним из молекулярных механизмов, способствующих усиленному росту опухоли вследствие торможения апоптоза [60].
Описание техники лапароскопической миомэктомии
Микропрепараты, блоки и макропрепарат консультированы в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАН. Проведено ИГХ исследование опухоли. Совокупность полученных данных дает основание расценить опухоль как пролиферирующую (клеточную) лейомиому из группы опухолей неясного злокачественного потенциала с очагами внутрисосудистого лейомиоматоза. Вышеуказанные особенности опухоли ставят под сомнение радикальность проведенного оперативного вмешательства.
28 октября 2013 г. выполнена плановая операция (расцениваемая нами как контрольная лапароскопия): лапароскопия, разделение спаек, гистерэктомия без придатков.
Интраоперационно: в малом тазу тело матки не увеличено, бледно-розового цвета, к задней поверхности матки в области дна (область предыдущей операции на месте стыка двух пластин противоспаечного препарата) подпаяна одна жировая подвеска сигмовидной кишки. В области наложения пластинок Surgicel поверхность шва без спаек, с блестящей серозой. Необходимо отметить, что в области шва, где пластинки не были наложены, имеется спайка жировой подвески кишки и задней стенки матки (рисунок 6).
Рисунок 6. Повторная операция. Локализация спайки жировой подвески кишки и задней поверхности матки в области отсутствия противоспаечного препарата. Придатки матки с двух сторон не изменены, в яичниках фолликулярный аппарат выражен, маточные трубы без видимой патологии. Печень, желчный пузырь, большой сальник визуально не изменены. Париетальная брюшина гладкая, блестящая. Свободной жидкости в брюшной полости нет. Через каждые 3 месяца после операции в поликлиническом отделении Центра выполняли динамическое наблюдение, а именно: стандартый гинекологический осмотр и УЗИ органов малого таза. После выполненной операции всем был назначен специалистом отделения восстановительного лечения Центра комплекс реабилитационных мероприятий. Программа послеоперационного лечения включала воздействие физическими факторами (ПеМП – переменное магнитное поле низкой частоты, КВЧ-терапию – электромагнитное излучение крайне высокой частоты) с первых суток после операции в интенсивном режиме. В послеоперационном периоде проводили медикаментозное лечение: обезболивание – по показаниям, инфузионная терапия и курс антибактериальной терапии. У всех пациенток нормализация температуры наступала на 3-й день после оперативного лечения. В 14,5 % (n = 16) случаев в послеоперационном периоде отмечалось повышение температуры до субфебрильных значений. Повышение уровня лейкоцитов в послеоперационном периоде было отмечено в 18,2 % (n = 20) случаев, на фоне проводимой терапии к моменту выписки нормализация клинико-лабораторных показателей была отмечена у всех пациенток. В 62,8 % (n = 69) случаев у больных миомой матки была анемия. Всем пациенткам с анемией был назначен препарат железа для нормализации уровня гемоглобина.
Контроль эффективности проведенного лечения осуществляли при динамическом обследовании пациенток в поликлиническом отделении Центра через каждые 3 месяца после операции с использованием традиционного гинекологического обследования и ультразвукового исследования. На повторном приеме проводился опрос с выявлением жалоб у пациентки, оценкой изменения жалоб до и после операции. По результатам осмотра назначался повторный прием через 3 или 6 месяцев для оценки состояния швов на матке и определения возможности беременности у данной пациентки. Из 110 прооперированных пациенток на осмотр пришли 94 (85,5 %). Из них 73 (66,4 %) женщины – согласно назначению и 21 (19,1 %) были активно приглашены. 16 пациенток (14,5 %) на прием не пришли, так как проживали территориально далеко от Москвы и наблюдались по месту жительства. При опросе мы акцентировали внимание на выявление жалоб, которые косвенно могут указывать на послеоперационный спаечный процесс в брюшной полости. Данные представлены в таблице 17 .
Субъективная оценкакачестважизни:чувствует себя лучше не может оценить чувствует себя хуже 262 0 92,97,1 0 615 0 92,47,6 0 0,05 0,05 0,05 Как следует из таблицы 17, жалобы на боли внизу живота во время менструации предъявляли две (7,1 %) пациентки из 28 осмотренных, подгруппы со спаечным процессом в брюшной полости; большинство пациенток (26, что составило 92,9 %) жалоб не предъявляли. В подгруппе женщин без спаечного процесса в брюшной полости жалобы на боли внизу живота во время менструации были у 5 (7,6 %) пациенток, а 61(92,4 %) жалоб не предъявляли. У большинства пациенток обеих подгрупп первой группы менструальный цикл был регулярный, соответственно у 24 (85,7 %) и 58 (87,9%), а менструальная кровопотеря – умеренной, соответственно у 20 (71,4%) и 58 (85,7%), без достоверной разницы между подгруппами (р 0,05).
По данным УЗИ швы на матке были состоятельны у всех 94 (100 %) осмотренных пациенток. Наличие мелких узлов миомы матки было обнаружено у 9 (9,6 %) пациенток: у двух (7,1 %) из подгруппы со спаечным процессом в брюшной полости и у 7 (10,6 %) из подгруппы без спаечного процесса, без достоверной разницы (р 0,05) между подгруппами. Все эти женщины были прооперированы по поводу множественной миомы матки.
У большинства пациенток обеих подгрупп первой группы субъективная оценка качества их жизни после проведенной им миомэктомии было положительная, соответственно у 26 (92,9 %) и у 61 (92,4 %), при р 0,05.
В целом, по всем представленным данным осмотра и обследования пациенток первой группы после проведенной им миомэктомии разницы между пациентками обеих подгрупп не выявлено.
Для оценки репродуктивных исходов проводился телефонный опрос пациенток по специальной анкете, спустя 6 месяцев. Удалось дозвониться до 88 женщин. Результаты опроса представлены в таблице 18.
Клиническое наблюдение применения противоспаечного препарата с последующей контрольной лапароскопией
На рисунке отображено более выраженное проявление маркера в ткани спайки на 2 и 6 баллах и в ткани брюшины на 2 и 4 баллах. При сравнении образцов миометрия, брюшины и ткани спайки достоверных различий в экспрессии маркера MMP 2 не выявлено (p 0,05). У пациенток с миомой матки ИГХ окраска на TIMP характеризовалась коричневой окраской ядер и цитоплазмы клеток. Степень экспрессии белка определялась в баллах. В образцах миомы матки мы наблюдали равномерное распределение маркированных клеток, не ярко прокрашенных, с относительным скоплением в области просвета сосудов (рисунок 22).
В образцах брюшины и спайки мы обнаружили единичные, четко прокрашенные клетки, диффузно расположенные в поле зрения (рисунок 23).
Данные о количественном и балльном распределении маркированных клеток в образцах тканей представлены в таблице 23 и на рисунках 24 и 25. Таблица 22 Распределение количества окрашенных клеток маркера TIMP в баллах
Статистических различий между образцами миометрия, брюшины, спайки выявлено не было(p 0,05), однако в тканях миомы соотношение металлопротеиназ и их ингибиторов смещено в сторону металлопротеиназ, а в тканях спайки соотношение смещено в сторону тканевых ингибиторов металлопротеиназ, что может свидетельствовать об активных пролиферативных процессах в волокне спайки. 3.1.7.4 Окраска на маркер коллагена первого типа.
У пациенток с миомой матки ИГХ окраска на наличие коллагена 1-го типа характеризовалась коричневой окраской ядер и цитоплазмы клеток. Степень экспрессии белка определялась в баллах. В образцах миомы матки коллаген 1-го типа прокрашивался интенсивно, относительно равномерно, в большом количестве.
В тканях спайки нами была выявлена экспрессия маркера коллагена 1-го типа, проявляющаяся в равномерном, относительно не интенсивном окрашивании в
Выявлены статистически значимые различия между образцами миомы матки и брюшины, и брюшины и ткани спайки (p 0,05). Коллаген 1-го типа, так называемый «старый коллаген», преобладал в тканях миомы матки.
У пациенток с миомой матки ИГХ окраска на наличие коллагена третьего типа характеризовалась коричневой окраской ядер и цитоплазмы клеток. Степень экспрессии белка определялась в баллах. В образцах миометрия нами выявлено неинтенсивное прокрашивание и диффузное расположение маркированных клеток в поле зрения.
Рисунок 29. Ткань миомы. Окраска на коллаген третьего типа, x400.
В ткани брюшины маркированные клетки более ярко окрашены, равномерно распределены в поле зрения.
Рисунок 30. Ткань брюшины. Окраска на коллаген третьего типа, x400. В тканях спайки прокрашивание маркированных клеток интенсивное, с диффузным расположением их и скоплениями вокруг срезов сосудов. Рисунок 31. Ткань спайки. Окраска на коллаген третьего типа, x400.
Прослеживается некоторая визуальная разница между интенсивностью окраски данного маркера в тканях миомы матки, брюшины и спайки. В тканях брюшины и спайки окраска более интенсивная, а в образцах спайки, прослеживается скопление окрашенных клеток вокруг сосудистых структур.
Данные о количественном и балльном распределении маркированных клеток в образцах тканей представлены в таблице 24 и на рисунке 32.
Выявлены статистически значимые различия между образцами миомы матки и тканями спайки и брюшиной и спайкой (p 0,05). Коллаген третьего типа, так называемый «новый коллаген», преобладал в тканях спайки. Соотношение содержания коллагена первого и третьего типов в тканях миомы, спайки и брюшины представлено на рисунке 33. Рисунок 33. Соотношение содержания коллагена первого и третьего типов в тканях миомы, спайки и брюшины.
У пациенток с миомой матки ИГХ окраска на наличие VEGF характеризовалась коричневой окраской ядер и цитоплазмы клеток. Степень экспрессии белка определялась в баллах. В образцах тканей миомы прокрашенные клетки распределены равномерно, диффузно.
В образцах тканей спайки прокрашенные клетки распределены несколько не равномерно, с большим скоплением вокруг просвета сосудов, в эндотелии сосудов. Рисунок 36. Ткань спайки. Окраска на VEGF, x400.
Данные о количественном и балльном распределении окрашенных клеток представлены в таблице 25 и на рисунках 37 и 38. Рисунки 37 и 38. Соотношение содержания маркера VEGF в баллах и средних числах в тканях миомы, спайки и брюшины. Выявлены статистически значимые различия между образцами миомы матки и тканями спайки и брюшиной и спайкой (p 0,05). CD 117 является рецепторной тирозинкиназой 3-го типа, рецептором для стволового фактора роста, т. н. лиганда "С-KIT".
У пациенток с миомой матки ИГХ окраска на C-KIT характеризовалась коричневой окраской ядер и цитоплазмы клеток. Степень экспрессии белка C-KIT определяли в процентах окрашенных клеток к общему числу клеток.
Интраоперационная характеристика больных (на момент бывшей ранее миомэктомии)
По данным литературы [19, 94, 154, 155], матриксные металлопротеиназы прежде всего экспрессируются в мезенхимальных клетках (главным образом в фибробластах) в период развития и регенерации ткани, а также синтезируются нейтрофилами, макрофагами и моноцитами. Они участвуют в деградации коллагена, главного компонента базальных мембран, и желатина (денатурированного коллагена), тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ ингибируют их действие. Полагают, что равновесие между MMP и TIMP – определяющий фактор в разрушении межклеточного матрикса вновь образовавшегося волокна. Считают, что MMP2 играет важную роль в естественных процессах тканевого ремоделирования и патологических процессах [61, 77, 79, 166, 225].
В нашем исследовании мы проводили ИГХ окраску образцов тканей на маркеры MMP2 и TIMP и молекулярное исследование оценивали экспрессию ММР11. Подсчитывали проявление маркированных клеток в баллах – полуколичественным методом. При сравнении образцов миометрия, брюшины и ткани спайки мы обнаружили более выраженное проявление маркера в ткани спайки на 2 и 6 баллах и в ткани брюшины на 2 и 4 баллах (р=0,76), но достоверных различий в экспрессии маркера MMP2 нами не было выявлено (p 0,05). Также при PCR-rt исследовании образцов миомы и брюшины выявлено резкое повышение экспрессии маркера ММР11 в брюшине у женщин со спайками.
Мы ожидали повышение экспрессии ММР2 и TIMP в отношении между собой, так как по данным отечественной и зарубежной литературы, матриксным металлопротеиназам и тканевым ингибиторам матриксных металлопротеиназ отводят ведущую роль в образовании экстрацеллюлярного матрикса вновь образованного волокна. Статистических достоверных различий в экспрессии маркера TIMP между образцами миометрия, брюшины, спайки выявлено не было (p 0,05). Однако особенности экспрессии ММР2 и TIMP необходимо рассматривать в соотношении друг к другу. В тканях миомы соотношение металлопротеиназ и их ингибиторов было смещено в сторону металлопротеиназ, а в тканях спайки в сторону тканевых ингибиторов металлопротеиназ, что может свидетельствовать об активных пролиферативных процессах в волокне спайки.
Образование любой ткани невозможно без ее активного кровоснабжения, т. е. необходим ангиогенез [38, 61, 82, 94, 110, 133, 134]. Этот процесс непрерывный, он требуется для поддержания роста и существования спайки. Именно поэтому мы изучали экспрессию VEGF – фактора роста эндотелия сосудов в образцах тканей спайки и брюшины. Мы обнаружили, что экспрессия маркера достоверно выше в волокне спайки по сравнению с интактной брюшиной (р = 0,026). Это позволяет нам судить о наличии процесса образования новых сосудов в спайках.
С учетом гепарин связывающей способности факторов роста, а также накопления эндогенного гепарина в тканях миомы и в миометрии, как в резервуаре, это может быть причиной неполного гемостаза в процессе оперативного лечения. Что обуславливает необходимость применения гемостатических препаратов в ходе выполнения миомэктомии. Коллаген является важным компонентом базальной мембраны соединительно тканного волокна, узла миомы [61, 93]. Его синтез напрямую зависит от воздействия биологически-активных веществ, таких как матриксные металлопротеиназы, тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ, факторы пролиферации. В нашем исследовании мы изучили распределение коллагенов 1-го и 3-го типа в тканях миомы, брюшины и спайки. Нам получены результаты: коллаген 1-го типа в большем количестве выявлен в тканях миомы, а коллаген 3-го типа в тканях спайки. Нами выявлены статистически значимые различия содержания коллагена 1 типа между образцами миомы матки и тканями спайки, брюшиной и спайкой (p 0,05), а так же статистически значимые различия содержания коллагена 3-го типа между образцами миомы матки и тканями спайки и брюшиной и спайкой (p 0,05). Таким образом, в тканях миомы и спайки превалируют разные типы коллагенов.
В настоящее время проведено много научных исследований, посвященных стромальным (прогениторным) клеткам.
В одной из работ [171], опубликованной португальскими учеными в журнале ученые провели исследование по восстановлению миокарда после инфаркта путем выращивания мезенхимальных стволовых клеток in vitro и подсаживания иньекционно in vivo. 6 испытуемых животных подверглись перевязки левой нисходящей коронарной артерии. Культивированные мезенхимальные стволовые клетки в условиях гипоксии и нормоксии были иньекционно подсажены в зону повреждения. Эта процедура привела к увеличению капиллярной плотности поврежденной ткани, а также к торможению апоптотических процессов поврежденных тканей. Причем образцы в условиях гипоксии обладали проангиогенным свойством, а в условиях нормоксии – антиапоптотической активностью. Следует отметить, что увеличивалась митогенная активность кардиомиоцитов и активировались гены, отвечающие за дифференцировку кардиомиоцитов. В целом авторы делают вывод, что мезенхимальные стромальные клетки обладают протекторным эффектом, и их действие отнесено к паракринному влиянию на механизмы ангиогенеза, снижению апоптоза, усилению пролиферативных процессов. В данном научном исследовании результат оценивался как положительный, расширяющий возможности восстановления и реабилитации больных, страдающих ишемической болезнью сердца.