Введение к работе
Актуальность исследования. Невынашивание беременности - одна из наиболее сложных проблем репродуктологии, которая в настоящее время приобретает все большее медицинское и социально-экономическое значение в связи со сложившейся демографической ситуацией в России.
Эпидемиологические данные показывают, что частота невынашивания беременности составляет 15-20%. До 85% выкидышей приходятся на первый триместр беременности, остальные 15% - на второй и третий [Хашукоева А.З. и соавт, 2009; Макаров О.В., 2010; Сидельникова В.М., 2010; Доброхотова Ю.Э., 2011; Серов В.Н., Сухих Г.Т., 2014; Goddijn M., 2000].
Исследованиями в области медицинской генетики установлено, что хромосомные и межхромосомные перестройки являются частой причиной привычного невынашивания беременности [Серов В.Н., Сухих Г.Т., 2014]. Но прерывание беременности происходит и при нормальном кариотипе плода. При этом вопрос о вкладе генетических повреждений остается открытым ввиду недостаточной разрешающей способности цитогенетических методов. Поэтому, углубленное изучение роли генетических нарушений у беременных, мутаций, предмутационных повреждений, ведущих к репродуктивным потерям, является актуальной научной задачей, решение которой перспективно для создания новых методов диагностики и разработки терапевтических стратегий.
Генотоксические повреждения вызываются ак эндогенными, ак и экзогенными факторами. Исключая прямые физические или химические взаимодействия с ДНК, в качестве основного механизма индукции мутаций рассматриваются свободно-радикальные процессы. Нарушение баланса про- и антиоксидантных систем ведет окислительному стрессу, избыточному образованию активных форм кислорода, продуктов перекисного окисления липидов, способных нарушать структуру функциональную активность макромолекул клетки, включая нуклеиновые кислоты [Дурнев А.Д., Середенин СБ., 1998; Adly A.M, 2010; Raha A., 2014]. Данные о генотоксических проявлениях окислительного стресса немногочисленны, что, по-видимому,
связано с методическими сложностями изучения этой взаимосвязи. Решение вопроса представляется возможным при использовании новых подходов к анализу генетических нарушений.
К числу новейших способов оценки ДНК-повреждений, включая предмутационные, относится метод ДНК-комет [Collins A.R, 2013], основанный на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и ее фрагментов, заключенных в агарозном геле. Определение специфического продукта свободно-радикальной атаки ДНК - 8-гидрокси-2-деоксигуанозина также обнаруживает ДНК повреждения [Jena N.R, 2012; Nikitaki Z., 2015]. Характеристики нарушений структуры ДНК, окислительного стресса, апоптоза могут быть дополнены специфическими показателями, такими как уровни внеклеточной ДНК, белка Р53, экспрессирующегося при деструкции ДНК [Lodish. H., 2003], цитохрома С, отражающего апоптотическую гибель по митохондриальному пути [Mavridou D.A., 2013]. Метод ДНК-комет может быть использован опытах ex vivo путем инкубации клеток со стандартным прооксидантом, что позволяет провести сравнительную оценку «антиоксидантной емкости» анализируемых образцов.
Поэтому для выяснения закономерностей возникновения генетических
дефектов, зависящих т окислительного тресса, настоящей аботе
предпринято комплексное исследование с использованием вышеприведенных показателей группах пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность» в сравнении с группой с физиологически протекающей беременностью.
Цель исследования
Выявление генетических повреждений, зависимых от окислительного стресса, и оценка маркерной значимости показателей генотоксичности при невынашивании беременности.
Задачи исследования
1. Провести комплексное обследование пациенток с невынашиванием беременности и сформировать группы с диагнозом «Начавшийся выкидыш.
Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность»,
«Физиологически протекающая беременность» и группу здоровых небеременных.
-
На выделенных группах провести сравнительный анализ уровня ДНК-повреждений методом ДНК-комет.
-
Исследовать содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина летках и сыворотке крови пациенток патологией беременности, нормально протекающей беременностью и у небеременных.
-
В сформированных группах провести сравнительный анализ содержания внеклеточной ДНК в плазме крови.
-
Провести оценку экспрессии белка Р53 у пациенток патологией беременности, физиологической беременностью и у небеременных.
-
В сформированных группах провести сравнительный анализ содержания цитохрома С в сыворотке крови.
-
Оценить чувствительность клеток крови, полученных от пациенток выделенных групп, к действию стандартного прооксиданта.
-
Провести статистическую обработку результатов исследования и определить показатели генотоксичности, ассоциированные невынашиванием беременности.
Научная новизна
В клиническом исследовании установлено увеличение овня генетических повреждений, включая предмутационные, при невынашивании беременности. Доказано, что применение метода ДНК-комет и определение внеклеточной ДНК в крови пациенток с патологией беременности позволяет характеризовать проявления генотоксичности на ранних сроках. Выявлены изменения экспрессии белка Р53, специфичные для диагноза «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность». Доказано, что степень антиоксидантной защиты клеток крови пациенток при патологии беременности на ранних сроках снижена. Для состояний невынашивания беременности установлена маркерная значимость кластера
показателей, включающего чувствительность к прооксиданту, уровень ДНК-комет, содержания внеклеточной ДНК, экспрессии белка Р53.
Практическая значимость работы
Выявление кластера показателей, характеризующих проявления
генотоксичности при невынашивании беременности, позволяет дополнить
обследование пациенток методами, информативными отношении
повреждений ДНК, включая предмутационные. Доказательства различий в степени антиоксидантной защиты при физиологически протекающей беременности и при невынашивании беременности с использованием метода ДНК-комет ex vivo определяет целесообразность данного анализа ри обследовании беременных пациенток в комплексе медико-генетической консультации.
Доказательство достоверных различий в показателях генотоксичности и
апоптоза на относительно небольших выборках создает предпосылки для
масштабирования исследований с целью определения популяционных границ
как физиологической нормы показателей ластера, ак и их значений,
свидетельствующих о патологии. Патогенетическая значимость сдвигов
зарегистрированных параметров генотоксичности, зависимой от
окислительного стресса, определяет возможность разработки
фармакотерапевтических стратегий профилактики нежелательных последствий, связанных с патологией беременности.
Положения, выносимые на защиту
1. В сравнении с показателями, зарегистрированными при физиологически протекающей беременности, невынашивание беременности у пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» сопровождается увеличением повреждений ДНК, регистрируемых методом ДНК-комет, роках 10-11, 12-13, 14-15 недель 2,5, 2,6, 2,5 раз соответственно, при определении внеклеточной ДНК в плазме крови в сроках 10-11, 14-15 недель - в 1,3, 1,6 раз соответственно, у пациенток с диагнозом
«Неразвивающаяся беременность» сопровождается увеличением повреждений ДНК, регистрируемых методом ДНК-комет, в сроке 10-11 недель в 1,8 раз, при определении внеклеточной ДНК в плазме крови - в 1,5 раза.
-
Экспрессия белка Р53 увеличивается при патологической беременности по сравнению с физиологической, специфически повышаясь при начавшемся выкидыше в сроке 14-15 недель в 1,75 раза и при неразвивающейся беременности в сроке 10-11 недель - в 2,3 раза по сравнению с показателями соответствующих сроков при физиологически протекающей беременности.
-
При физиологически протекающей беременности антиоксидантная емкость клеток выше, чем при патологии беременности. Степень защиты к действию прооксиданта в сроки 10-11 недель при диагнозе «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» выше в 1,35 раза, чем при неразвивающейся беременности.
-
Для состояний невынашивания беременности установлена маркерная значимость кластера показателей: чувствительность к прооксиданту, уровень ДНК повреждений, внеклеточной ДНК, экспрессии белка Р53.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы клинико-диагностического отделения филиала «Перинатальный центр» Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница №24 Департамента здравоохранения . Москвы», гинекологического отделения осударственного бюджетного учреждения здравоохранения города Москвы «Городская клиническая больница №1 им. Н.И. Пирогова Департамента здравоохранения города Москвы», а также используются учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии
лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ РФ, сотрудников гинекологического отделения ГБУЗ ГКБ №1 им Н.И. Пирогова ДЗ г. Москвы 09 февраля 2016г., протокол №7.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.
Личное участие автора
Автором лично проведена работа по сбору клинического материала,
клиническому и инструментальному обследованию тематических больных,
анализу клинико-лабораторных инструментальных исследований,
статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследования.
Диссертация изложена на 151 странице печатного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, клинической характеристики групп пациенток, результатов собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя литературы, включающего 274 источника, из них 75 - отечественных и 199 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 14 гистограммами и 3 рисунками.