Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика нарушений репродуктивной функции женщин 13
1.2. Эндометриальный фактор как причина нарушений репродуктивной функции 20
1.3. Возможности коррекции неполноценности фазовой трансформации эндометрия 32
Глава 2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы исследования 37
2.2. Методы исследования 40
2.2.1. Клинико-анамнестический метод 40
2.2.2. Общее клинико-лабораторное обследование 40
2.2.3. Ультразвуковой метод исследования 41
2.2.4. Определение уровня гормонов в периферической крови 42
2.2.5. Гистологический и иммуногистохимический методы исследования эндометрия 43
2.2.6. Статистический метод исследования 45
Глава 3. Результаты собственных исследований 46
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика и сравнительный анализ основных показателей общего лабораторного обследования женщин 46
3.2. Сравнительный анализ результатов гормонального и ультразвукового обследований женщин 56
3.3. Сравнительный анализ результатов гормонального обследования, ультразвукового исследования органов малого таза и морфологического исследования эндометрия пациенток основной и контрольной групп 64
3.3.1. Сравнительный анализ результатов гистологического исследования эндометрия 64
3.3.2. Сравнительный анализ результатов иммуногистохимического и гистологического исследований эндометрия, гормонального, ультразвукового обследований женщин 73
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 105
Выводы 125
Практические рекомендации 127
Список сокращений и условных обозначений 128
Список литературы 130
- Эндометриальный фактор как причина нарушений репродуктивной функции
- Клинико-анамнестическая характеристика и сравнительный анализ основных показателей общего лабораторного обследования женщин
- Сравнительный анализ результатов гистологического исследования эндометрия
- Сравнительный анализ результатов иммуногистохимического и гистологического исследований эндометрия, гормонального, ультразвукового обследований женщин
Введение к работе
Актуальность проблемы. Выявление и коррекция патологии репродуктивной
функции женщин чрезвычайно актуальны: 15-17% супружеских пар страдают
бесплодием; до 20% желанных беременностей прерывается досрочно; у 5-20% женщин с
невынашиванием беременности в анамнезе отмечают повторные репродуктивные потери
(Самойлова А.В. и др., 2009; Salker M. et al., 2010; ESHRE Early Pregnancy Guidline
Development Group Guideline of the European Society of Human Reproduction and
Embryology, 2017). Несостоявшиеся имплантации морулы/бластоцисты при
вспомогательных репродуктивных технологиях увеличивают число неудач репродукции. Разнообразие и полиэтиологичность репродуктивных дисфункций у женщин требуют дальнейшего изучения факторов риска и причин нарушения фертильности.
Регулярные менструации не являются гарантом полноценных циклических взаимодействий в гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси и полноценной фазовой трансформации эндометрия. В ряде случаев, при регулярных менструациях отмечают нарушения овариального цикла: у женщин с бесплодием при клинически нормальном ритме менструальных кровотечений в половине случаев регистрируют недостаточность лютеиновой фазы (НЛФ), в 10-15% случаев определяют ановуляцию (Сидельникова В.М., 2009; Скворцова, М.Ю. и др., 2010; Подзолкова Н.М. и др., 2014).
Поиску эндометриальных предикторов репродуктивных дисфункций уделяют существенное внимание. В 80-е годы XX века впервые начато изучение стероидной рецепции эндометрия и выявлен циклический характер экспрессии рецепторов половых гормонов в слизистой тела матки (Сухих Г.Т. и др., 2010; Petousis S. et al., 2018). Применение иммуногистохимического метода с использованием моноклональных антител к прогестероновым и эстрогеновым рецепторам, по сравнению с другими методиками, позволило определять число рецепторов к половым стероидам в тканях, а также дало возможность визуализировать клеточные элементы, экспрессирующие данные рецепторы (Самойлова А.В. и др., 2009; Santilln I. et al., 2015; Petousis S. et al., 2018). Так, иммуногистохимическим методом удалось проследить циклический характер экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов в эпителиальных и стромальных клетках слизистой тела матки (Salker M. et al., 2010; Halasz M. et al., 2013; Kaya H.S. et al., 2015; Толибова Г.Х. и др., 2018).
В настоящее время данные об экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в эндометрии при нормальном менструальном цикле противоречивы. Ряд исследователей показали, что для нормального овуляторного менструального цикла
4 характерно увеличение концентрации рецепторов эстрогенов и прогестерона в железах и строме в фазу пролиферации эндометрия и снижение экспрессии рецепторов прогестерона в эндометриальных железах в фазу секреции (Petousis S. et al., 2016). В работах других авторов встречается иная информация о резком снижении в железистых и стромальных клетках эндометрия экспрессии эстрогеновых рецепторов и длительной экспрессии прогестероновых рецепторов в фазу секреции (Храмова И.А. и др, 2014). Различны и относительно немногочисленны данные об эстроген-прогестероновом рецепторном статусе эндометрия у женщин с репродуктивными дисфункциями. В отношении пациенток с бесплодием одни авторы представляют результаты о повышении экспрессии рецепторов половых стероидов в эндометрии в секреторную фазу (Бессмертная В.С. и др., 2007), другие – о снижении экспрессии соответствующих рецепторов в указанный период эндометриального цикла (Толибова Г.Х. и др., 2018). Окончательно не ясна роль эндометриального фактора в генезе невынашивания беременности (Скворцова М.Ю. и др, 2010; Salker M. et al., 2010; Halasz M. et al., 2013). В целом, исследователями описаны неоднозначные данные о гормонально-рецепторных взаимодействиях в эндометрии, определяемых иммуногистохимическим методом, у здоровых женщин и у женщин с нарушениями репродуктивной функции (Сухих Г.Т. и др., 2010; Храмова И.А. и др, 2014; Толибова Г.Х. и др., 2018). Впервые представлено определение «эндометриальной дисфункции», как комплекса различных морфофункциональных изменений эндометрия, влияющих на возможность имплантации плодного яйца и вынашивания беременности (Толибова Г.Х. и др., 2018).
В настоящее время требуется углубление современных представлений о рецептивности эндометрия для более точного понимания возможных причин репродуктивных дисфункций.
Цель исследования: оценить значение эндометриального фактора в патогенезе нарушений репродуктивной функции женщин на основе сочетанной оценки гормон-рецепторного аппарата эндометрия.
Задачи исследования
У женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе:
1. определить наиболее значимые клинико-анамнестические характеристики,
которые могут быть предикторами снижения рецептивности эндометрия;
2. оценить в крови уровни тропных гормонов (ФСГ, ЛГ, ТТГ, пролактина),
концентрацию половых стероидов (E2, P, FTest, 17-OHP, ДГЭА-С), ультразвуковые
характеристики органов репродуктивной системы;
3. провести оценку результатов гистологического и иммуногистохимического
(ИГХ) (экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона) методов исследований
образцов эндометрия;
-
проанализировать соотношения клинико-лабораторных показателей и молекулярно-морфологических характеристик эндометрия;
-
обосновать необходимость включения в перечень обследования на предгравидарном этапе морфологического исследования эндометрия с использованием сочетания гистологического и иммуногистохимического методов.
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые у женщин с нарушениями репродуктивной функции с овуляторным менструальным циклом и при ановуляции определены критерии оценки экспрессии эндометриальных эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, отражающие снижение рецептивности эндометрия.
Впервые у пациенток с репродуктивными дисфункциями выявлены четыре иммунофенотипа гормонально-рецепторного ответа эндометрия на основании результатов иммуногистохимического метода исследования: первый иммунофенотип соответствует нормальным гормонально-рецепторным взаимодействиям в слизистой тела матки; три других варианта с повышенной экспрессией рецепторов эстрогенов и/или прогестерона отражают снижение рецептивности эндометрия.
Впервые определено, что у женщин с репродуктивными неудачами в анамнезе при
различных вариантах нарушения фертильности (бесплодии, невышанивании
беременности ранних сроков, неудачах экстракорпорального оплодотворения)
гистологические характеристики эндометрия и экспрессия эндометриальных
эстрогеновых и прогестероновых рецепторов не имеют достоверных различий.
Получены новые данные о том, что у женщин с нарушениями репродуктивной функции более высокие абсолютные значения овуляторного уровня прогестерона в крови не являются определяющим фактором для обеспечения полноценной секреторной трансформации эндометрия. Впервые представлены морфологические характеристики эндометрия у женщин с «пограничным» уровнем прогестерона, не являющимся ановуляторным и не входящим в референсные значения, соответствующие лютеиновой фазе овариального цикла.
Практическая значимость. У женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе определение овуляторного уровня прогестерона в периферической крови и/или наличие ультразвуковых признаков овуляции недостаточно для суждения о полноценном менструальном цикле. Для оценки эндометриального уровня репродуктивной системы необходимо морфологическое исследование образцов эндометрия.
Для уточнения причины нарушения репродукции у женщин сочетанное исследование (гистологический и иммуногистохимический (определение экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов) методы) образцов слизистой тела матки является более информативным для заключения о рецептивности эндометрия, чем изолированный гистологический метод. Выявление снижения рецептивности эндометрия позволяет уточнить значение эндометриального фактора в генезе репродуктивных дисфункций.
Определено, что более, чем у половины женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе с овуляторным овариальным циклом имеет место сниженная рецептивность эндометрия, не соответствующая высокой функциональной активности желтого тела.
На этапе предгравидарного обследования женщин с репродуктивными дисфункциями в анамнезе по результатам гистологического и иммуногистохимического исследования образцов эндометрия возможно выявить пациенток, у которых есть признаки снижения рецептивности эндометрия, несмотря на нормальный овуляторный уровень прогестерона в периферической крови. Данная информация может быть учтена для составления персонализированного плана предгравидарной подготовки.
Основные положения, выносимые на защиту
-
У здоровых фертильных женщин нормальный иммунофенотип гормонально-рецепторного взаимодействия в эндометрии на 6-8 день после овуляции заключается в существенном синхронном снижении экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в железах при сохраненной высокой экспрессии прогестероновых рецепторов в строме эндометрия. Такой вариант нормальной экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в слизистой тела матки был только у 36% женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе.
-
У пациенток с репродуктивными дисфункциями в анамнезе при различных вариантах нарушения фертильности (бесплодии, невынашивании беременности ранних сроков, неудачах экстракорпорального оплодотворения) морфологические характеристики рецептивности эндометрия (гистологические, показатели экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона) не различаются.
3. Значения уровня прогестерона в периферической крови не имеют
корреляционных связей с показателями рецептивности эндометрия. Более высокий
уровень прогестерона не обусловливает бльшую частоту полноценных секреторных
преобразований слизистой тела матки.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в работу женской консультации №22 г. Санкт-Петербурга и амбулаторно-поликлинического отделения СПб ГБУЗ «Центра планирования семьи и репродукции»; в учебный процесс кафедры акушерства и гинекологии ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на V международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2013», г. Санкт-Петербург, 2013; LXXV научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины – 2014», г. Санкт-Петербург, 2014; международной конференции «Репродуктивная медицина – взгляд молодых 2016», г. Санкт-Петербург, 2016; III общероссийской конференции с международным участием «Перинатальная медицина: от предгравидарной подготовки к здоровому материнству и детству», г. Санкт-Петербург, 2017; II межрегиональной конференции «Женское здоровье 2017», г. Черкесск, 2017; 5-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Трансляционная медицина: от теории к практике», г. Санкт-Петербург, 2017; LXXVIII региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины – 2017», г. Санкт-Петербург, 2017; IV общероссийской конференции с международным участием «Перинатальная медицина: от предгравидарной подготовки к здоровому материнству и детству», г. Санкт-Петербург, 2018; на 18-ом всемирном конгрессе «ISGE Gynecological endocrinology 18th word congress», Florence, Italy, 2018; 6-ой региональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Трансляционная медицина: от теории к практике», г. Санкт-Петербург, 2018; на 91-ой всероссийской научно-практической конференции студенческого научного общества с международным участием «Мечниковские чтения - 2018», г. Санкт-Петербург, 2018; на всероссийской молодежной медицинской конференции с международным участием «Алмазовские чтения - 2018», г. Санкт-Петербург, 2018; на 3-ем всемирном конгрессе «WCRPL 2018 – the 3rd World Congress on Recurrent Pregnancy Loss», Madrid, 2018; на IX международном конгрессе «Оперативная гинекология - новые технологии», г. Санкт-Петербург, 2018; на 26-ом всемирном конгрессе «COGI 2018 – the 26rd World Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology & Infertility», London, 2018.
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях.
Личное участие автора. Автор участвовал в планировании исследования, составлении его дизайна, разработке специальных карт-анкет на основе анализа историй
8
болезни и амбулаторных карт. Диссертантом осуществлен отбор пациенток согласно
критериям включения и исключения. Самостоятельно изучены и проанализированы
истории болезни и амбулаторные карты. Автор самостоятельно выполнял забор материала
(пайпель-биоптатов эндометрия) для гистологического и иммуногистохимического
исследований, проводил анализ клинико-лабораторных показателей и результатов
молекулярно-морфологических характеристик эндометрия. Автором создана
компьютерная база данных, проведена их статистическая обработка.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав о материалах и методах исследования, результатах собственного исследования, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 226 (54 отечественных и 172 зарубежных) источников. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, иллюстрированы 33 таблицами и 10 рисунками.
Эндометриальный фактор как причина нарушений репродуктивной функции
Роль эндометрия в процессе имплантации в ряде случаев недооценивается. Дефектом эндометрия считается не только его морфологическая неполноценность в связи с наличием органических патологических процессов (гиперплазия эндометрия, атрофические изменения, хронический эндометрит), но и недостаточная эндометриальная секреторная трансформация, которая при нормальном уровне половых стероидных гормонов в крови может являться единственной возможной причиной нарушения репродуктивной функции [33].
Эндометрий способен к восприятию имплантирующейся бластоцисты в пределах строго ограниченного во времени "окна имплантации" [150, 162]. Наиболее вероятно, что у человека "окно имплантации" приходится на 6-8 день после овуляции, что чаще всего соответствует 20-22 дню менструального цикла [20].
Успешная имплантация сильно зависит от синхронного процесса взаимодействия сигнальных молекул эндометрия и плодного яйца в ходе "диалога", который характеризуется интенсивными молекулярными связями между клетками и тканями и экспрессией ряда факторов роста и цитокинов, осуществляющих паракринную, аутокринную и интракринную регуляцию сложного процесса [150, 162]. В период имплантации митотическая активность желез эндометрия увеличивается, что коррелирует с возрастающей концентрацией эстрадиола. Секреторная активность железистых клеток достигает максимальных значений. К характерным морфологическим изменениям эндометриальных желез, наблюдающимся только в секреторную фазу, относят отложение гликогена, образование гигантских митохондрий, формирование систем ядерных каналов.
Слизистая тела матки первой контактирует с бластоцистой посредством микровыпячиваний (пиноподий) на апикальной поверхности [172]. Их обнаруживают в середине секреторной фазы менструального цикла в течение 48-72 ч. Появление пиноподий стимулируется прогестероном и ингибируется эстрогенами. Период образования микровыпячиваний соответствует по времени началу "окна имплантации", которое возникает во время максимальной эндометриальной рецептивности. Истинные пиноподии полностью исчезают к 10-му дню после пика лютеинизирующего гормона (ЛГ+10-й день) [151], а те образования, которые ряд исследователей наблюдали в позднюю секреторную фазу цикла, являются увеличенными в размерах клетками поверхностного эпителия эндометрия, подготавливающимися к отторжению во время менструации [82].
Основными регулирующими факторами морфологических изменений функционального слоя слизистой тела матки в течение всего менструального цикла и в периимплантационном периоде считают половые стероидные гормоны, синтезированные в яичниках [151]. Циклическое воздействие эстрогенов и прогестерона подготавливает эндометрий к приему бластоцисты и восприятию ее гуморальных сигналов [121].
Для большинства видов млекопитающих в репродуктивном цикле характерны две закономерности: 1) увеличение секреции эстрогенов в фазу селекции и развития фолликулов, опосредованно влияющее на имплантацию; 2) секреция большого количества прогестерона в секреторную фазу цикла, совпадающая по времени с периодом имплантации. Значительная выработка эстрогенов в данную фазу характерна не для всех видов млекопитающих.
Эстрадиол представляет собой пермиссивный агент, а прямое действие оказывают локальные, регулируемые им факторы – факторы роста, молекулы адгезии, цитокины. Влияя на пролиферацию эпителиальных клеток, эстрогены стимулируют развитие секреторного аппарата клетки и синтез эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, с помощью взаимодействия с которыми осуществляется многообразное действие гормонов на клетки. Под влиянием постепенно повышающейся концентрации прогестерона после овуляции в фазу секреции эпителий желез начинает вырабатывать секрет, содержащий гликопротеиды, кислые гликозаминогликаны и гликоген. Количество митозов в железистом эпителии снижается, и клетки внутри железы составляют ровный цилиндрический слой. В расширенном просвете желез появляются крупные субнуклеарные вакуоли, которые содержат гликоген и липиды. В середине секреторной фазы (20-22 дни менструального цикла), когда максимальная концентрация прогестерона сочетается с повышенным содержанием эстрогенов, утолщается функциональный слой эндометрия, его толщина составляет 8-10 мм, и разделяется на два слоя [4]. Глубокий слой функционального слоя эндометрия, также имеющий название губчатый или спонгиозный, содержит большое число желез и небольшой объем стромы и граничит с базальным слоем. Компактный слой эндометрия составляет одну четверть от толщины функционального слоя, содержит меньшее число желез и больше клеток соединительной ткани. К средней стадии фазы секреции происходит наибольшая секреция железами гликогена и кислых мукополисахаридов, а также в них накапливается максимальное количество протеолитических и фибринолитических ферментов. Далее клетки компактного слоя слизистой тела матки становятся крупными, округляются или приобретают полигональную форму. В дальнейшем, после успешной имплантации бластоцисты, происходит децидуализация эндометрия. Децидуальная оболочка проявляет себя в роли защитного фактора для эмбриона от «нападения» материнских иммунных клеток и обеспечивает «питательную поддержку» для развивающегося эмбриона до формирования плаценты [4, 198].
В период имплантации бластоцисты спиральные артерии, обнаруживающиеся во всем функциональном слое, становятся резко извитыми и образуют «клубки» [4]. Отличительной чертой эндометрия с повторными выкидышами является неупорядоченный и продолжительный децидуальный ответ. Чрезмерная воспалительноподобная реакция продлевает «окно имлантации», способствует взаимодействию бластоцисты и эндометрия вне фазы имплантации, а также отключает селекцию эмбриона [153, 192]. Следовательно, некачественные эмбрионы не утилизируются своевременно, и эмбрионы высокого качества имплантируются в ненадлежащей среде. Оба эти варианта приводят к клинической картине выкидыша [153, 192]. Первая фаза имплантации контролируется эстрадиолом и прогестероном и отличается изменениями в покровных и железистых эпителиальных клетках слизистой тела матки; завершением этого является подготовка к аппозиции, адгезии и имплантации бластоцисты [153, 192, 210]. Успешность гормонального влияния на слизистую тела матки зависит от наличия ядерных рецепторов к половым стероидным гормонам [70]. Увеличение концентрации рецепторов наблюдается в направлении от функционального слоя к базальному, что коррелирует с установлением наибольшей рецептивности эндометрия, достаточной для успешной имплантации. Наряду с изменениями в системе рецепторов к половым стероидным гормонам клетки эпителия претерпевают изменения в структуре цитоскелета и профиле секреции белков [4].
Решающую роль в имплантации бластоцисты играет абсолютное содержание половых стероидных гормонов, влияющих на ткани-мишени органов репродуктивной системы, и морфологическая структура слизистой тела матки, а также рецептивность эндометрия. Термин «рецептивность» эндометрия впервые был предложен в 70-х годах ХХ века. Эндометриальная рецептивность – это комплекс его структурных и функциональных характеристик [20]. В настоящее время выделяют несколько групп морфо-молекулярных маркеров, характеризующие рецептивность эндометрия, а также определяют уровни эндометриальной рецептивности – гистологический, протеомный и генетический [17, 52]. К гистологическим характеристикам относят состояние желез и стромы слизистой тела матки, а также количество и качество пиноподий в эндометрии. Среди молекулярных маркеров выделяют молекулы клеточной адгезии, цитокины, некоторые плацентарные белки, отдельные гены, отвечающие за экспрессию рецепторов в эндометрии, а также сами рецепторы половых стероидных гормонов в слизистой тела матки [70]. Рецепторы к половым стероидным гормонам – это класс белков, функционирующих на ядерном уровне (внутриклеточные рецепторы) и участвующих в регуляции транскрипции специфических генов [7]. Концентрация свободных стероидных гормонов в крови является регулирующим фактором экспрессии ядерных рецепторов в клетках-мишенях [121]. Так, эстрадиол усиливает синтез эстрогеновых рецепторов, а также прогестероновых рецепторов и рецепторов к андрогенам в слизистой тела матки. Прогестерон, напротив, подавляет производство, как собственных рецепторов, так и эстрогеновых рецепторов [227].
Клинико-анамнестическая характеристика и сравнительный анализ основных показателей общего лабораторного обследования женщин
Согласно критериям включения и исключения в основную группу вошли 137 женщин. В зависимости от вида нарушения репродуктивной функции в анамнезе пациентки были разделены на три подгруппы (таблица 1). В первую и вторую подгруппы основной группы были включены женщины с бесплодием и невынашиванием беременности ранних сроков в анамнезе соответственно, в третью подгруппу основной группы вошли участницы с сочетанием нарушений репродуктивной функции в анамнезе (бесплодие и/или невынашивание беременности ранних сроков), у которых были неудачи имплантации бластоцисты после переноса эмбрионов при использовании экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в анамнезе (не более трех попыток).
В группу контроля были включены 15 соматически здоровых женщин с нормальной менструальной функцией без нарушений в репродуктивной системе в анамнезе, проходившие обследование в связи с наличием диагноза «бесплодный брак» по причине мужского фактора бесплодия, женщины-добровольцы без нарушений репродуктивной и менструальной функций и тяжелых экстрагенитальных заболеваний, а также пациентки из архивной базы данных патологоанатомического отделения ФГБУ ВЦЭРМ им. А.М. Никифорова МЧС России.
В таблице 2 представлены общие характеристики обследованных женщин основной и контрольной групп (возраст, антропометрические показатели). Возраст обследованных женщин основной и контрольной групп был от 23 до 37 лет, в среднем составил 32,2±0,03 года и 27,6±0,4 лет соответственно (таблица 2). Достоверных различий по возрасту пациенток основной и контрольной групп не выявлено (p 0,01).
Индекс массы тела (ИМТ) женщин основной и контрольной групп был менее 30 кг/м2, в среднем составил 22,7±0,1 кг/м2 и 22,0±0,8 кг/м2 соответственно. Достоверных различий в группах не выявлено (р 0,01). У 15% (n=21) пациенток основной группы был избыток массы тела (25ИМТ 30 кг/м2).
С целью определения возможных психосоциальных предпосылок нарушения репродуктивной функции у женщин основной группы проведен сравнительный анализ семейного положения, уровня образования, условий профессиональной деятельности, социально-бытовых условий, наличия вредных привычек, характера профессиональных и семейных взаимоотношений, т.д. у участниц обеих групп.
В официальном браке состояли 84% (n=115) женщин основной группы и 80% (n=12) контрольной группы; соответственно 16% (n=22) и 20% (n=3) респонденток состояли в гражданском браке. Неудовлетворенность отношениями в семье отмечали 25% (n=34) женщин основной группы и 20% (n=3) контрольной группы.
Такая вредная привычка, как курение, была отмечена у 19% (n=24) участниц основной группы и у 20% (n=3) женщин контрольной группы. В прошлом никотиновая интоксикация была у 18% (n=25) и у 26% (n=4) респонденток; пассивное курение – у 16% (n=22) и у 20 % (n=3) соответственно.
Большинство женщин основной и контрольной групп имели высшее образование и работали по специальности: 75% (n=103) и 80% (n=12) соответственно. Учились в высших учебных заведениях в период вступления в исследование 5% (n=7) пациенток основной группы. Среднее специальное образование было у каждой пятой участницы основной (20%, n=27) и контрольной (20%, n=3) групп. По специальности работали 65% (n=89) и 80% (n=12) женщин обеих групп. В основной группе у 10% (n=14) женщин труд был связан с химическими вредностями на производстве, у 4% (n=5) – с физическими вредными факторами (шум, вибрация, др.); каждая вторая пациентка основной группы (48%, n=66) и все женщины контрольной группы (n=15) отмечали многочасовую работу с компьютером. У половины испытуемых работа была связана с повышенным эмоциональным напряжением: в основной группе - у 54% (n=74), в контрольной группе - у 53% (n=8) человек. У большинства женщин (71% (n=97) и 73% (n=11)) трудовая деятельность требовала существенных умственных нагрузок. Повышенные физические нагрузки были у 9% (n=13) пациенток основной группы и у двух женщин контрольной группы. Ненормированный рабочий график отмечен у каждой четвертой участницы основной (25%, n=34) и контрольной (26%, n=4) групп. Не были трудоустроены 12% (n=16) пациенток основной группы. Отношениями в рабочем коллективе были не удовлетворены 17% (n=23) женщин основной и 20% (n=3) контрольной группы.
В целом, большинство женщин обеих групп имели высшее образование и достаточно интенсивные условия профессиональной деятельности, характеристики которых были сопоставимы по всем показателям (p 0,01). Проанализированные психосоциальные факторы у женщин основной группы в данном исследовании, вероятно, не являются предикторами нарушений у них репродуктивной функции.
При оценке семейного анамнеза женщин основной и контрольной групп было отмечено нарушение менструальной функции у матерей участниц в 6% (n=8) и в 7% (n=1) случаев соответственно, миома матки – в 19% (n=26) и в 20% (n=3) случаев. Невынашивание беременности было в семейном анамнезе у 9% (n=13) и у 13% (n=2) респонденток основной и контрольной групп. Достоверных различий, по данным семейного анамнеза, у женщин обследованных групп выявлено не было (р 0,01). Особенности семейного анамнеза не были значимыми для нарушений репродуктивной функции участниц исследования.
Общие данные гинекологического анамнеза женщин основной и контрольной групп представлены в таблице 3.
При сравнительном анализе характеристик менструальной функции участниц достоверных различий в группах не выявлено (р 0,01). Возраст менархе варьировал от 10 до 16 лет, в среднем составил 13,1±0,01 лет у пациенток основной группы и 13,0±0,01 лет у респонденток контрольной группы. По результатам анализа гинекологического анамнеза у всех женщин основной (п=137) и контрольной (п=15) групп отмечен регулярный менструальный цикл. У пациенток основной группы в течение последнего года в 28% (п=39) случаев были эпизоды нарушений менструальной функции по типу опсоменореи, у 9% (п=13) -по типу пройоменореи, у 3% (п=4) - по типу ациклических маточных кровотечений. В основной и контрольной группах средние показатели длительности менструаций (5,4±0,3 и 5,7±0,2 дней соответственно) и менструального цикла (30,4±0,6 и 31,0±0,5 дней) не отличались от популяционных значений. Альгоменорея была отмечена у 17% (п=23) обследованных женщин основной группы и у 20% (п=3) участниц контрольной группы. Возраст начала половой жизни в среднем составил 18,05±0,02 лет и 18,1±0,1 лет соответственно и был сравним в группах (р 0,01). Проведен анализ характеристик акушерского анамнеза женщин основной и контрольной групп. В подгруппе Iа основной группы у 62% (n=32) пациенток было отмечено первичное бесплодие, вторичное бесплодие встречалось в 38% (n=20) случаев. В подгруппе Iа не отмечено случаев бесплодия в связи с мужским фактором. В подгруппе Iб в 68% (n=32) случаев у пациенток в анамнезе были неразвивающиеся беременности до 7 недель, в 89% (n=34) случаев – самопроизвольные выкидыши раннего срока в анамнезе. У женщин с привычным невынашиванием беременности (32%, n=12) было отмечено от 2 до 10 выкидышей до 7 недель беременности в анамнезе. В 67% (n=8) случаев при привычных потерях беременности ранних сроков проводили цитогенетическое исследование абортусов: хромосомной патологии не обнаружено. Большинству (83%, n=10) пациенток с привычным невынашиванием беременности до 7 недель в анамнезе было выполнено кариотипирование: у всех женщин был кариотип 46XX. У участниц в подгруппе Iв было от одной до трех неудачных попыток ЭКО (нарушение имплантации бластоцисты). Первичное бесплодие у женщин с неудачными попытками ЭКО в анамнезе было в 38% (n=18) случаев, вторичное бесплодие - у 2/3 (62%, n=29) женщин в Iв подгруппе основной группы. У пациенток данной подгруппы роды в анамнезе были в 26% (n=8) случаев, невынашивание беременности встречалось у 30% (n=14) женщин. В контрольной группе у 27% (n=4) респонденток в анамнезе были беременности, которые закончились родами в срок.
Сравнительный анализ результатов гистологического исследования эндометрия
По результатам гистологического исследования эндометрия у всех женщин контрольной группы (n=15) была полноценная секреторная трансформация эндометрия. У пациенток основной группы с репродуктивными дисфункциями в анамнезе в 51 из 137 случаев были также определены преобразования эндометрия, соответствующие средней стадии фазы секреции. У остальных 86 женщин основной группы выявлены варианты гистологической характеристики слизистой тела матки: неполноценные секреторные преобразования, пролиферативные и смешанные изменения эндометрия. Распределение пациенток контрольной и основной групп в зависимости от результатов гистологического исследования эндометрия с учетом значений уровня прогестерона в крови и варианта репродуктивных нарушений в анамнезе представлены в таблице 11.
У пациенток основной группы с овуляторным м.ц. (n=107) в 44% (n=47) случаев выявлена полноценная секреторная трансформация желез и стромы эндометрия, в 56% (n=60) – гистологические изменения эндометрия, соответствующие недостаточности лютеиновой фазы менструального цикла (таблица 11).
В таблице 12 представлено распределение результатов гистологического исследования эндометрия (полноценная и неполноценная секреторная трансформация слизистой тела матки) у женщин основной группы с овуляторным менструальным циклом в зависимости от типа репродуктивной дисфункции в анамнезе. Достоверных различий не выявлено (р 0,01).
Гистологическое заключение о полноценной секреторной трансформации эндометрия было сделано на основании общепринятых критериев, соответствующих различным фазам эндометриального цикла [79].
В описательной части гистологического исследования пайпель-биоптатов эндометрия пациенток указано, что в эндометрии средней стадии фазы секреции обнаружены хорошо извитые железы с широким просветом и округлыми бледно-окрашенными везикулярными ядрами, расположенными базально; апикальный край клеток неровный, с признаками апокринной секреции в просвете отдельных желез (рисунок 1 и 2). При полноценной секреторной трансформации эндометрия в строме отмечен фокальный отек, спиральные артерии с выраженной извитостью. Клетки стромы из формы веретена преобразованы в округлые или полигональные формы.
В целом, в основной группе только у 44% (n=47) женщин с овуляторным менструальным циклом, по результатам гистологического исследования образцов эндометрия, отмечена адекватная дню менструального цикла фазовая трансформация эндометрия: гистологические признаки, соответствующие средней фазе секреции. Среди данных пациенток в 19% (n=9) случаев определяли выраженный фиброз стромы эндометрия, наряду с железами средней стадии секреции, что свидетельствует о перенесенном ранее хроническом эндометрите.
В основной группе среди женщин с овуляторным м.ц. (n=107), по данным гистологического исследования эндометрия, более, чем у половины пациенток (56%, n=60), была обнаружена неполноценная секреторная трансформация эндометрия с отсутствием синхронного развития желез и стромы. В гистологическом описании эндометрия, не соответствующего средней стадии фазы секреции, указано наличие слабо и частично секреторно-извитых желез различной формы (округлые и удлиненные), в некоторых из них обнаружены кистозно-расширенные просветы (рисунок 3). Эпителий имел признаки низкой функциональной активности, в строме обнаружен отек, спиральные сосуды недоразвиты, определен перигландулярный фиброз.
Был проведен анализ значений уровней Е2 и Р в периферической крови, а также Е2/Р соотношения (образцы крови получали строго в день выполнения пайпель-биопсии эндометрия) у женщин основной и контрольной групп с овуляторным менструальным циклом при полноценной и неполноценной секреторной трансформации эндометрия в среднюю лютеиновую фазу овариального цикла; различий между основной и контрольной группами не выявлено (р 0,01) (таблица 13).
Подгруппу с ановуляторным менструальным циклом составили 12% (n=16) участниц основной группы (n=137) (средний уровень прогестерона в крови на 20-22 день менструального цикла - 3,6±0,7 нмоль/л, отсутствие ультразвуковых признаков овуляции). Гистологическая картина эндометрия не соответствовала дню менструального цикла и была представлена трансформацией с преобладанием пролиферативных изменений: железы и строма эндометрия имели сходство с эндометриальными изменениями ранней и средней стадии фазы пролиферации, эпителий был без признаков функциональной активности (рисунок 4). В некоторых образцах эндометрия определяли прямые узкие железы с однорядным эпителием, а также слабо извитые железы с многорядным или цилиндрическим эпителием и кистозно-расширенные железы с кубическим или уплощенным эпителием, компактную строму из мелких клеток.
В основной группе (n=137) у 10% (n=14) женщин был выявлен уровень прогестерона в крови на 20-22 д.м.ц., равный 10 нмоль/л и более, но менее 16,1 нмоль/л. Данные показатели прогестерона не соответствовали ановуляторному м.ц. и не входили в референсный интервал значений P в крови в лютеиновую фазу м.ц. («Beckman Coulter», США). В таблице 14 представлена гистологическая характеристика эндометрия у женщин основной группы (n=137) с «промежуточными» результатами прогестерона в периферической крови (n=14).
Был проведен анализ значений уровней E2 и P в периферической крови, а также E2/P соотношения у женщин основной группы с «промежуточными» значениями прогестерона в крови при различных вариантах заключения гистологического исследования эндометрия в среднюю лютеиновую фазу овариального цикла; различий не выявлено (р 0,01) (таблица 15).
Таким образом, у женщин с нарушениями репродуктивной функции в анамнезе (n=137) неполноценная секреторная трансформация эндометрия (результат гистологического исследования) выявлена: при овуляторном менструальном цикле - более, чем у половины женщин (56%, n=60), при «промежуточном» уровне прогестерона в крови (n=14) – у 43% (n=6) пациенток. Пролиферативные изменения эндометрия были у всех пациенток с ановуляторным менструальным циклом (n=16); у 28,5% (n=4) в подгруппе участниц с «промежуточным» уровнем прогестерона в крови были смешанные изменения эндометрия с преобладанием пролиферации. Только у 37% (n=51) пациенток с репродуктивными дисфункциями в анамнезе при гистологическом исследовании определены изменения эндометрия, соответствующие средней фазе секреции (полноценная секреторная трансформация).
Сравнительный анализ результатов иммуногистохимического и гистологического исследований эндометрия, гормонального, ультразвукового обследований женщин
В соответствии с задачами исследования у пациенток, помимо гистологического, проведено иммуногистохимическое исследование образцов эндометрия.
У всех женщин группы контроля (n=15) по результатам проведенного иммуногистохимического исследования пайпель-биоптатов эндометрия наблюдали синхронное снижение экспрессии рецепторов эстрогенов в железах и в строме эндометрия в виде слабого фокального окрашивания менее 50% ядер эпителиоцитов и стромы (H-score ER в железах – 72,2±13,6 и ER в строме – 88,9±12,9). При этом был отмечен дисинхронный ответ относительно экспрессии рецепторов прогестерона: слабая экспрессия рецепторов прогестерона в эндометриальных железах при высокой их экспрессии в строме (H-score PR в железах – 34,4±11,2 и PR в строме – 210,0±17,0). Такую динамику изменений экспрессии ER и PR в эндометрии наблюдали при нормальных референсных значениях половых гормонов в периферической крови (Е2 – 762,2±148,3 пмоль/л, P – 39,0±5,2 нмоль/л, значение Е2/P – 18,3±1,7) у всех женщин контрольной группы (n=15) (таблица 16). При указанном соотношении экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в железах и в строме эндометрия у всех женщин контрольной группы (n=15) определяли гистологически полноценную секреторную трансформацию желез и стромы, соответствующую средней стадии фазы секреции овуляторного менструального цикла. Данная динамика показателей H-score эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в среднюю секреторную фазу эндометриальных изменений была обозначена, как нормальный иммунофенотип (ИФ) гормонально-рецепторного взаимодействия в эндометрии (1 иммунофенотип).
Выявлено, что в основной группе из 47 женщин с овуляторным м.ц. и полноценной секреторной трансформацией эндометрия у 81% (n=38) участниц был определен нормальный гормонально-рецепторный статус эндометрия; значения H-score ER и PR в железах эндометрия соответствовали дню менструального цикла (слабая экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона в железах при высокой экспрессии рецепторов прогестерона в строме эндометрия). У 19% (n=9) пациенток с овуляторным менструальным циклом и гистологически полноценной секреторной трансформацией эндометрия были отмечены отличные от нормального гомонально-рецепторного ответа эндометрия показатели H-score ER и PR в железах и в строме.
В таблице 16 представлены результаты сравнительного анализа показателей E2 и P в крови в лютеиновую фазу овариального цикла, в котором была выполнена биопсия эндометрия (на 6-8 день после овуляции), значений H-score ER и PR в железах и в строме слизистой тела матки у женщин контрольной и основной групп с овуляторным менструальным циклом, гистологически полноценной секреторной трансформацией эндометрия и нормальным типом гормонально-рецепторного ответа эндометрия; достоверных различий не обнаружено (р 0,01).
Для определения диапазона нормальных значений H-score ER и PR в железах и в строме эндометрия решено было объединить показатели оценки полноценной секреторной трансформации эндометрия у женщин контрольной группы (n=15) и соответствующие морфологические показатели у пациенток основной группы (п=38) - всего 53 женщины (таблица 17).
Признаки нормального гормонально-рецепторного взаимодействия в эндометрии, по результатам ИГХ метода исследования, в лютеиновую фазу менструального цикла (в среднюю фазу секреции в эндометрии) заключаются в синхронном существенном снижении экспрессии ER и PR в железах эндометрия, тенденции к снижению экспрессии ER в строме эндометрия, при этом экспрессия PR в строме эндометрия почти не меняется, оставаясь высокой (рисунок 5 и 6). Такие закономерности соответствуют известным, описанным в специальной литературе данным об адекватных эффектах P в среднюю секреторную фазу трансформации эндометрия: торможении экспрессии ER и PR в железах [81].
По результатам иммуногистохимического исследования образцов эндометрия определены три отличных от нормального иммунофенотипа гормонально-рецепторного ответа слизистой матки: синхронная высокая экспрессия эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в железах и в строме эндометрия - 2 иммунофенотип ответа эндометрия; высокая экспрессия эстрогеновых рецепторов на фоне низкой экспрессии прогестероновых рецепторов в железах эндометрия - 3 эндометриальный иммунофенотип; высокая экспрессия прогестероновых рецепторов при низкой экспрессии эстрогеновых рецепторов в железах эндометрия - 4 иммунофенотип ответа эндометрия.
На рисунках 7 и 8 представлены повышенные уровни экспрессии ER и PR в железах и в строме образцов эндометрия, полученных на 6-8 день после овуляции. Признаки недостаточного гормонально-рецепторного взаимодействия в эндометрии, по данным ИГХ метода исследования, заключаются в отсутствии одновременного снижения экспрессии ER и PR в железах эндометрия.
Различные варианты гормонально-рецепторных ответов эндометрия с высокой экспрессией эстрогеновых и/или прогестероновых рецепторов были определены у 19% (n=9) женщин с овуляторным менструальным циклом и гистологически полноценной секреторной трансформацией эндометрия (n=47) на фоне существенного фиброза стромы, как последствия перенесенного хронического эндометрита.
Из 60 женщин основной группы с овуляторным менструальным циклом и гистологическим заключением о неполноценной секреторной трансформации эндометрия сопоставимые данной гистологической картине значения H-score ER и PR в железах эндометрия (гипер-эстроген-прогестерон-рецепторный, гипер эстроген-рецепторный и гипер-прогестерон-рецепторный типы ответов эндометрия) были у 87% (n=52) пациенток. У 13% (n=8) женщин с овуляторным менструальным циклом и гистологически неполноценными преобразованиями эндометрия определен нормальный гормонально-рецепторный ответ эндометрия (1 иммунофенотип). Нормальный вариант гормонально-рецепторного ответа эндометрия, в данном случае, свидетельствует о достаточных гормонально-рецепторных взаимодействиях в слизистой тела матки.
В целом, в основной группе среди участниц с овуляторным м.ц. (n=107) у 43% (n=46) были признаки нормального гормонально-рецепторного ответа эндометрия по результатам ИГХ метода исследования, соответствующего средней секреторной фазе эндометриального цикла.
Для уточнения особенностей гистологических заключений и гормонально-рецепторного статуса эндометрия был проведен детальный сравнительный анализ соответствующих показателей у женщин основной группы в зависимости от типа нарушения репродуктивной функции в анамнезе.
Выполнен сравнительный анализ содержания E2 и P в крови в менструальных циклах, в которых получали пайпель-биоптаты эндометрия (на 6-8 день после овуляции), значений М-эха по данным УЗИ органов малого таза, показателей H-score ER и PR в железах и в строме эндометрия по результатам иммуногистохимического исследования эндометрия в подгруппах женщин основной группы с овуляторным м.ц. В таблице 18 представлены соответствующие показатели у женщин в подгруппах основной группы при наличии 1 иммунофенотипа эндометрия (n=46). Не выявлено достоверных различий между подгруппами пациенток основной группы (p 0,01).