Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современные проблемы диагностики и лечения послеродовых гнойно-септических заболеваний (обзор литературы) .10
1.1.Эпидемиологические аспекты послеродовых гнойно-септических заболеваний 10
1.2.Антимикробные пептиды (АМП) в патогенезе акушерских и гинекологических осложнений .20
1.2.1. Основные сведения об АМП .20
1.2.2. АМП и инфекционные осложнения беременности и послеродового периода 23
1.2.3. АМП и инфекции в гинекологии 25
1.2.4. Перспективы использования АМП в клинической практике .28
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 29
2.1. Объект исследования .29
2.2. Методы исследования 34
2.2.1.Клиническое обследование и сбор материала 34
2.2.2. Бактериоскопическое и бактериологическое исследование .35
2.2.3.Молекулярно-генетическое исследование .37
2.2.4.Статистическая обработка результатов 40
ГЛАВА 3. Результаты 41
3.1.Клинические факторы риска развития послеродового эндометрита .41
3.1.1. Факторы риска развития послеродового эндометрита после родов через естественные родовые пути 41
3.1.2.Факторы риска развития послеродового эндометрита после кесарева сечения .56
3.2.АМП в патогенезе послеродовых осложнений .71
3.2.1.Экспрессия мРНК антимикробных пептидов при послеродовом эндометрите .71 3.2.2.Экспрессия АМП в цервикальном канале после операции кесарева сечения и родов через естественные родовые пути (3-4 сутки послеродового периода) 72
3.2.3. Влияние экспрессии антимикробных пептидов на микробиоценоз женских половых путей во время беременности .73
3.2.4.Влияние экспрессии антимикробных пептидов на течение беременности и родов .79
3.2.5.Возможности использования экспрессии антимикробных пептидов для прогнозирования послеродового эндометрита .83
ГЛАВА 4.Обсуждение .85
Заключение .99
Выводы .102
Практические рекомендации .104
Список сокращений 105
список литературы
- АМП и инфекционные осложнения беременности и послеродового периода
- Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
- Факторы риска развития послеродового эндометрита после родов через естественные родовые пути
- Влияние экспрессии антимикробных пептидов на микробиоценоз женских половых путей во время беременности
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из основных задач государства
является снижение материнской смертности (Послание Президента
Федеральному собранию, 2014). В связи с этим прогнозирование и ранняя
диагностика послеродовых гнойно-септических заболеваний представляет
собой актуальную задачу, так как они занимают четвертое место в структуре
материнской смертности (Материнская смертность в РФ, 2015). Частота
послеродовых гнойно-септических осложнений неуклонно растет, что связано с
увеличением числа антибиотикорезистентных штаммов вследствие
нерациональной антибактериальной терапии и быстрого развития
антибиотикорезистентности к новым препаратам (ESCMID, 2015).
Появился и целый ряд новых акушерских причин, приводящих к
бактериальной контаминации полости матки – инвазивные процедуры (амнио-
и кордоцентез), а также наложение швов на шейку матки (С.Н. Буянова, 2012).
Большую роль в увеличении частоты гнойно-септических осложнений играет
концентрация пациентов в больших стационарах, рост частоты кесарева
сечения (Ю.Э. Доброхотова с соавт., 2015; Г.М. Савельева с соавт., 2015;
C.Acosta et al., 2014), увеличение возраста родильниц и числа
экстрагенитальных заболеваний (И.Н. Коротких с соавт., 2011; A. Chebbo et al., 2016).
Также отмечается изменение спектра микроорганизмов, вызывающих послеродовый эндометрит. Наряду с грамотрицательной флорой увеличивается значимость грамположительных микроорганизмов (Э.К. Айламазян с соавт., 2011; В.Е. Радзинский, 2016; A.Cape, 2013), с преобладанием микст-инфекций (В.С. Горин, 2011; Л.В. Ткаченко с соавт., 2013).Дрожжеподобные грибы рода Candida, не являясь этиологическим фактором, тем не менее, способствуют увеличению бактериальной массы за счет продукции ими факторов роста и предоставления питательных веществ (J.Leveau, 2008; О.И. Климова, 2016).
Увеличению частоты послеродовых инфекций и их генерализации способствует также запоздалая диагностика, что связано с увеличением частоты стертых и абортивных форм послеродового эндометрита. Причиной этого является как использование широкого арсенала профилактических средств, так и наличие нозокомиальных штаммов (I.J.Butt et al., 2013). Несвоевременная диагностика связана с отсутствием типичной клинической картины, специфических эхографических признаков (В.С. Горин, 2011; Б.Е. Гребенкин, 2010). Кроме того, у некоторых пациенток эндометрит развивается даже при небольшом количестве возбудителя, что можно объяснить нарушением местной и общей иммунореактивности (М.С. Селихова, 2012).
В связи с этим, большое значение уделяется изучению роли факторов местного и системного иммунитета и возможности их использования в качестве прогностических критериев (Г.Т. Сухих с соавт., 2012; А.Н. Рыбалка с соавт., 2016).
Лечение послеродовых заболеваний вследствие возрастающей
антибиотикорезистентности тоже представляет значительные трудности. Попытки создать новые антибиотики не увенчались успехом, так как
микроорганизмы вырабатывают устойчивость к ним в течение 1-3 лет. Кроме
того, рентабельность разработки новых антибиотиков в 4 раза ниже, чем других
групп препаратов из-за больших временных и финансовых затрат (A.D. So,
2011). Низкая эффективность синтетических препаратов заставила
специалистов думать, что продукты природного происхождения могут стать прототипами более эффективных антибактериальных средств (ВОЗ, 2013).
В этой связи представляет интерес изучение антимикробных белков,
которые синтезируются эпителиоцитами и клетками системы врожденного
иммунитета и представляют собой первый барьер на пути проникновения
инфекции. Антимикробные пептиды (АМП) играют роль в патогенезе
преждевременных родов (R. Romero et al., 2010; О.В. Макаров с соавт, 2008), хорионамнионита (J. Xu, 2008), участвуют в защите от половых инфекций и ВИЧ и в процессе имплантации (A. Horne, 2008).
Однако их роль в патогенезе послеродового эндометрита практически не изучалась. Также не изучены возможности их применения для прогноза и лечения послеродовых гнойно-септических осложнений. Это и послужило поводом для изучения роли АМП в развитии послеродовых воспалительных заболеваний.
Цель работы: улучшить репродуктивное здоровье женщин путем совершенствования прогнозирования послеродового эндометрита на основании определения экспрессии АМП.
Задачи исследования:
1. Установить клинические факторы риска развития послеродового
эндометрита.
-
Выявить наиболее значимые этиологические факторы инфекционно-воспалительных осложнений у беременных и родильниц на основании бактериоскопических, бактериологических и молекулярно-биологических методов исследования.
-
Определить значимость экспрессии АМП в патогенезе послеродового эндометрита.
-
Разработать способ индивидуального прогноза развития послеродового эндометрита у беременных с высокой степенью инфекционного риска.
Научная новизна. Показаны клинические аспекты риска развития послеродового эндометрита, характерные для стационаров высокой степени риска на современном этапе.
Определены границы нормальных величин экспрессии мРНК АМП на позднем сроке гестации и на 3 сутки после родов.
Впервые показано, что уменьшение экспрессии АМП приводит к увеличению количества бактерий в женских половых путях.
Выявлены новые звенья патогенеза послеродового эндометрита. Доказано, что для женщин с послеродовым эндометритом характерно уменьшение экспрессии HBD3, HD5 на позднем сроке гестации. Таким образом, АМП можно рассматривать в качестве прогностических признаков развития послеродового эндометрита.
Теоретическая и практическая значимость работы. Определены клинические факторы риска развития послеродового эндометрита, что позволяет своевременно сформировать группы риска, требующие своевременного обследования и профилактики.
Разработан способ определения экспрессии АМП в эпителии
цервикального канала, наиболее подходящий для использования в клинической практике. Положительным аспектом метода является длительность хранения исследуемого материала без разрушения РНК, простота получения материала. С помощью подбора стабильно экспрессируемых генов в эпителии цервикального канала была достигнута точность определения экспрессии РНК. Разработанный и внедренный способ прогнозирования и профилактики послеродового эндометрита позволяет улучшить течение послеродового периода у пациенток с высокой степенью инфекционного риска. Снижение частоты послеродового эндометрита приводит к сохранению репродуктивной функции женщин. Способ малоинвазивен, не требует большого количества времени исполнения, прост в реализации.
Положения, выносимые на защиту.
1. Факторами риска развития послеродового эндометрита при
влагалищном родоразрешении являются: многоплодная беременность,
преждевременное излитие околоплодных вод, вакуум-экстракция плода, ручная
ревизия полости матки, разрывы шейки матки и промежности, увеличение
объема кровопотери в родах, преждевременное излитие околоплодных вод.
Факторами риска развития послеродового эндометрита при абдоминальном
родоразрешении являются многоплодная беременность, анемия беременных,
преэклампсия тяжелой степени, раннее излитие околоплодных вод, серозный
хориодецидуит, инволютивно-дистрофические изменения плаценты.
2. У пациенток высокой степени инфекционного риска основными
возбудителями послеродового эндометрита являлись: Staphylococcus
epidermidis, Klebsiella pneumoniae и Citrobacter. В общей популяции
диагностически значимым является обнаружение бактерий рода Enterobacter и
Staphylococcus epidermidis.
3. Антимикробные пептиды способствуют формированию
микробиоценоза женских половых путей, влияют на развитие плацентарной
недостаточности и ВУИ. Снижение экспрессии HNP3, HD5 в цервикальном
канале ведет к увеличению количества бактерий в женских половых путях.
Увеличение экспрессии SLPI, HBD1 и HBD4 свидетельствует об увеличении
количества грамположительных бактерий в женских половых путях.
4. Развитие послеродового эндометрита связано со сниженной
экспрессией антимикробных пептидов (АМП), в частности, HBD3 и HD5, на
поздних сроках беременности. При неосложненном послеродовом периоде
экспрессия антимикробных пептидов выше у пациенток после абдоминального
родоразрешения, чем у женщин, роды которых были через естественные
родовые пути. На основании экспрессии АМП на поздних сроках беременности
разработан способ прогнозирования послеродового эндометрита.
Способ прогноза возникновения послеродового эндометрита внедрен в
практическую работу Перинатального центра Белгородской Областной
клинической больницы Св. Иоасафа. Полученные данные о роли
антимикробных пептидов в патогенезе послеродового эндометрита
применяются в учебной работе кафедр медико-биологических дисциплин и акушерства и гинекологии НИУ «БелГУ».
Степень достоверности и апробация результатов.
Основные положения работы представлены на научно-практических конференциях (2012 – 2014): III ежегодной научной конференции молодых ученых и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых-2012» (Санкт-Петербург, 2012), XVI World Congress of gynecological endocrinology (Florence, Italy, 2014), V Общероссийском научно-практическом семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии» (Сочи, 2012), XV World Congress on Human Reproduction (Venice, Italy, 2013), I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013), XXIII European Congress in Obstetrics and Gynaecology (Glasgow, United Kingdom, 2014), Всероссийской научной Интернет-конференции с международным участием «Сервис виртуальных конференций PaxGrid» (2014). Диссертационное исследование доложено на совместном заседании кафедр акушерства и гинекологии, медико-биологических дисциплин и психиатрии, наркологии, клинической психологии НИУ «БелГУ» (протокол №5 от 27.06.2016г.).
Публикации результатов исследования. По теме диссертационной работы опубликовано 18 печатных работ, 10 – в журналах из Перечня ВАК, получен 1 патент на изобретение.
Исследование выполнено при поддержке гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 13-04-01941 «Антимикробные пептиды в патогенезе послеродового эндометрита» (2013-2014) (№ госрегистрации 01201357442).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава I), материалов и методов исследования (глава II), результатов собственного исследования (глава III), обсуждения (глава IV), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений, списка литературы и 1 приложения. Диссертация содержит 51 таблицу и 2 рисунка. Список литературы содержит 190 источников литературы, из них – 57 отечественных и 133– иностранных.
АМП и инфекционные осложнения беременности и послеродового периода
Возбудителями стертой формы эндометрита могут быть также микроорганизмы, передаваемые половым путем – хламидии, микоплазмы, уреаплазмы [13].
Известно, что развитие воспаления зависит не только от количества и вирулентности возбудителя, но и от иммунореактивности организма. Так, количество возбудителя более 104 КОЕ/мл можно считать достаточно условным диагностическим критерием, потому что у ряда пациенток эндометрит может развиться и при бактериальной обсемененности 102 КОЕ/мл, что взаимосвязано с особенностями иммунореактивности у каждой конкретной женщины.
Одним из ранних маркеров развития послеродового эндометрита является уровень провоспалительных цитокинов [4]. Показано, что полиморфизм генов цитокинов играет роль в развитии сепсиса, вызванного стрептококками группы А [114]. В развитии послеродового эндометрита велика также роль неспецифического (врожденного) иммунитета, являющегося первым барьером на пути инвазии микроорганизмов. Так, уменьшение экспрессии Толл-подобных рецепторов 4 и 5 является фактором риска развития послеродовых гнойно-септических заболеваний вследствие снижения местной иммунореактивности, что создает благоприятные условия для транслокации возбудителей в ткани [23; 38]. Также у этих пациенток наблюдается снижение активности фагоцитоза [57], количества T-лимфоцитов и иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 [54; 137; 126].
Еще одной из причин роста частоты послеродовых гнойно-септических заболеваний является трудность диагностики стертых и абортивных форм, которые в настоящее время имеют тенденцию к увеличению [34], что связано как с использованием широкого арсенала профилактических средств, так и с наличием нозокомиальных штаммов [96]. Поэтому такое течение заболевания довольно часто приводит к запоздалой диагностике, неадекватному лечению и генерализации процесса [39; 40]. Основными симптомами таких форм являются лохиометра и субинволюция матки, которые в настоящее время рассматриваются как моносимптомные формы эндометрита и также требуют полноценного лечения из-за высокого риска генерализации процесса вследствие недооценки этих состояний [18]. Эхографическое исследование позволяет оценить размеры и состояние полости матки, динамику ее инволюции и состояние рубца на матке после операции кесарева сечения. Однако наряду с типичной ультразвуковой картиной часто наблюдается, так называемый, «второй вариант», при котором полость матки не расширена и не содержит сгустков или остатков плацентарной ткани. Такая эхографическая картина наблюдается у 28% пациенток и значительно затрудняет диагностику [34]. Поэтому предложено сочетать УЗИ с цветным допплеровским картированием, которое позволяет выявить гипоперфузию матки [9], а также с биофотометрией последа после родов [27]. Также предложено проводить эхографическое исследование в динамике – в раннем послеродовом периоде и на 3 сутки после родов [14]. Тем не менее, эхографическое исследование не является достоверным методом диагностики послеродового эндометрита, так как величина матки и ее полости в послеродовом периоде зависит от множества других факторов (крупный плод, многоплодная беременность и др.).
Так как основными возбудителями послеродового эндометрита являются условно-патогенные микроорганизмы, для их выявления применяют как бактериологическое исследование, так и метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в том числе с использованием микрофлуидальных чипов [45]. Недостатком бактериологического исследования является необходимость быстрой транспортировки образцов в лабораторию при соблюдении определенных температурных условий. Другим недостатком является отсутствие информации о наличии в образце анаэробов, так как для их транспортировки и культивирования необходимо наличие анаэростатов. Преимуществом ПЦР перед бактериологическим исследованием является более длительная сохранность материала, что не требует строгих временных и температурных условий доставки. Но наличие микроорганизмов, выявленных методом полимеразной цепной реакции, не является значимым в прогнозе развития эндометрита. Необходимо количественное определение возбудителей, для чего используют количественную ПЦР, в том числе и на микрофлуидальных чипах. Отечественные компании выпускают такие наборы, как «Фемофлор» и «Инбиофлор», однако в первом случае количественно определяют только 4 условно-патогенных аэробных микроорганизма, во втором – только анаэробные [33]. Однако возможность количественного определения спектра анаэробных микроорганизмов является неоспоримым преимуществом метода ПЦР перед бактериологическим исследованием [50]. Недостатком ПЦР по сравнению с бактериологическим исследованием является то, что данный метод не позволяет оценить чувствительность бактерий к антибиотикам.
Еще одним способом определения веществ, определяющих феномен кооперативной чувствительности микроорганизмов, является масс спектрометрия [56]. Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDIOFF) позволяет быстро определить видовой состав и чувствительность бактерий к антибиотикам [48]. Однако оборудование для этих исследований является дорогостоящим, себестоимость исследования значительно превышает себестоимость бактериологического исследования.
Многообразие возбудителей, с преобладанием собственной условно-патогенной микрофлоры, часто резистентной к антибиотикам и образующей микробные ассоциации, ставит вопрос о необходимости разработки методов лечения, направленных на весь спектр возбудителей и/или улучшающих иммунореактивность организма хозяина.
Наиболее инновационными формами лечения преодоления антибиотикорезистентности является не преодоление антибиотикорезистентности микроорганизмов как таковой, а введение моноклональных антител к ним или лимфоцитов, продуцирующих специфические антитела [167]. Выраженность клинических симптомов зависит от ответа организма хозяина в не меньшей, а то и в большей степени, чем от самого микроорганизма [73]. Поэтому имеет смысл разработка препаратов, которые снижают иммунный ответ организма или блокируют доступ к ресурсам организма хозяина, не вызывая гибель микроорганизмов напрямую. Например, ингибиторы синтеза липополисахаридов у грамотрицательных бактерий не приводят к гибели Acinetobacter baumannii, но предотвращают развитие вызванных им осложнений [115]. Еще одной стратегией является создание пробиотических препаратов, микроорганизмы которых расходуют те же питательные вещества, что и возбудители заболеваний [79].
Еще одним из активно развивающихся направлений является использование бактериофагов, представляющих собой вирусы, активные против определенных бактерий [47]. Российская Федерация в настоящее время является одной из стран-лидеров в разработке данных методов лечения [49]. Преимуществом данного метода терапии является то, что бактериофаги, представляющие собой вирусы, нечувствительны к антибиотикам и могут быть использованы в комбинации с антибактериальной терапией для увеличения ее эффективности [31]. Но применение бактериофагов имеет свои ограничения, так как они обладают избирательной тропностью к определенным бактериям, их действие не распространяется на другие микроорганизмы (грибы, простейшие) [51]. Существует устойчивость бактерий к некоторым типам бактериофагов.
Бактериоскопическое и бактериологическое исследование
Согласно первой задаче исследования, была проанализирована частота послеродового эндометрита и клинические факторы, влияющие на его возникновение.
Частота послеродового эндометрита на основании клинической картины была значительно выше, чем данные статистики по шифру O85. Подавляющее большинство случаев, выявленных на основании клинической картины в ПЦ ОГБУЗ БОКБ Св. Иоасафа, имели шифр МКБ 10 О90. Однако полученные данные соответствовали данным зарубежной литературы, согласно которым частота послеродового эндометрита составляет 7,9-8,8% [163; 137].
Были проанализированы клинические факторы риска развития послеродового эндометрита. Было установлено, что женщины исследуемых групп сопоставимы по возрасту, паритету, способу родоразрешения.
При сопоставлении женщин с осложненным послеродовым периодом и пациенток контрольной группы достоверных различий по возрасту и антропометрическим данным выявлено не было.
При изучении влияния возбудителей половых инфекций на частоту возникновения послеродового эндометрита были выявлены достоверные различия в частоте обнаружения уреаплазменной инфекции у женщин контрольной подгруппы. Она была выявлена у 11,69% пациенток контрольной группы, и ни у одной пациентки - с послеродовым эндометритом. Сведения о роли уреаплазменной инфекции в патогенезе послеродового эндометрита неоднозначны. Большинство исследований подчеркивают, что она является одной из причин возникновения послеродовых гнойно-септических заболеваний, а назначение макролидов в качестве профилактического средства снижает частоту послеродового эндометрита [155; 161; 85; 149]. Более давние работы указывают на отсутствие взаимосвязи между уреаплазменной инфекцией и возникновением послеродового эндометрита [175;118]. В Кохрановском обзоре 2014 года, посвященном антибиотикопрофилактике гнойно-септических осложнений после кесарева сечения, подчеркивается, что роль Ureaplasma urealyticum в патогенезе гнойно-септических осложнений окончательно не доказана. Этот же обзор исключил из анализа вышеупомянутую работу [155] W.W. Andrews et al. (2003) об эффективности макролидов в профилактике эндометрита, так как все пациентки до пересечения пуповины во время кесарева сечения получали цефалоспорины [165].
В исследовании W. Chaimetal. (2003) было показано, что частота обнаружения Ureaplasma urealyticum при посеве на культуру клеток в группе пациенток с послеродовым эндометритом не отличалась от контрольной. Однако для развития послеродового эндометрита имело значение количество микроорганизмов. Так, эндометрит развивался при концентрации уреаплазмы 105 КОЕ/мл и более. Поэтому имеет значение не только качественное, но и количественное определение Ureaplasma urealyticum в цервикальном канале [183].
Были изучены особенности течения родов у пациенток основной и контрольной групп при родах через естественные родовые пути. Было установлено, что в группе пациенток с развившимся послеродовым эндометритом объем общей кровопотери был на 90 мл больше, чем в группе контроля.
Наши данные подтверждают данные других исследователей, которые относят кровопотерю к факторам риска послеродового эндометрита [Error! Reference source not found.;104; 121]. Это связано с анемизацией пациентки, наличием тканевой гипоксии и метаболического ацидоза, затрудняющих репарацию тканей.
При изучении влияния времени излития околоплодных вод по отношению к родовой деятельности, было выявлено, что достоверно чаще на 22% преждевременное излитие околоплодных вод встречалось у женщин с осложненным послеродовым периодом по сравнению с группой контроля.
Полученные данные согласуются с данными из литературных источников. Амниотомия, продолжительность безводного периода и наличие клиники хорионамнионита лишь незначительно влияло на частоту возникновения послеродового эндометрита [157]. В другом исследовании было установлено, что длительный безводный период является фактором риска послеродового эндометрита, только если он составляет более 24 часов [148].
Во многих исследованиях показано, что преждевременное излитие околоплодных вод может способствовать развитию послеродового эндометрита [174; 121; 104]. Интересно, что в ряде работ показано, что преждевременное излитие околоплодных вод может быть фактором риска послеродового эндометрита вне зависимости от длительности безводного периода [157]. По-видимому, это связано с тем, что причины, приводящие к преждевременному излитию околоплодных вод (наличие инфекции, отсутствие пояса соприкосновения (крупный плод, узкий таз, разгибательные вставления головки и другие состояния, которые также снижают сократительную активность матки)), способствуют и развитию эндометрита в послеродовом периоде.
При оценке влияния оперативных пособий на развитие послеродовых гнойно-септических осложнений было выявлено, что при проведении вакуум-экстракции плода увеличивалась частота возникновения послеродового эндометрита. Она составила 3,33% против 0,32% в группе с неосложненным послеродовым периодом. Данные литературы о роли вакуум-экстракции в патогенезе септических осложнений противоречивы. Согласно результатам, полученным T.L. Halscott et al. (2015), применение акушерских щипцов и вакуум-экстрактора не влияло на возникновение послеродового эндометрита как у перво-, так и у повторнородящих [133]. Однако большинство источников считают вакуум-экстракцию, наряду с наложением акушерских щипцов, фактором риска послеродового эндометрита. Риск послеродовых инфекций после влагалищного оперативного родоразрешения увеличивается из-за повреждений влагалища, обязательной катетеризации мочевого пузыря перед манипуляцией, большего числа влагалищных исследований, введения вакуум-экстрактора во влагалище, что способствует восходящей контаминации половых путей [84; 153; 59]. Частота послеродовых эндометритов после оперативного родоразрешения варьирует от 3,5% до 16% [181]. Кроме того, частота повторной госпитализации в течение 60 дней после родов и частота развития сепсиса по сравнению с самопроизвольными родами у этих пациенток увеличивались [163; 134]. Тем не менее, профилактическое назначение антибиотиков после вакуум-экстракции не влияло на частоту возникновения послеродового эндометрита [59].
Было установлено, что ручная ревизия полости матки также являлась фактором риска послеродового эндометрита.
По данным K.J. Henderson et al. (2015), ручная ревизия полости матки является одной из причин развития послеродовых гнойно-септических осложнений. При проведении мультивариативного анализа было установлено, что это один из главных факторов риска, напрямую связанных с их возникновением [104]. Ручная ревизия полости матки приводит к непосредственному переносу инфекции из нижних отделов половых путей в полость матки. Так как после ручной ревизии полости матки всем пациенткам была назначена профилактическая антибактериальная терапия с использованием антибиотиков широкого спектра действия, можно сделать вывод, что она не всегда была эффективной. Этот факт еще раз подчеркивает необходимость назначения антибиотиков с учетом чувствительности к ним микроорганизмов, что возможно только при проведении бактериологического исследования и антибиотикограммы на поздних сроках беременности.
Также нами была изучена оценка влияния родового травматизма на развитие послеродового эндометрита у пациенток обеих групп. Было установлено, что достоверно чаще повреждения шейки матки и промежности в родах встречалось в группе с осложнившимся послеродовым периодом – 33,33% и 6,67% соответственно, в сравнении с группой контроля – 7,79% и 0,65%.
Это подтверждается данными литературы. Было показано, что при разрывах промежности частота развития эндометрита возрастает в 2,9-4,5 раза. Наибольший риск развития эндометрита наблюдается при повреждении анального сфинктера и прямой кишки [72; 131; 119]. Поэтому все повреждения промежности должны быть тщательно ушиты [121]. Причина повышенного риска развития эндометрита у данных пациенток заключается в наличии питательной среды для микроорганизмов в области ушитой раны, персистенции бактерий на шовном материале с образованием биопленок, анемизацией пациентки в случае большой кровопотери
Факторы риска развития послеродового эндометрита после родов через естественные родовые пути
В клиническом анализе крови в послеродовом периоде у пациенток с эндометритом выявлены более высокие показатели числа лейкоцитов. Достоверным было увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов в группе с осложненным послеродовым периодом по сравнению с группой контроля. Количество лимфоцитов после родов в основой группе было ниже, чем в контрольной.
При анализе результатов гистологического исследования плацентарной ткани у пациенток, родоразрешенных путем операции кесарева сечения, было показано, что у женщин с эндометритом достоверно чаще встречались серозный хориодецидуит и инволютивно-дистрофические изменения плаценты. Полученные данные подтверждают диагноз послеродового эндометрита.
Согласно второй задаче исследования, в общей популяции родильниц были проанализированы данные бактериологического исследования, проведенного на 3-4 сутки послеродового периода. Был изучен состав аэробной флоры у пациенток обеих групп.
Среди пациенток, родоразрешенных через естественные родовые пути, у которых затем развился послеродовый эндометрит, достоверно чаще был выявлен Enterobacter aerogenes (6,67%) по сравнению с контрольной группой (0,65%).
Это подтверждается данными литературы. Так, в Кохрановском обзоре 2014 года указывается, что избыточный рост бактерий рода Enterobacter является фактором риска развития послеродовых инфекционных заболеваний[165].
У пациенток после кесарева сечения Enterobacter aerogenes в 3 раза чаще встречался в основной группе, чем контрольной. Также в основной группе в 1,5 раза чаще был выделен Staphylococcus epidermidis. Известно, что Staphylococcus epidermidis, наряду с другими аэробными возбудителями, является одним из наиболее часто выявляемых при послеродовом эндометрите [121; 38]. По данным литературы, микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae являются типичными возбудителями послеродовых эндометритов [160]. При инфекциях в пуэрперии Enterobacteriaceae обнаруживается реже других аэробных организмов, однако его особенностью является устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения, а также наличие бета-лактамаз, что обеспечивает его устойчивость к незащищенным пенициллинам [60].
При этом чувствительность микроорганизмов к антибиотикам не имела достоверных различий у пациенток обеих групп. По-видимому, развитие воспалительного процесса обусловлено состоянием иммунного ответа организма и вирулентностью возбудителя, а не тем, является ли штамм госпитальным или нет.
Также были изучены особенности аэробной и анаэробной микрофлоры у 85 женщин с высокой степенью инфекционного риска, у которых послеродовый эндометрит развивался гораздо чаще, чем в общей популяции. В дальнейшем женщины были разделены на 2 группы в зависимости от особенностей послеродового периода: с развившимся послеродовым эндометритом (21 человек) и с нормальным послеродовым периодом (64 человека).
Было показано, что достоверно чаще у женщин с осложненным пуэрперием были выделены микроорганизмы рода Staphylococcus. Staphylococcus epidermidis в два раза чаще высевался у пациенток основной группы, в сравнении с группой контроля. Грамотрицательные бактерии рода Klebsiella также значительно чаще были обнаружены у женщин с развившимся послеродовым эндометритом.
Также было проанализировано влияние количества микроорганизмов на риск развития послеродового эндометрита. Было показано, что у пациенток с осложнившимся послеродовым периодом на позднем сроке гестации количество бактерий рода Klebsiella было на 5 порядков больше, чем в группе с нормальным послеродовым периодом, а Staphylococcus epidermidis - на 2 порядка выше. И Staphylococcus, и Klebsiella являются классическими возбудителями послеродового эндометрита, что подчеркивается в работах как отечественных, так и зарубежных авторов [34; 60].
Согласно следующей задаче исследования, были проанализированы особенности экспрессии мРНК антимикробных пептидов у пациенток с послеродовым эндометритом. Анализ проводился до и после родов у 85 пациенток с высокой степенью инфекционного риска.
Было установлено, что у пациенток с развившимся послеродовым эндометритом, во время беременности была достоверно снижена экспрессия мРНК антимикробных пептидов HBD3 и HD5.
Полученные данные говорят о том, что для вознкновения послеродового эндометрита важно исходное снижение уровня антмикробных пептидов, которое происходит еще во время беременности.
В литературе нет данных о роли антимикробных пептидов при послеродовом эндометрите. Однако было показано, что снижение концентрации антимикробных пептидов играет роль в патогенезе воспалительных процессов другой локализации. Так, сниженное количество копий генов приводит к увеличению бактериальной обсемененности носоглотки, что приводит к развити серднего отита [120]. Кроме того, человеческие Р-дефензины обеспечивают хемотаксис незрелых дендритных клеток, нейтрофилов и Т-лимфоцитов [168; 170]. Поэтому снижение экспрессии HBD3 может оказывать негативное влияние на рекрутинг иммунокомпетентных клеток.
При изучении АМП в цервикальном канале после оперативного родоразрешения и самопроизвольных родов на 3-4 сутки послеродового периода было установлено, что более высокая экспрессия SLPI, HNP3, HD6 и HBD4 в цервикальном канале наблюдалась у женщин после кесарева сечения. В отечественных и зарубежных литературных источниках нет данных, которые касаются экспрессии АМП после оперативного родоразрешения. Поэтому можно говорить о том, что эти изменения могут быть взаимосвязаны с различиями в восстановлении микрофлоры влагалища в зависимости от способа родоразрешения. По данным Ж.Ю. Колесаевой с соавторами (2009), при бактериологическом исследовании лохий на 3 сутки после оперативного родоразрешения достоверно чаще была выделена кишечная группа бактерий по сравнению с группой женщин, роды которых произошли естественным путем. Эти изменения наблюдались вне зависимости от применения антибактериальных препаратов [29]. На 5 сутки после операции кесарева сечения достоверно чаще были выделены Corynebacterium и грибы рода Candida. Напротив, Lactobacillus при бактериоскопическом и бактериологическом исследовании на 3 сутки после операции кесарева сечения были выделены достоверно реже, чем у женщин, при самопроизвольном родоразрешении. Так как синтез антимикробных пептидов повышается при увеличении количества бактерий, разница в секреции АМП после оперативного родоразрешения и самостоятельных родов обусловлена особенностями восстановления состояния микрофлоры половых путей женщины.
Влияние экспрессии антимикробных пептидов на микробиоценоз женских половых путей во время беременности
Сбор материала для бактериоскопического исследования производили из цервикального канала и заднего свода влагалища. Полученный материал окрашивали по Граму.
Для проведения бактериологического исследования стерильным тампоном производили сбор материала из цервикального канала. Перед проведением сбора производили удаление цервикальной слизи. Стерильный тампон помещали в угольную среду Amies для транспортировки полученного материала в баклабораторию («Nuova Aptaka», Италия).
Материал собирали в 2 пробирки – одну помещали в анаэростат Becton Dickinson GasPak-100, который снабжен газогенераторными пакетами. Затем из данной пробирки выделяли анаэробные микроорганизмы. Из второй пробирки производили посев материала на питательные среды для выявления аэробных микроорганизмов. Изучаемый материал в течение 1 часа доставляли в бактериологическую лабораторию.
Для определения видов аэробных и анаэробных микроорганизмов был выполнен бактериологический метод исследования согласно методике Приказа МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 и методическими рекомендациями Б.А. Ефимова с соавторами (2002) [16].
Колониеобразующие единицы считали методом Коха [Error! Unknown switch argument.].
Культивацию аэробных микроорганизмов проводили в суховоздушном термостате ТВ-80-1 («Касимовский завод», Россия). В термостате – анаэростате МCO-15AC («Sanyo», Япония) исследовали анаэробные микроорганизмы. Для исследования использовали бескислородные условия.
Посев аэробных микроорганизмов выполняли на 5% кровяной агар. Затем проводили отсев на селективные среды.
Селективный Bile esculin azid agar («Sigma-Aldrich», США) использовали для выделения энтерококков на основании способности расти в присутствии желчи, что позволяет дифференцировать их от других стрептококков.
Желточно-солевой агар Staphylococcus agar («Conda», Испания) применяли для выделения Staphylococcus. На основании способности Staphylococcus aureus к плазмокоагуляции проводили дифференциальную диагностику между ним и Staphylococcus epidermidis.
Escherichia coli выявляли путем посева на среду Эндo (ЗАО «HИЦФ», Россия). Культивирование Enterobacteriaceae, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas aeruginosa проводили на среде MacConkey («Conda», Испания). После проводили микроскопическую идентификацию и верификацию путем определения оксидазной, лецитиназной, каталазной активности.
Культивирование Lactobacillus проводили на среде MRS (ЗAО «HИЦФ», Россия). На данной среде они прорастали по типу белых гладких или шероховатых колоний, которые не обладают оксидазной и каталазной активностью.Bifidobacterium высевались на твердой среде Блаурокка («Conda», Испания) в течение 72 часов.
На среду Columbia agar base («Sigma-Aldrich», США) с добавлением 5% крови и 24-х часовой анаэробной инкубацией проводили посевы для обнаружения грамположительных спорообразующих Clostridium. Бактероиды высевали на селективной среде Bacteroides Bile esculin agar («Sigma-Aldrich», США). Для того, чтобы выделить другие облигатно- и факультативно анаэробные бактерии применяли Schaedler agar («Sigma-Aldrich», США), жидкую тиогликолевую среду Fluid Thioglycollate medium («Becton-Dickinson», США). Грибы рода Candida выявлялись на среде Сабуро (ЗАО «НИЦФ», Россия) в течение 72 часов. 2.2.3.Молекулярно-генетические методы исследования Экспрессию мРНК АМП в эпителии цервикального канала определяли методом количественной ПЦР в научно-исследовательской лаборатории «Молекулярная генетика человека» НИУ «БелГУ» (руководитель лаборатории – проф., д.м.н. Чурносов М.И.). Для получения РНК, из собранного материала, размораживали пробирки с содержимым при комнатной температуре. После этого их подвергали центрифугированию при 12000 оборотах («Eppеndorf-5418R», Германия) 5 – 10 минут, затем сливали надосадочную жидкость. Взвесь эпителиальных клеток, составляющих полученный осадок, являлась материалом, пригодным для выделения РНК.
Выделение РНК проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Для этого использовали реагент «Тризол» («Invitrogen», США). Для проверки качества РНК использовали электрофорез в 1,1% агарозном геле с бромистым этидием. Для удаления геномной ДНК применяли ДНКзу DNAse I RNAse free («Fermentas», США) согласно инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора «Обратная транскриптаза Mint» и олигодезоксинуклеотидов (oligoDT) («Евроген», Россия) на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). В реакцию вносили 500 нг. РНК, которую перед этим нагревали до 55C. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре «Nanodrop» («Thermoscientific», США) и добавляли 4 мкл oligoDT (20 мкМ). Качественные свойства полученной кДНК оценивали при помощи гель-электрофореза в 1,1% агарозном геле с содержанием бромистого этидия. Полученную кДНК смешивали со стерильной водой в объеме 1:25. Количественную ПЦР выполняли согласно рекомендациям MIQE [177]. Праймеры подбирали при помощи базы данных BLAST (NCBI, США). Была изучена экспрессия мРНК АМП, последовательность нуклеиновых кислот которых представлена в базе данных BLAST: секреторный ингибитор лейкоцитарных протеаз (SLPI), человеческие нейтрофильные белки (HNP1, HNP3, HNP4), человеческие дефензины (HD5, HD6), человеческие -дефензины (HBD1, HBD3, HBD4). Выделенные пары праймеров протестировали на вероятность образования «шпилек» и димеров, используя программу Beacon Designer Free Edition (США).