Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Современные представления о рецептивности эндометрия 14
1.2. Протеомные маркеры рецептивности эндометрия 23
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы исследования 35
2.2. Методы исследования 37
2.2.1. Клинико-анамнестический метод 37
2.2.2. Ультразвуковой метод 38
2.2.3. Определение уровней гормонов в периферической крови 38
2.2.4. Бактериологический метод 39
2.2.5. Морфологический метод исследования эндометрия 40
2.2.5.1. Гистологическое исследование эндометрия 40
2.2.5.2. Иммуногистохимическое исследование экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в эндометрии 41
2.2.5.3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии 42
2.2.6. Статистический метод исследования 44
Глава 3. Результаты собственных исследований 45
3.1. Клинико-анамнестические характеристики и результаты общего лабораторного обследования женщин основной и контрольной групп 45
3.2. Результаты гормонального и ультразвукового обследования женщин основной и контрольной групп 54
3.3. Результаты морфологического исследования эндометрия женщин основной и контрольной групп 57
3.3.1. Результаты гистологического исследования эндометрия женщин основной и контрольной групп 57
3.3.2. Результаты иммуногистохимического (счет E R , P R ) и гистологического исследований эндометрия женщин основной и контрольной групп 61
3.3.3. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с результатами гистологического и иммуногистохимического (счет ER, PR) исследований слизистой тела матки и результатами гормонального обследования женщин основной и контрольной групп 70
3.3.3.1. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии у женщин основной и контрольной групп 74
3.3.3.2. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с результатами гистологического исследования слизистой тела матки у женщин основной и контрольной групп 77
3.3.3.3. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с вариантами гормонально-рецепторного эндометриального взаимодействия 80
3.3.3.4. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии ER, PR, лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с различной функциональной активностью желтого тела яичника 87
3.4. Результаты дискриминантного, корреляционного и логико-структурного анализа клинико-анамнестических данных, результатов лабораторного обследования пациенток и морфологического исследования эндометрия 92
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 99
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список сокращений и условных обозначений 123
Список литературы 126
- Современные представления о рецептивности эндометрия
- Клинико-анамнестические характеристики и результаты общего лабораторного обследования женщин основной и контрольной групп
- Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с результатами гистологического и иммуногистохимического (счет ER, PR) исследований слизистой тела матки и результатами гормонального обследования женщин основной и контрольной групп
- Результаты дискриминантного, корреляционного и логико-структурного анализа клинико-анамнестических данных, результатов лабораторного обследования пациенток и морфологического исследования эндометрия
Современные представления о рецептивности эндометрия
Нарушения женской репродуктивной функции остаются важнейшей медицинской, социальной, демографической проблемой в России. В нашей стране 17% супружеских пар являются бесплодными, данный показатель не имеет тенденции к снижению [40]. Основным методом коррекции бесплодия являются дорогостоящие программы вспомогательных репродуктивных технологий, эффективность которых составляет не более 40% [10, 55]. Большая часть репродуктивных потерь приходится на невынашивание беременности ранних сроков. Преодоление репродуктивных девиаций является главным резервом повышения рождаемости [35]. В настоящее время активно изучается роль эндометриального фактора в патогенезе репродуктивных дисфункций.
Эндометрий является специализированной, гормонально регулируемой популяцией клеток, которая характеризуется рядом циклических морфологических и биохимических изменений, необходимых для создания оптимальных условий для развития эмбриона [37]. Эндометриальная ткань играет ключевую роль в процессе имплантации бластоцисты, который представляет собой интеграцию и взаимный обмен сигналами между эндометрием и плодным яйцом. Морфофункциональное состояние слизистой тела матки определяет ее рецептивные возможности [14].
Впервые понятие рецептивности эндометрия появилось в 50-х годах XX века. В тот период исследователям была доступна морфологическая оценка характеристик слизистой тела матки в норме, при патологии, а также на фоне использования революционных для того времени гормональных препаратов. Тогда же появились понятия «стероидной рецепции» и «рецепторного аппарата» эндометрия [15].
В середине прошлого столетия P. Vigano и соавт. (1945) высказали «провокационную» и в настоящее время мысль: бластоциста может имплантироваться в любую ткань организма без предшествующей подготовки, кроме нерецептивного эндометрия. Это суждение было подтверждено на рубеже XXI века работой группы ученых под руководством G. Delage (1995) [64]. Они выяснили, что спонтанная или смоделированная в эксперименте эктопическая беременность может наступить практически в любой ткани человеческого организма, однако имплантация плодного яйца в эндометрий возможна лишь в определенный период, называемый «окном» имплантации [15].
Совокупность структурно-функциональных характеристик слизистой тела матки, обеспечивающих оптимальные условия для имплантации бластоцисты, определяют как рецептивность эндометрия [36, 44, 95]. Слизистая тела матки обладает наибольшими рецептивными возможностями в период «окна» имплантации. Этот период наступает на 6-8-й дни после овуляции, что обычно соответствует 20-22 дням 28-дневного менструального цикла [51, 71, 82, 156].
Имплантация плодного яйца – это сложный многоэтапный механизм взаимодействия трофобласта и эндометрия, который находится под контролем многочисленных факторов: про- и противовоспалительных цитокинов, молекул клеточной адгезии, различных ауто- и паракринных модуляторов. Имплантация является критическим периодом для благополучного сохранения беременности [41, 95].
Успех имплантации зависит от трех факторов: качества эмбриона, функциональной зрелости и рецептивности эндометрия, а также состояния репродуктивной функции женщины в целом [10]. В настоящее время наиболее изученным участником процесса имплантации является бластоциста, задача которой состоит в нахождении места прикрепления и внедрении в эндометрий путем инвазии трофобласта [67].
Механизмы предимплантационного развития эндометрия и взаимодействия молекулярных факторов, которые регулируют этот процесс, многокомпонентны. Через 6-7 дней после оплодотворения бластоциста попадает в полость матки и начинает внедрение в эндометрий, что представляет суть имплантации [93, 154]. Имплантация плодного яйца протекает в три фазы. Первой фазой является аппозиция, которая характеризуется морфофункциональными изменениями в люминальных и железистых клетках слизистой тела матки. Начинается «диалог» между бластоцистой и рецептивным эндометрием, который регулируется локальным воздействием гормонов и различными паракринными модуляторами: цитокинами (интерлейкином-1 (ИЛ-1), интерлейкином-6 (ИЛ-6), лейкемия ингибирующим фактором (ЛИФ)), различными факторами роста (гранулоцитарно-макрофагальным фактором роста (GM-CSF), сосудисто-эндотелиальным фактором роста (VEGF), трансформирующим фактором роста (TGF)) [41, 55]. На данном этапе бластоциста находится в поиске подходящей локализации для дальнейшей инвазии [149].
Вторая фаза процесса имплантации плодного яйца – фаза адгезии – проявляется усиленным функциональным и физическим взаимодействием между бластоцистой и люминальным эпителием слизистой тела матки. На данном этапе уже выражены структурно-морфологические изменения эндометрия. Контакт осуществляется между трофобластом и поверхностным эпителием слизистой тела матки, где к этому времени происходит интенсивное образование «зрелых пиноподий». Этот процесс опосредуется множественными молекулами адгезии и их лиганд-рецепторными взаимодействиями: интегринами, селектинами, кадгеринами и муцинами [45, 50, 130].
Третьей фазой имплантации бластоцисты является фаза инвазии трофобласта в эндометрий. Трофобласт внедряется между эпителиальными клетками в строму слизистой тела матки посредством разрушения экстрацеллюлярного матрикса и базальной мембраны. Активированные матричные металлопротеиназы (MMP) играют первичную роль в деградации экстрацеллюлярного матрикса, а различные подклассы интегринов контролируют инвазию трофобласта [50].
В лютеиновую фазу менструального цикла процессы пролиферации эндометрия прекращаются, и начинается дифференцировка клеток, которая лежит в основе процесса децидуализации. Децидиуализация состоит в изменении фибробластподобных мезенхимальных клеток стромы эндометрия в округлые клетки, подобные эпителиальным, в течение секреторной фазы «эндометриального цикла» и при беременности [106]. Описываемый процесс начинается в стромальных клетках, окружающих спиральные артерии в верхних 2/3 толщи эндометрия, вне зависимости от наличия или отсутствия бластоцисты.
Когда происходит имплантация, децидуальная реакция распространяется за периваскулярные пространства, и эндометрий становится децидуальной тканью беременности [76]. При ультраструктурном исследовании клетки децидуальной ткани схожи с эпителиальными. Между клетками найдены адгезионные, щелевидные соединения, ложные десмосомы [76]. Белки экстрацеллюлярного матрикса, продуцируемые децидуальной тканью, включают декорин, ламинин IV типа, фибронектин, протеогликаны [84]. Децидуа секретирует пролактин и инсулиноподобный фактор роста, связывающий протеин-1 (IGFBP-1), интерлейкин-11 (ИЛ-11), эпидермальный фактор роста (EGF), гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), активин А и нейропептиды, а также тканевые ингибиторы матричных металлопротеиназ, которые осуществляют контроль за глубиной инвазии трофобласта [2, 41, 55, 58].
Результаты последних исследований показали, что децидуализация эндометрия является сложнейшим последовательным перепрограммированием функциональных и структурных характеристик клеток его экстрацеллюлярного матрикса [84, 119]. Процесс эндометриальной децидуализации включает изменения механизмов клеточной адгезии, организации цитоскелета клеток, вариантов передачи сигналов, метаболических реакций, механизмов стрессового ответа, а также преобразование клеточного цикла, дифференцировки и апоптоза. Все эти изменения направлены на успешную имплантацию плодного яйца и поддержание беременности [84, 119]. В процессе децидуализации усиливается секреторная трансформация эндометриальных желез, происходит перестройка гладкомышечных клеток и эндотелия кровеносных сосудов [87].
Иммунные процессы в течение лютеиновой фазы менструального цикла сопровождаются активацией механизмов клеточного апоптоза. Эндометрий инфильтрируется лимфоцитами, которые активно вырабатывают различные цитокины [26]. В период «окна» имплантации преобладающей субпопуляцией является класс «провоспалительных» лимфоцитов – Т-хелперов 1 (Th1), при этом количество «противовоспалительных» лимфоцитов – Т-хелперов 2 (Th2) также увеличивается, за счет чего значимо снижается соотношение Th1/Th2. Если оплодотворение не наступает, то Th1 способствуют отторжению эндометрия. В секреторную фазу эндометриальных преобразований возрастает количество лейкоцитов в слизистой тела матки, которые вырабатывают цитокины, влияющие на процессы тканевого ремоделирования эндометрия (ИЛ-1, ИЛ-11, ИЛ-15, трансформирующий фактор роста (TGF-)), обеспечивают экспрессию адгезионных молекул, необходимых для имплантации бластоцисты (ЛИФ, ИЛ-11), способствуют направленной миграции бластоцисты в слизистую тела матки (хемокины) [142].
Клинико-анамнестические характеристики и результаты общего лабораторного обследования женщин основной и контрольной групп
Основную группу составили женщины с различными вариантами нарушений репродуктивной функции в анамнезе (n=121). Распределение пациенток основной группы в зависимости от вида репродуктивной дисфункции в анамнезе представлено в таблице 1.
В группу контроля вошли 16 женщин с неотягощенным гинекологическим анамнезом и без тяжелых соматических заболеваний: участницы, добровольно давшие согласие на включение в исследование; женщины, имеющие диагноз «бесплодный брак, мужской фактор бесплодия», а также из базы данных архива патологоанатомического отделения ФГБУ «ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова» МЧС России.
Средний возраст участниц основной группы был 32,7±0,4 года (от 20 до 40 лет включительно), контрольной группы – 32,5±0,6 (от 25 до 40 лет включительно).
Данные об основных антропометрических характеристиках женщин основной и контрольной групп представлены в таблице 2.
У 84% (n=102) пациенток основной и у всех женщин (n=16) контрольной групп индекс массы тела был в пределах нормальных значений (18,5-24,9 кг/м2). У 16% (n=19) пациенток основной группы отмечали избыточную массу тела (ИМТ от 25 до 30 кг/м2). Достоверных отличий при сравнительном анализе антропометрических характеристик участниц основной и контрольной групп не было (р 0,05) (таблица 2).
Для выявления возможных психосоциальных предикторов репродуктивных дисфункций у женщин основной группы провели сравнительный анализ следующих характеристик: семейного положения, уровня образования, особенностей профессиональной деятельности, вредных привычек.
Большинство женщин основной (83%, n=100) и контрольной (75%, n=12) групп состояли в официальном браке, остальные участницы исследования проживали в гражданском браке (17%, n=21 и 25%, n=4 соответственно).
Никотиновую интоксикацию в прошлом имели 40% (n=48) респонденток основной группы и 31% (n=5) женщин контрольной группы, Каждая пятая участница основной и контрольной групп (18%, n=22 и 19%, n=3 соответственно) продолжали курить на момент включения в исследование.
Три четверти женщин основной и контрольной групп имели высшее образование (74%, n=89 и 75%, n=12 соответственно), 7 женщин (6%) основной группы в сроки включения в исследование продолжали обучение в вузе. Среднее специальное образование имела каждая пятая-шестая испытуемая (основная группа – 17%, n=20; контрольная группа – 19%, n=3).
По специальности работали 62% (n=75) респонденток основной и 69% (n=11) контрольной групп. Каждая восьмая участница основной (12%, n=14) и контрольной (13%, n=2) групп не имела постоянной профессиональной занятости. Высокое эмоциональное и умственное напряжения в процессе трудовой деятельности отметили соответственно 55% (n=67) и 69% (n=84) пациенток основной группы, а также 56% (n=9) и 81% (n=13) женщин контрольной группы. Тяжелые физические нагрузки на рабочем месте испытывали 11% (n=13) респонденток основной и 6% (n=1) участниц контрольной групп. Необходимость принятия ответственных решений в процессе трудовой деятельности отметили 50% (n=61) и 50% (n=8) женщин основной и контрольной групп. Каждая десятая (10%, n=12) пациентка основной группы занимала руководящую должность. Условия труда 26% (n=32) женщин основной и 25% (n=4) испытуемых контрольной групп включали ненормированный рабочий день.
В целом, до 70% женщин обеих групп отмечали хронические стрессовые ситуации в связи с профессиональной деятельностью, однако достоверных отличий относительной частоты встречаемости проанализированных психосоциальных факторов выявлено не было (р 0,05).
При сравнительном анализе характеристик менструальной функции женщин основной и контрольной групп определены сходные результаты (р 0,05) (таблица 3).
Средний возраст менархе у женщин основной группы составил 13,1±1,2 года (от 10 до 16 лет), контрольной группы – 12,9±0,7 (от 11 до 15 лет).
У всех участниц исследования был регулярный менструальный цикл, однако у женщин основной группы в течение последнего года до включения в исследование отмечены эпизодические случаи нарушения менструальной функции: по типу опсоменореи – у 28% (n=34) пациенток; по типу пройоменореи – у 8% (n=10) женщин; по типу аномальных (ациклических) маточных кровотечений – у 3% (n=4) участниц основной группы.
О наличии беременностей в анамнезе сообщили 64% (n=77) пациенток основной и 50% (n=8) женщин контрольной групп (таблица 4). Каждая пятая (22%, n=26) участница основной группы имела роды в анамнезе, из них 85% (n=22 из 26) женщин родили в срок, у 15% (n=4 из 26) пациенток были преждевременные роды. В контрольной группе беременности в анамнезе были у половины испытуемых (50%, n=8), все беременности завершились срочными родами.
Каждая четвертая (25%, n=30) женщина основной группы прерывала беременность искусственными методами (выскабливание матки).
У женщин с ранними потерями беременности (n=40) в анамнезе частота неразвивающихся беременностей (68%, n=27) и самопроизвольных выкидышей (40%, n=16) была существенно выше, чем у женщин с бесплодием и у здоровых фертильных участниц исследования (p 0,01).
В структуре гинекологической патологии по данным анамнеза у участниц основной группы (n=121) лидирующее место занимало бесплодие: первичное – у 31% (n=37), вторичное – у 40% (n=48) женщин. У 45 пациенток основной группы в анамнезе были попытки экстракорпорального оплодотворения, которые завершились неудачей имплантации плодного яйца у 33 респонденток; у 12 женщин после успешной имплантации бластоцисты были ранние потери беременности (самопроизвольные выкидыши/неразвивающиеся беременности).
В основной группе у 24% (n=29) пациенток был диагноз «хронический сальпингоофорит вне обострения»; у 13% (n=16) – клинически незначимая миома матки (интрамуральные и/или интрамурально-субсерозные миоматозные узлы до 30 мм в диаметре).
Хламидийная инфекция в анамнезе имела место у 2% (n=2) участниц основной группы. Частота гонококковой инфекции и инфекции, вызванной M. Genitalium, в прошлом составила 1% (n=1) и 5% (n=6) соответственно. Трихамониаз в анамнезе перенесли 2% (n=2) женщин основной группы.
Женщины контрольной группы не имели в анамнезе гинекологических заболеваний.
Различные оперативные вмешательства на органах репродуктивной системы в прошлом имели 60% (n=73) пациенток основной группы (таблица 5). Диагностическая или лечебная лапароскопия в анамнезе была у 39% (n=47) женщин основной группы; односторонняя и двусторонняя тубэктомия – соответственно у 8% (n=10) и 11% (n=13) пациенток основной группы.
Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в эндометрии в соотношении с результатами гистологического и иммуногистохимического (счет ER, PR) исследований слизистой тела матки и результатами гормонального обследования женщин основной и контрольной групп
У пациенток с бесплодием и невынашиванием беременности ранних сроков в анамнезе и у здоровых женщин оценивали экспрессию лейкемия ингибирующего фактора, муцина-1, е-кадгерина в люминальном эпителии, железах и строме слизистой тела матки. Экспрессию протеомных молекул определяли как сниженную (слабое окрашивание или его отсутствие при иммунногистохимическом исследовании) (рисунок 7, 9, 11) или выраженную (выраженное окрашивание при иммунногистохимическом исследовании) (рисунок 8, 10, 12).
В таблице 18 представлены данные о числе образцов эндометрия, в которых была оценена экспрессия ЛИФ, муцина-1, е-кадгерина в люминальном, железистом эпителиях и строме эндометрия. В ряде случаев в срезах с ТМА-матриц образцов эндометрия женщин основной группы отсутствовали участки люминального эпителия эндометрия. Экспрессия протеомных молекул в железах и строме эндометрия была оценена у всех участниц (121 женщины основной группы, 16 – контрольной).
Число случаев с выраженной/сниженной экспрессией ЛИФ в люминальном эпителии эндометрия было сравнимо у женщин основной и контрольной групп (p 0,05) (таблица 19). Не было выявлено различий по частоте выраженной и сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии слизистой тела матки у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности.
Результаты дискриминантного, корреляционного и логико-структурного анализа клинико-анамнестических данных, результатов лабораторного обследования пациенток и морфологического исследования эндометрия
Был проведен многофакторный дискриминантный анализ для определения наиболее значимых предикторов нарушения рецептивных свойств эндометрия (таблица 37).
Для анализа было выбрано 8 вероятных факторов риска нарушения морфологических характеристик слизистой тела матки, которые считают существенными для репродукции [148]: уровни E2 и P в крови; величина М-эха, факт наличия и общее число внутриматочных вмешательств в анамнезе, а также неоднократные (два и более) выскабливания матки; наличие в прошлом инфекций, передающихся половым путем; возраст; курение (таблица 37).
Определено, что существенным предиктором нарушения секреторной трансформации эндометрия является наличие повторных выскабливаний матки в прошлом (p=0,03).
С целью выявления пороговых уровней счета эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в железах и строме эндометрия, существенных для экспрессии изучаемых белковых молекул, проведен логико-структурный анализ с построением деревьев классификации. Значимость пороговых значений экспрессии ER и PR в железах и строме слизистой тела матки для эндометриальной экспрессии протеомных маркеров рецептивности эндометрия проверена при помощи теории шансов и вычисления odds ratio (отношение шансов, OR).
При построении деревьев классификации выявлены следующие пороговые значения счета рецепторов половых стероидов в слизистой тела матки: для PR в железах – 105 и 285; для ER в железах – 145; для ER в строме – 155.
Для расчета OR были построены четырехпольные таблицы, где фактором риска является счет ER и PR больше порогового значения, определенного при построении дерева классификации, негативным исходом – сниженная экспрессия протеомной молекулы.
Отношение шансов рассчитывали по формуле: где A – число женщин, у которых есть фактор риска и негативный исход; B – число женщин, у которых нет фактора риска и есть негативный исход; C – число женщин, у которых есть фактор риска и нет негативного исхода; D – число женщин, у которых нет фактора риска и нет негативного исхода. В таблице 38 представлен расчет отношения шансов снижения экспрессии ЛИФ и е-кадгерина в эндометрии у женщин со значениями счета прогестероновых рецепторов в эндометриальных железах более 105. Определено, что у женщин с гиперэкспрессией PR в железах эндометрия (H-score 105) риск сниженной экспрессии ЛИФ в люминальном эпителии слизистой тела матки в 2,3 раза выше, чем у женщин с низкой экспрессией PR (H-score 105) в эндометриальных железах; сниженной экспресии ЛИФ в строме – в 2,5 раза; сниженной экспрессии е-кадгерина в люминальном эпителии – в 6,6 раза; сниженной экспрессии е-кадгерина в железах – в 2,7 раза.
При высокой экспрессии ER в строме слизистой тела матки (H-score 155) риск сниженной эндометриальной экспрессии ЛИФ в люминальном и железистом эпителиях выше в 2,5 и 2,7 раза соответственно (таблица 41).
Выявленные пороговые значения счета рецепторов половых стероидов в эндометрии (для PR в железах – 105 и 285; для ER в железах – 145; для ER в строме – 155) могут являться прогностическими факторами активности эндометриальной экспрессии ЛИФ и е-кадгерина.
В результате проведения корреляционного анализа значений уровней половых стероидов в периферической крови, величины М-эха и счета эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в слизистой тела матки, степени выраженности экспрессии ЛИФ, муцина-1 и е-кадгерина в эндометрии существенных связей не выявлено (таблица 42).
В изложенном материале результатов собственных исследований определено, что у пациенток с репродуктивными дисфункциями в анамнезе более чем в половине (58%, n=70) случаев имеют место неполноценные секреторные преобразования эндометрия и характеристики гормонально-рецепторного «ответа» слизистой тела матки, свидетельствующие о нарушенных взаимодействиях половых стероидов с собственными эндометриальными рецепторами. У пациенток с неполноценными гормонально-рецепторными эндометриальными взаимодействиями в 20-40% случаев имеет место снижение экспрессии лейкемия ингибирующего фактора и е-кадгерина в слизистой тела матки. Неоднократные (два и более) травматичные внутриматочные вмешательства (выскабливания матки) являются фактором риска снижения эндометриальной рецептивности.
Продемонстрировано, что комплексное обследование (ультразвуковое, гормональное обследования женщин, сочетанное гистологическое и иммуногистохимическое исследования образцов слизистой тела матки) пациенток с нарушениями фертильности в анамнезе неясного генеза позволяют получить углубленное представление о состоянии эндометрия.