Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Хронический эндометрит: современные представления о проблеме (обзор литературы). 14
1.1 Структура внутриматочной патологии у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия 14
1.2 Роль УЗИ в диагностике патологии эндометрия 19
1.3 Роль гистероскопического исследования в диагностике хронического эндометрита у пациенток с бесплодием 21
1.4 Морфологическое, иммуногистохимическое и молекулярно-генетическое исследование при хроническом эндометрите 23
1.5 Влияние хронического эндометрита на исходы программ ЭКО и ПЭ и эффективность антибактериальной терапии 26
1.6 Современные представления о рецептивности эндометрия 31
Глава 2. Материал и методы исследования 44
2.1 Дизайн исследования 44
2.2 Методы исследования 48
2.2.1 Общеклинические методы исследования 48
2.2.2 Специальные методы исследования 49
2.3. Комплексное лечение при хроническом эндометрите 55
2.4. Программа ЭКО и ПЭ 56
2.5 Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 60
3.1 Клиническая характеристика пациенток 60
3.2 Результаты клинико-лабораторных методов обследования 67
3.2.1 Особенности гормонального статуса 67
3.2.2. Данные ультразвукового исследования 69
3.2.3 Сравнительный анализ диагностических возможностей различных методов обследования при хроническом эндометрите в первую и вторую фазы менструального цикла 71
3.2.4 Анализ клинической значимости признаков хронического эндометрита при отсутствии плазмоцитов 81
3.3 Эффективность прегравидарной подготовки пациенток с неполным морфологическим комплексом хронического эндометрита 89
3.3.1 Влияние прегравидарной подготовки на гистологические и иммуногистохимические параметры эндометрия 90
3.3.2 Влияние прегравидарной подготовки на молекулярно-генетические параметры эндометрия 92
3.3.3 Характеристика циклов ЭКО и ПЭ 95
3.3.4 Эффективность программы ЭКО и ПЭ 96
3.4 Поиск предикторов наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ у женщин с хроническим эндометритом 99
3.4.1 Иммуногистохимическая и молекулярно-генетическая характеристика биоптатов «имплантационного» эндометрия у пациенток с наличием
плазмоцитов в зависимости от исхода лечения в программе ЭКО и ПЭ 101
3.4.2 Имуногистохимическая и молекулярно-генетическая характеристика биоптатов эндометрия у пациенток с отсутствием плазмоцитов и женщин контрольной группы в зависимости от исхода лечения в программе ЭКО и ПЭ 105
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 115
Выводы 140
Практические рекомендации 142
Список сокращений 143
Список литературы 145
- Роль УЗИ в диагностике патологии эндометрия
- Специальные методы исследования
- Сравнительный анализ диагностических возможностей различных методов обследования при хроническом эндометрите в первую и вторую фазы менструального цикла
- Имуногистохимическая и молекулярно-генетическая характеристика биоптатов эндометрия у пациенток с отсутствием плазмоцитов и женщин контрольной группы в зависимости от исхода лечения в программе ЭКО и ПЭ
Роль УЗИ в диагностике патологии эндометрия
В настоящее время общепризнанная классификация хронического эндометрита – это классификация по этиологическому фактору, предложенная в 2002 году [62]. Согласно данной классификации различают: неспецифический эндометрит: специфическая микрофлора в эндометрии не выявляется. Развивается на фоне ВМС, лучевой терапии органов малого таза, при бактериальном вагинозе, у ВИЧ-инфицированных пациенток; специфический эндометрит: хламидийные – Chlamydia trachomatis, вирусные – вирус простого герпеса (ВПГ), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), энтеровирусы; бактериальные – Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Actinomyces israelii, Treponema pallidum; микоплазменные - Mycoplasma hominis; грибковые – Candida, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis, Cryptococcus glabratus; протозойные – Toxoplasma gondii, Schistosoma haematobium; паразитарные -Enterobius vermicularis. Саркоидоз [62].
Как видно из классификации, хронический эндометрит может быть вызван множеством инфекционных агентов, таких как бактерии, вирусы и паразиты. Но, почти в 70% случаев воспалительных заболеваний органов малого таза применение рутинных методов диагностики не позволяет выявить возбудителя. В последнее время внедряется в практику применение молекулярно-генетических маркеров воспаления, которые могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода – полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований. Преимуществами данного метода являются быстрота, высокая специфичность и чувствительность [3]. Однако, несмотря на внедрение современных молекулярно-генетических технологий, идентификация возбудителя остается сложной задачей.
По мнению большинства исследователей, наиболее характерным при хроническом эндометрите является наличие двух-трех видов облигатно-анаэробных микроорганизмов и вирусов [3; 45; 48; 64; 115].
В исследовании, проведенном в 2014 г Бурменской О.В., продемонстрирована ведущая роль при хроническом эндометрите в полости матки бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp) [3]. Cicinelli E. и соавт. в 2014 году выявили возбудителя воспаления лишь у 48 (77%) из 61 пациентки с хроническим эндометритом. При этом в 34 (70,7%) случаях из 48 преобладали бактерии (Escherichia Coli, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, и др.). Mycoplasma и Ureaplasma urealyticum были выявлены в 14 (29,6%) случаях, Chlamydia – в 4 (8,4%) случаях [115].
По данным Зароченцевой Н.В. у пациенток с хроническим эндометритом и привычным невынашиванием беременности генитальный герпес был выявлен у 68 %, цитомегаловирус - у 36%, вирус Эпштейна-Барра - у 20%, ВПЧ у 54%, Candida - 58%, Gardnerella vaginalis - у 40%, Chlamydia - у 4%, Ureaplasma urealyticum - у 16 % и Mycoplasma - у 24% женщин [48].
Согласно исследованию, проведенному Гомболевской Н.А., Марченко Л.А. и Муравьевой В.В. при изучении микрофлоры генитального тракта женщин с хроническим эндометритом выявили условно-патогенные микроорганизмы в эндометрии у каждой второй пациентки (55,0%). Наиболее часто в гомогенате эндометрия среди условно-патогенных микроорганизмов обнаруживали
Gardnerella vaginalis (29,4% случаев), Enterococcus faecalis (17,6%), Escherichia сoli (11,8%). В группе контроля в биоптате эндометрия рост УПМ не выявлен. Этиологическая роль абсолютных патогенов, генитальных микоплазм и ВПГ 1 и 2 типа не была подтверждена. ЦМВ выявлен в 2,4% случаев. Установлена сильная прямая связь между изменениями вагинальной микрофлоры и выявлением УПМ в биоптате эндометрия (r=0,76, р 0,05) [43].
В исследовании Рудаковой Е.Б. и соавт. в 2012 году при бактериологическом исследовании содержимого полости матки у пациенток с хроническим эндометритом бактериальная контаминация составила 48,6 ± 5,9%, у пациенток без хронического эндометрита — 16,4 ± 4,5% (p 0,001). Причем у пациенток основной группы преобладала контаминация энтерококком (30,2%), тогда как у пациенток, не страдающих ХЭ, с равной частотой определялись Enterococcus faecalis и Staphylococcus epidermidis (в 26,7% случаев). Авторы сделали вывод о том, что у пациенток с хроническим эндометритом, имеющим хотя бы одну безуспешную попытку ЭКО и ПЭ в полости матки преобладают условно-патогенные микроорганизмы и вирусы. При этом бактериальная обсемененность полости матки у пациенток с хроническим эндометритом и контрольной группы составила 48,6% и 16,4% соответственно (р 0,001) [38].
Специальные методы исследования
Биопсию эндометрия для оценки рецептивности проводили в амбулаторных условиях в день менструального цикла ЛГ+7, который определяли с помощью мочевого теста Clear Blue («Unipath Ltd», Великобритания), основанного на определении увеличения уровня ЛГ в моче. С помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier («LaboratorieC.C.D.», Франция) получали биоптат эндометрия, который был поделен для 2 части: для морфологического и иммуногистохимического исследования, а также для молекулярно-биологического исследования
Хирургические вмешательства проводили в отделении сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ «НЦАГиП им. Кулакова Минздрава РФ - руководитель. к.м.н. Абубакиров А.Н.)
Материал для морфологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливали в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала не превышало 48 часов. Затем готовились серийные парафиновые срезы (не менее 12 серийных срезов) толщиной 4 - 5 микрон. Срезы фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировали в термостате при 370С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировали и обезвоживали в батарее из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70% спирта и дистиллированной воды. По стеклу от каждого случая окрашивали гематоксилин-эозином. Исследование гистологических препаратов проводили в световом микроскопе при увеличении от х50 до х400.
Критериями морфологической диагностики ХЭ явились [24; 113]: S наличие в строме эндометрия плазматических клеток; S воспалительные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоидных элементов; S очаговый фиброз стромы; S склеротические изменения стенок спиральныых артерий эндометрия.
В случае выявления всех морфологических признаков из вышеуказанного перечня ставили диагноз «хронический эндометрит». При наличии у пациентки хотя бы одного из вышеперечисленных морфологических признаков, но без плазматических клеток, использовали термин «остаточные явления ХЭ», или «неполная морфологическая картина ХЭ».
Гистологическое исследование проводили в 1 патологоанатомическом отделении ФГБУ “НЦ АГиП им. В.И.Кулакова” Минздрава РФ (руководитель -д.м.н., проф. Е.А. Коган) в соответствии с современными стандартами, изложенными в общепринятых фундаментальных руководствах [16].
Иммуногистохимическое исследование для определения уровня экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, LIF проведено в серийных парафиновых срезах биоптатов эндометрия. Демаскировку антигенов проводили в ретривере при 100 С. Срезы промывали в дистиллированной воде и буферном растворе. Неспецифическое связывание антител блокировалось путем инкубации с 10% эмбриональной телячьей сывороткой в течение 20 минут, после чего при комнатной температуре на 1 час добавлялись моноклональные мышиные антитела к эстрогеновым рецепторам а - clone 1D5 (Dako, США; разведение 1:35), моноклональные к прогестероновым рецепторам - clone 636 (Dako, США; разведение 1:50), мышиные моноклональные антитела к LIF - clone 9824, mouse anti-human antibody (R@D Systems, США, разведение 1:100). Ставили положительные и отрицательные контроли.
Анализ результатов для ER- и PR проводили с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета Histo-score по формуле: HS=1а + 1b + Зс. Где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно, с -% интенсивно окрашенных клеток. 1,2,3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ER и PR расценивали: 0-10 % – отсутствие экспрессии, 11-100 % – слабая экспрессия, 101-200 % – умеренная экспрессия, 201-300 % – выраженная экспрессия. Результаты реакций для LIF оценивались по окрашиванию цитоплазмы клеток поверхностного эпителия и желез, стромы и пиноподий в эндометрии. Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия проводилось в I-ом патологоанатомическом отделении ФГБУ «НЦАГиП им. Кулакова» Минздрава РФ (руководитель – д.м.н. профессор Коган Е.А.) Материалы биоптатов эндометрия для молекулярно-генетического исследования помещали в пробирки со средой для стабилизации РНК (лизирующий растовор из комплекта реагентов «Проба-НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).
В биоптатах энометрия проанализирован уровень 39 мРНК генов (маркеров ростовых факторов: AREG, IGFBP1, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP4, VEGFA (общий и изоформа 189), HBEGF, IGF2; цитокинов: IL1B, IL2, LIF, LIFR, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL15, IL18, TGFB1, TNFA, OSM; поверхностных маркеров клеток иммунной системы: CD45, CD56, CD68; матриксных металлопротеиназ: ММР2, ММР7, ММР8, ММР9, ММР11; генов гомеобокса: HOXA10, HOXA11, MSX1/HOX7; циклооксигеназы PTGS2; эстрогенового ESR1 и прогестеронового PGR рецепторов; маркеров апоптоза: BCL2, BAX, PTEN). Оценку уровня экспрессии мРНК проводили с помощью количественной полимеразной цепной реакции с предварительной стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Метод основан на лизисе клеток в 4М растворе гуанидинтиоционата и осаждения нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном.
Сравнительный анализ диагностических возможностей различных методов обследования при хроническом эндометрите в первую и вторую фазы менструального цикла
Всем 133 супружеским парам, включенным в настоящее исследование, было проведено лечение в программе ЭКО и ПЭ. Параметры стимуляции функции яичников, фолликулогенеза, оогенеза, и раннего эмбриогенеза у пациенток, включенных в исследование представлены в таблице 3.24
Данные таблицы 3.24 показывают, что оцениваемые показатели стимулированного цикла не имели значимых межгрупповых различий.
Так средняя стартовая доза гонадотропинов у женщин 1 группы составила 181,4±38,1 ME, у пациенток 2 группы - 196±33,7 ME, курсовая доза гонадотропинов - 1592,7±256,2 ME и 1585,3±241,4 ME, количество дней стимуляции - 9,7±1,4 и 9,8±1,9 соответственно.
Количество фолликулов диаметром 17 мм в день введения триггера овуляции составило в среднем в двух группах 9,0±3,4 и 8,8±4, количество полученных ооцитов - 7,5±3,4 и 7,9±3,6, полученных эмбрионов 5,5±2,7 5,8±3,1 соответственно. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли на 3 или 5 сутки после проведения ТВП и забора ооцитов. При этом пациенткам 1 группы перенос на 3-й и 5-е сутки проводили в 34,7% и 65,3% случаев, а пациенткам 2 (контрольной) группы - в 31,0% и 69,0% случаев.
Сравнительные данные о частоте наступления беременности и ее исходов у 133 женщин, включенных в настоящее исследование представлены в таблице 3.25. Таблица 3.25. Эффективность программы ЭКО и ПЭ и исходы беременностей Исход лечения в 1 группа (n=75) 2 группа (контрольная) Различия между 1а подгруппа 1б подгруппа программе ЭКО и п=15 п=60 ТПБ группами, р ПЭ плазмоциты+ плазмоциты - без ХЭ n=58 п=27 п=33 Лечение Лечение Лечение (+) (+) (-) Положительный 7 10 15 28 NS анализ крови на (46,7%) (37,0%) (45,5%) (48,2%) ХГЧ, n (%) Частота имплантации, % 23,3% 24,1% 22% 24,1% NS
Клиническая беременность, n (%) 6 (40,0%) 10 (37,0%) 12 (36,4%) 25 (43,1%) NS Самопроизвольный выкидыш, n 1 0 1 2 NS Роды живым плодом, n (%) 5 (83,3%) 10 (100%) 11 (91,7%) 23 (92%) NS Согласно данным таблицы 3.25, частота наступления клинической беременности при проведении программы ЭКО и ПЭ у пациенток 1 и 2 групп существенно не различалась и составила 37,3 %, и 43,1% соответственно (p=0,593).
При проведении дальнейшего анализа было выявлено, что из 15 пациенток 1а подгруппы с наличием плазмоцитов или полным морфологическим комплексом хронического эндометрита после проведения комплексной прегравидарной подготовки, включающей назначение антибактериальных препаратов широкого спектра действия, физиотерапевтического лечения с достижением противовоспалительного и гестагенов во 2 фазу цикла, клиническая беременность была диагностирована у 6 женщин (40%) и у 5 (83,3%) из них завершилась срочными родами.
Из 27 женщин с неполным морфологическим комплексом хронического эндометрита (без плазмоцитов) и проведенной прегравидарной подготовкой, включающей физиотерапевтическое лечение с достижением трофического и дефиброзирующего эффектов, а также циклическую гормональную терапию, клиническая беременность наступила у 10 пациенток (37%) и завершилась срочными родами в каждом случае. При анализе данных был получен несколько неожиданный результат о частоте наступления беременности у 33 аналогичных женщин, но без проведения прегравидарной подготовки. Согласно полученным результатам, беременность наступила у 12 (36,4%) из них и завершилась срочными родами у 11 женщин (91,7%).
Таким образом, эффективность программы ЭКО и ПЭ у женщин с неполным морфологическим комплексом хронического эндометрита (без плазмоцитов) независимо от проведения прегравидарной подготовки оказалась сопоставимой по частоте наступления беременности и ее исходам.
Оценив сравнительные данные о частоте наступления беременности у женщин с различными морфологическими признаками хронического эндометрита, мы проанализировали гормональные и эмбриологические параметры стимулированных циклов у пациенток с положительным и отрицательным исходом программы ЭКО и ПЭ (таблица 3.26).
Данные таблицы 3.26 не демонстрируют статистически значимых различий, касающихся средней стартовой и курсовой дозы гонадотропинов, количестве дней стимуляции, числу фолликулов Д 17 мм в день введения триггера овуляции, среднем количестве полученных ооцитов и эмбрионов, а также суткам переноса эмбрионов в полость матки.
Таким образом, полученные данные отмечают отсутствие влияния гормональных и эмбриологических параметров стимулированного цикла на исходы программ ЭКО и ПЭ в данном исследовании у женщин с различными морфологическими признаками хронического эндометрита.
Поиск предикторов наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ у женщин с хроническим эндометритом На предыдущих этапах данного исследования были выявлены молекулярно генетические диагностические маркеры, ассоциированные с полным морфологическим комплексом хронического эндометрита при наличии плазмоцитов и его неполным морфологическим комплексом, при отсутствии плазмоцитов. Поэтому последующий анализ результатов исследования был направлен на оценку значимости этих маркеров для предсказания наступления беременности в программе ЭКО и ПЭ.
Имуногистохимическая и молекулярно-генетическая характеристика биоптатов эндометрия у пациенток с отсутствием плазмоцитов и женщин контрольной группы в зависимости от исхода лечения в программе ЭКО и ПЭ
Интересно, что предикторами успеха программы ЭКО и ПЭ у пациенток 1б подгруппы с остаточными явлениями хронического эндометрита и пациенток 2 (контрольной) группы являлись совершенно другие маркеры, чем у пациенток 1а подгруппы с наличием плазмоцитов.
У пациенток с отсутствием плазматических клеток в эндометрии уровень экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов (IL8, IL1B) отличался в зависимости от исхода лечения в программе ЭКО и ПЭ. У пациенток с отрицательным результатом программы ЭКО экспрессия мРНК IL8 и IL1B оказалась значимо выше, чем у женщин с наступившей беременностью в 1,6 (р=0,010) и 1,5 (р=0,013) раза соответственно.
Тем не менее, ROC-анализ продемонстрировал низкую прогностическую ценность каждого из этих маркеров по отдельности (AUC составила 0,635 (0532-0,739) и 0,640 (0,537-0,744) соответственно). Для повышения диагностической значимости был проведен анализ вероятности наступления беременности в зависимости от сочетания уровня экспрессии генов IL1B и IL8. В качестве диагностически значимого уровня экспрессии соответствующего гена были использованы пороговые уровни, полученные в результате ROC-анализа.
У пациенток с остаточными явлениями хронического эндометрита и женщин контрольной группы диагностически значимым в отношении вероятности наступления беременности явилось сочетание уровней экспрессии мРНК генов IL1B и IL8. При низком уровне экспрессии обоих маркеров беременность наступала в 81,3 %. При высоком уровне экспрессии одного маркера вероятность наступления беременности составляла 41,5 %, а при высоком уровне двух маркеров - 24 %.
В исследовании Бурменской О.В. (2014 год) выявлено изменение цитокинового каскада и повышение экспрессии мРНК генов IL1B и IL8 при склерозировании сосудов и фиброзе стромы эндометрия, тогда как в нашем исследовании имел значение уровень указанных генов при прогнозировании беременности в программе ЭКО и ПЭ [3]. Очевидно, что перспективным направлением дальнейших научных исследований является разработка тактики прегравидарной подготовки, направленной на снижение уровня мРНК генов IL1B и IL8 перед проведением программы ЭКО и ПЭ. Важно отметить, что литературные данные указывают на то, что продукцию IL1B снижают макролиды, в связи с чем возможным перспективным направлением может явиться изучение целесообразности применения препаратов этой группы для повышения эффективности циклов ЭКО у данного контингента женщин [74; 90; 109].
IL1B - многофункциональный цитокин с широким спектром действия, играющий ключевую роль в развитии и регуляции неспецифической защиты и специфического иммунитета. Он одним из первых включается в ответную защитную реакцию организма при действии патогенных факторов. Синтезируется и выделяется преимущественно макрофагами и моноцитами. В его продукции могут принимать участие лимфоциты, фибробласты. Клетками-мишенями этого цитокина являются иммунокомпетентные, эндотелиальные, эпителиальные клетки, фибробласты и др. Он стимулирует и регулирует воспалительные и иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, стимулирует синтез белков острой фазы, повышает фагоцитоз, гемопоэз, проницаемость сосудистой стенки, цитотоксическую и бактерицидную активность, стимулирует продукцию АКТГ и высвобождение IL2. IL1 участвует в регуляции температуры тела, его повышенная продукция приводит к развитию лихорадки. Действуя как местный индикатор воспаления, IL1 способствует выбросу гистамина, плазминогена, эйкозаноидов и свободных радикалов клетками воспалительного инфильтрата [74; 90; 109].
Ген IL8 расположен на 4 хромосоме (4q12-q13) и является мощным хемокином, участвующим в хемотактсисе нейтрофилов. Под действием IL8 происходит активация нейтрофилов и их миграция в очаг воспаления [125].
Уникальность IL8 заключается в том, что, будучи одним из самых ранних медиаторов воспаления, этот цитокин долгое время находится в очаге воспаления [79]. Также показан ангиогенный эффект IL8 [84; 130]. Заключая обсуждение результатов настоящего исследования необходимо отметить, что полученные нами данные, основанные на комплексной морфологической и молекулярно-генетической оценке состояния имплантационного эндометрия позволили определить что: - морфологическую диагностику хронического эндометрита целесообразно проводить в 1 фазу менструального цикла, так как в среднюю стадию фазы секреции точность диагностики снижается более чем в 2 раза; - повышение мРНК гена VEGFА ( 0,250) в среднюю стадию фазы секреции, с чувствительностью 64% и специфичностью 89% ассоциирована с наличием плазмоцитов в 1 фазе менструального цикла; - молекулярно-генетическими особенностями эндометрия средней стадии фазы секреции при наличии плазмоцитов является увеличение мРНК VEGFА в 1,7 раз, VEGFA189 - в 2,4 раза, IGFBP1 - в 16,6 раза, CD68 - в 2 раза, а так же снижение экспрессии мРНК гена IL2 в 1,5 раза по сравнению с пациентками, у которых плазмоциты отсутствуют; - частота наступления беременности у женщин с хроническим эндометритом при наличии плазмоцитов после проведении комплексной прегравидарной подготовки с антибактериальным и противовоспалительным компонентами составила 40%;