Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные представления о хроническом эндометрите и системе врожденного иммунитета при данной патологии (обзор литературы) 10
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1. Дизайн исследования 39
2.2. Клинико-лабораторные и инструментальные методы исследования .40
2.3. Микробиологические методы исследования 42
2.4. Гистологический метод .45
2.5. Иммунологические методы исследования 46
2.6. Методы статистической обработки результатов исследования 54
ГЛАВА 3. Клинико-лабораторная характеристика женщин с хроническим эндометритом в зависимости от степени активности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки 55
ГЛАВА 4. Показатели врожденного иммунитета цервикальной слизи и эндометриального секрета в зависимости от степени активности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки 89
ГЛАВА 5. Математическая модель прогноза степени активности хронического эндометрита 112
Заключение 131
Выводы .142
Практические рекомендации 144
Список сокращений 145
Список литературы
- Клинико-лабораторные и инструментальные методы исследования
- Иммунологические методы исследования
- Методы статистической обработки результатов исследования
- Показатели врожденного иммунитета цервикальной слизи и эндометриального секрета в зависимости от степени активности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки
Клинико-лабораторные и инструментальные методы исследования
ХЭ представляет собой важную и до сих пор не решенную проблему современной гинекологии [53, 57, 76, 80, 86, 90, 102, 105, 113, 117, 122, 149].
В качестве отдельной нозологической формы ХЭ был впервые выделен в Международной статистической классификации болезней, травм и причин смерти IX пересмотра в 1975 г. До этого времени шла длительная дискуссия о возможности наличия хронического воспалительного процесса в слизистой оболочке тела матки, учитывая свойство функционального слоя эндометрия к циклическому отторжению во время менструации. Тем не менее, исследованиями Б.И. Железнова (1977, 1983), K. Meinen (1981) было доказано, что в воспалительный процесс вовлекается не только функциональный, но и базальный слой слизистой оболочки матки, а иногда и миометрий [32, 33, 190]. На сегодняшний день существование ХЭ в качестве отдельной самостоятельной нозологической единицы не вызывает сомнений, и заболевание выделено в Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем, X пересмотра в блоке рубрик № 70 - № 77 «Воспалительные болезни женских тазовых органов», а именно № 71.1 – «Хроническая воспалительная болезнь матки» (Международная статистическая классификация болезней и проблем, связанных со здоровьем. X пересмотр. Пер. с англ. Женева 1995; 1: 2: 29).
Предложено несколько вариантов определения ХЭ, в последние годы наиболее часто используется понятие Г. Т. Сухих и А. В. Шуршалиной (2013), ХЭ - это клинико-морфологический синдром, характеризующийся комплексом морфофункциональных изменений эндометрия воспалительного генеза, приводящих к нарушению циклической биотрансформации и рецептивности слизистой оболочки тела матки [105]. В то же время, согласно данным зарубежной литературы, ХЭ - морфологический синдром с обязательным присутствием в ткани эндометрия стромального отека, плазматических клеток и воспалительных лимфоидных инфильтратов [133, 200, 207]. При этом клинико-функциональных изменений, характерных для этого заболевания, авторами в полной мере не описывается.
ХЭ способствует развитию нарушений менструальной, секреторной, половой и генеративной функций организма женщины. Морфофункциональные изменения эндометрия являются причиной бесплодия, неудачных попыток вспомогательных репродуктивных технологий, привычного невынашивания беременности, патологического течения беременности и родов, послеродового периода, патологии развития плода и новорожденного [6, 13, 38, 46, 49, 53, 82, 95, 96, 125, 197, 200].
В последнее время активно обсуждается роль воспаления в развитии гиперпластических и неопластических заболеваний слизистой оболочки тела матки [47, 103, 115, 185]. Частота ХЭ в структуре гинекологической патологии и в общей популяции женского населения, по данным разных авторов, колеблется в широких пределах и составляет от 3% до 98% [20, 22, 24, 36, 105, 117, 175, 207]. Это свидетельствует, прежде всего, об отсутствии единых подходов к диагностике данной патологии, об определенных трудностях морфологической верификации диагноза, что в целом ряде случаев может явиться причиной гипердиагностики или, напротив, недооценки серьезности изменений в ткани эндометрия вследствие отсутствия или маловыраженности клинических проявлений. В современных условиях наблюдается тенденция к увеличению частоты развития ХЭ, что констатирует ряд исследователей [24, 57, 97, 105, 122, 125, 165]. Это, очевидно, связано с ростом числа воспалительных заболеваний верхнего отдела репродуктивного тракта, абортов и внутриматочных вмешательств, в том числе эндоскопических методов исследования, применением внутриматочных контрацептивов (ВМК), а также бессимптомным течением некоторых инфекций, передающихся половым путем (ИППП), эволюцией микробного фактора, снижением общей реактивности организма [30, 55, 86, 102, 105, 113, 117, 125, 138, 149, 164, 197]. Частота данной патологии от общего числа биопсий эндометрия варьирует от 2,3 до 19,2% [125, 138, 212, 217]. В настоящее время ХЭ наблюдается у каждой четвертой женщины активного репродуктивного возраста – 25-35 лет [72, 86, 97].
Большой интерес представляют данные литературы о частоте ХЭ у больных с нарушением репродуктивной функции. Многолетние исследования позволили прийти к выводу, что хронический воспалительный процесс в полости матки ассоциирован с повреждением процессов имплантации и плацентации, что является следствием изменения клеточного и молекулярного гомеостаза, наличия иммунопатологических реакций, нарушения ангиогенеза и рецептивной активности ткани [13, 105, 163, 207, 211]. ХЭ выявляется в 12% - 68% случаев среди инфертильных пациенток, достигая своего максимума при трубно перитонеальной форме бесплодия [48, 49, 74, 82, 149, 207]. При повторных неудачах программ ЭКО и репродуктивных потерь в циклах вспомогательных репродуктивных технологий ХЭ составляет самую частую патологию эндометрия и достигает 60% и более [49, 105, 175, 205]. J. Check (2011) показал, что успех применения программ донорских ооцитов зависит не только от качества ооцитов, но также от отсутствия у реципиента хронического воспалительного процесса в эндометрии [140]. Наибольшие показатели распространенности заболевания регистрируются у женщин с привычным невынашиванием беременности – причем цифры варьируют в широких пределах – от 45 до 70% случаев [96, 175, 207]. Радзинский В. Е. (2009), отмечает, что именно хронический аутоиммунный эндометрит идентифицирован как причина невынашивания, в 2 раза более значимая, чем дефицит прогестерона [88]. Особое место в структуре невынашивания беременности занимает неразвивающаяся беременность, составляющая до 20% всех репродуктивных потерь, которую в большинстве случаев связывают с ХЭ [20, 26]. Данные литературы позволяют выделить различные факторы риска, играющие определенную роль в развитии ХЭ. Авторы единодушны в том, что появлению воспалительной реакции в слизистой оболочке матки могут способствовать, прежде всего, выскабливание полости матки по поводу искусственного аборта или выкидыша, инвазивные внутриматочные лечебно-диагностические манипуляции, такие как аспирационная биопсия эндометрия, гистеросальпингография, гистероскопия, диагностические выскабливания, что в целом определяет ятрогенный аспект заболевания [24, 35, 90, 104, 125, 148, 175].
Иммунологические методы исследования
Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов проводили с помощью НСТ-теста. Метод основан на учете интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму – диформазан. Этот процесс происходит вследствие респираторного взрыва, представляющего резкое усиление окислительного метаболизма в активированных фагоцитах, результатом чего является образование целого ряда первичных (перекись водорода, супероксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал) и вторичных (гипохлорная кислота, продукты перекисного окисления липидов, хлорамин) метаболитов, обладающих мощной бактерицидной активностью. Во время данного момента темные гранулы диформазана выпадают внутри нейтрофилов и на их цитоплазматической мембране. Нарушение функции нейтрофильных гранулоцитов к восстановлению НСТ отражает дефекты кислородзависимых механизмов бактерицидности, что может служить прогностическим критерием инфекционных осложнений [67].
НСТ-тест с целью определения внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов цервикального и эндометриального секретов исследовали в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (стимулированном). Постановку метода проводили в модификации А. Н. Маянского и М. Е. Виксмана (1979) [67]. В пробирки с 0,1 мл взвеси клеток цервикального и эндометриального секретов в физиологическом растворе добавляли 0,05 мл 0,2% раствора НСТ в 0,1 мл фосфатного буфера. После 30-минутной инкубации при температуре +370С, центрифугирования пробирок из полученной суспензии готовили мазки, высушивали на воздухе, фиксировали 960 этиловым спиртом и в течение 5 минут окрашивали 0,1% водным раствором сафранина. С помощью световой иммерсионной микроскопии (Zeiss Primo Star) при увеличении 90х10х1,5 осуществляли учет реакции интенсивности спонтанной HCT-восстанавливающей активности. Параллельно оценивали способность нейтрофильных гранулоцитов цервикального и эндометриального секретов отвечать увеличением метаболической активности на стимуляцию частицами латекса. В каждую пробирку со взвесью клеток вносили по 0,1 мл взвеси монодисперсного полистирольного латекса диаметром 1,7 мкм в концентрации 1108 частиц/мл (суспензии микросфер латекса получены из ВНИИСК г. Санкт-Петербурга). В пробирки с 0,1 мл взвеси активированных нейтрофилов добавляли 0,05 мл 0,2 % раствора НСТ в 0,1 мл фосфатного буфера, далее инкубировали смесь 30 мин при +37оС и центрифугировали пробирки. Из полученного осадка готовили мазки, фиксировали этанолом, окрашивали 0,1% раствором сафранина в течение 5 мин. При учете реакции определяли процент НСТ-позитивных клеток и оценивали интенсивность реакции по формуле (2.3):
Исследование способности нейтрофилов к захвату частиц осуществляли по методу Фрейдлин на модели поглощения частиц латекса [114]. С целью оценки фагоцитарной функции в одной пробирке смешивали 0,2 мл суспензии клеток цервикального и эндометриального секретов с 0,02 мл взвеси частиц полистирольного латекса в концентрации 108 частиц/мл, диаметром 1,7 мкм (суспензии микросфер латекса получены из ВНИИСК г. Санкт-Петербурга). После 30-минутной инкубации при температуре 37оС из клеток готовили препараты, высушивали их на воздухе, фиксировали 960 этанолом и окрашивали по Романовскому-Гимзе. При помощи световой иммерсионной микроскопии (Zeiss Primo Star) при увеличении 90х10х1,5 определяли активность фагоцитоза – процент нейтрофилов, которые способны к фагоцитозу (активность фагоцитоза), и число поглощенных частиц латекса на одну клетку на 100 лейкоцитов (интенсивность фагоцитоза).
Метод обнаружения НВЛ основан на обнаружении экстрацеллюлярных сетеподобных структур, состоящих из нуклеиновых кислот и ферментов, которые выделяют нейтрофилы в ответ на микробные и немикробные раздражители. В качестве красителя для окраски ядерного вещества фиксированных нейтрофилов применяли раствор акридинового оранжевого.
Для определения количества внеклеточных ловушек в цервикальном и эндометриальном секретах полученную суспензию в равном объеме смешивали со сложным красителем: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 для окрашивания слизи и жизнеспособных клеток в оранжевый цвет, а также 1 мл красителя Sytox Green в концентрации 1:500 с целью окрашивания внеклеточных волокон ДНК и мертвых клеток в зеленый цвет. Далее полученный раствор инкубировали в течение 5 минут в темноте. Из окрашенного материала производили препарат «раздавленная капля». Учет производили при помощи люминесцентного микроскопа Nikon eclipse 50i, используя фильтры, которые обеспечивали возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. При данном способе окраски ядра нейтрофилов окрашиваются в ярко-зеленый цвет, цитоплазма гранулоцитов не окрашивается, нейтрофильные ловушки представлены в виде тонких ярко-зеленых нитей, занимающих пространство, превосходящее диаметр неизмененного нейтрофила в 2–3 раза, а бактерии-активаторы имеют ярко-оранжевый цвет. По дифференцированному окрашиванию все структуры разделили на 4 группы: в 1 группу включались жизнеспособные клетки ярко-оранжевого цвета; 2 группа была представлена клетками с зеленым ядром и ярко- оранжевой цитоплазмой, то есть клетки, вероятно, подвергшиеся апоптозу; 3 группа - погибшие клетки зеленого цвета; 4 группа – свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие из себя нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные внеклеточные ловушки). Осуществляли подсчет 100 структур разных групп и исследовали процентное содержание каждой морфологической единицы [78].
Методы статистической обработки результатов исследования
Ведущей жалобой у обследованных пациенток с хроническим воспалительным процессом слизистой оболочки матки являлись боли (71,67%). Среди пациенток с высокой и умеренной степенями активности данная жалоба регистрировалась в 84% и 66,67% случаев соответственно, что достоверно чаще по отношению к группам пациенток с низкоактивным и неактивным ХЭ (43,18% и 10,64% соответственно; р 0,05). При сравнении последних двух групп отмечено, что боли внизу живота достоверно больше отмечали женщины с низкой степенью активности (р 0,05). Боли локализовались в нижнем отделе живота, по характеру были ноющими, различной степени интенсивности, периодическими.
У пациенток I (32%), II (35,56%) и III (32,95%) групп достоверно чаще по сравнению с пациентками IV группы наблюдений (8,51%) отмечен патологический характер выделений из половых путей (р 0,05).
На момент обследования доля пациенток, предъявляющих жалобы на НМЦ, составила 28,29%, из них несколько больше с ХЭ низкой (32,95%) и умеренной степенями активности (26,67%) по сравнению с больными с неактивным и высокоактивным хроническим воспалительным процессом (23,4% и 24% соответственно).
Зуд, жжение в области половых органов отмечали 24,17% женщин с ХЭ. При этом количество таких пациенток не имело статистических различий, но было несколько ниже в группе с неактивным эндометритом. Жалобы на болезненный половой акт предъявляли 9,17% пациенток, что соответствовало примерно одинаковой частоте встречаемости во всех четырех группах исследования.
При проведении бимануального влагалищного исследования каких-либо особенностей, характерных для той или иной группы обследованных больных, выявлено не было. У всех больных основными симптомами, свидетельствующими о наличии хронического воспалительного процесса в матке и придатках, явились: некоторое увеличение и уплотнение матки, ограничение ее в подвижности. Таблица 3.16 – Жалобы женщин с хроническим эндометритом
Примечание: n1 - число обследованных женщин, имеющих данный признак; % - процент встречаемости в данной группе; р – достоверность отличий между группами (р 0,05); N/s – различия статистически не значимы
Как видно из таблицы 3.17, чаще всего ХЭ на момент обследования сочетался с хроническим двусторонним сальпингоофоритом, миомой матки, цервицитом и вагинитом (57,56%; 46,34%; 39,5% соответственно). Миома матки достоверно чаще имела место у пациенток с умеренноактивным (42,22%), низкоактивным (48,86%) и неактивным (63,83%) воспалительным процессом слизистой оболочки матки по сравнению с больными высокоактивным ХЭ (12%; р 0,05). При изучении структуры инфекционной патологии нижнего отдела репродуктивного тракта у обследованных пациенток установлено, что наиболее частым заболеванием оказался хронический цервицит, который регистрировался с большей частотой в I группе (52%), а во II, III и IV (48,89%, 36,36%, 29,79% соответственно) несколько реже. Бактериальный вагиноз встречался незначительно чаще в группе женщин с умеренной и низкой степенями активности (26,67% и 28,41%) по сравнению с пациентками с высокоактивным и неактивным ХЭ (24%, и 19,15% соответственно).
ЦИН 1 степени при обследовании выявлена только в группах больных с низкоактивным и неактивным ХЭ, доля которых составила 2,27% и 2,13% случаев соответственно. Лейкоплакия шейки матки зарегистрирована только у одной женщины IV группы (2,13%) среди всех обследованных с хроническим воспалительным процессом слизистой оболочки матки.
Примечание: n1 - число обследованных женщин, имеющих данный признак; % - процент встречаемости в данной группе; р – достоверность отличий между группами (р 0,05); N/s – различия статистически не значимы
При этом следует отметить, что у 32,19% женщин регистрировалась субфебрильная температура, повышение количества лейкоцитов в общем анализе крови, повышение С-реактивного белка. Эти проявления достоверно чаще наблюдались в группе с высокоактивным ХЭ (76%) по сравнению с пациентками с воспалительным процессом низкой степени активности (23,86%; р 0,05) и несколько чаще, чем среди больных с умеренноактивным (53,33%).
При проведении общего анализ крови повышение числа лейкоцитов отмечено среди пациенток I и II групп в 52% и 42,22% случаев соответственно, что достоверно чаще по отношению к женщинам III и IV групп (р 0,05) (таблица 3.18). При сравнении последних двух групп выявлено, что данный параметр достоверно чаще определялся у больных с низкой степенью активности (17,04%; р 0,05). При этом воспалительные изменения в общем анализе крови у пациенток с неактивным ХЭ зарегистрированы не были.
Показатели врожденного иммунитета цервикальной слизи и эндометриального секрета в зависимости от степени активности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки
Таким образом, проведенные исследования выявили общие закономерности в изменении со стороны клеточных и гуморальных факторов системы местной противоинфекционной защиты при различной активности воспалительного процесса в эндометрии. При оценке состояния клеточных факторов иммунитета установлено, что для ХЭ высокой, умеренной, низкой степеней активности, по сравнению с неактивным, характерно – повышение общего количества лейкоцитов, усиление лизосомальной активности, повышение активности и интенсивности спонтанного и индуцированного НСТ-теста, снижение активности и интенсивности фагоцитоза, фагоцитарного числа, уменьшение количества живых клеток, увеличение количества НВЛ.
Со стороны гуморального иммунитета установлены следующие различия в зависимости от степени активности ХЭ: концентрация в большей степени была повышена при активном воспалении в цервикальном и эндометриальном секретах как провоспалительных (IL-1, IL-1, IL-8 и TNF-), так и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10 и RAIL-1). Изучение спектра бактерицидных факторов, таких как дефензины, BPI, а также концентрации sTREM-1, у обследованных женщин также выявило однонаправленное повышение данных показателей и в цервикальном секрете, и в эндометриальной слизи при увеличении степени активности ХЭ.
При корреляционном анализе выявлено, что уровень иммунологических показателей возрастает параллельно увеличению выраженности воспалительного процесса в слизистой оболочке матки, а также продемонстрировано однонаправленное повышение и в цервикальном секрете, и в эндометриальной слизи параметров клеточного и гуморального иммунитета.
В процессе исследования была проведена характеристика основных иммунологических параметров цервикального и эндометриального секретов при ХЭ в зависимости от степени активности воспалительного процесса.
Установлено, что большинство изученных показателей клеточных и гуморальных факторов местной противоинфекционной резистентности ярко реагировали на активность хронического воспаления, отражая достоверные отличия при межгрупповом сравнении клинико-морфологических форм.
Исходя из этого, нами была предпринята попытка разработать клинико иммунологические критерии диагностики степени активности ХЭ с помощью построения математических моделей на основе дискриминантного анализа, явившихся основой для создания компьютерной программы ЭВМ прогнозирования степени активности воспалительного процесса у больных с ХЭ. Процедура дискриминантного анализа применялась к массиву бинарных и числовых переменных, отражающих наличие или отсутствие признака или его значение. Искалось классификационное правило, позволяющее отнести пациентку к группам с неактивным эндометритом и группам с низкой, умеренной и высокой степенями активности ХЭ. Применялся пошаговый анализ с включением признаков и минимизации расстояний Махаланобиса. При пошаговом анализе на каждом шаге находилась та переменная, которая вносила наибольший вклад в различие между совокупностями. Эта переменная включалась в модель на данном шаге, и происходил переход к следующему шагу. На обучающей выборке из 202 пациенток, у которых был выполнен весь спектр клинико-иммунологического обследования, построена модель, включающая данные анамнеза, клинического осмотра, лабораторных и иммунологических методов исследования в качестве дискриминирующих переменных. Контрольную группу составили 30 женщин с ХЭ.