Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Предикторы «слабого» ответа яичников на стимуляцию гонадотропинами 11
1.2. Патофизиологические основы использования СТГ для преодоления «слабого» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию в программах ЭКО 15
1.3. Современные стратегии преодоления «слабого» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию в программах ЭКО в условиях адъювантной терапии СТГ 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Материалы исследования 33
2.2. Методы исследования 37
2.2.1. Клинико-анамнестический метод 37
2.2.2. Гормональный метод исследования 38
2.2.3. Эхографический метод 39
2.2.4. Контролируемая овариальная стимуляция у пациенток со «слабым» ответом 40
2.2.5. Оценка оплодотворения и характеристика эмбриогенеза 43
2.2.6. Статистический метод 46
Глава 3. Результаты собственных исследовании 48
3.1. Клинико-анамнестическая характеристика пациенток с прогнозируемым «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами 48
3.2. Результаты гормонального обследования пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами 55
3.3. Результаты исследования факторов роста в сыворотке крови и фолликулярной жидкости методом иммуноферементного анализа у пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами 57
3.4. Показатели стимуляции яичников у пациенток обследованных групп.. 60
3.5. Показатели эффективности эмбриологического этапа программы ЭКО 62
3.6. Эффективность программ ЭКО и ЭКО/ICSI у пациенток обследованных групп 65
3.7. Результаты корреляционного анализа взаимосвязи клинико-лабораторных показателей и исходов протоколов ЭКО 67
3.8. Разработка математической модели для прогнозирования эффективности программ ЭКО у пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию 74
Глава 4. Обсуждение результатов 78
Выводы 88
Практические рекомендации 91
- Патофизиологические основы использования СТГ для преодоления «слабого» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию в программах ЭКО
- Клинико-анамнестическая характеристика пациенток с прогнозируемым «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами
- Результаты корреляционного анализа взаимосвязи клинико-лабораторных показателей и исходов протоколов ЭКО
- Разработка математической модели для прогнозирования эффективности программ ЭКО у пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию
Патофизиологические основы использования СТГ для преодоления «слабого» ответа яичников на гонадотропную стимуляцию в программах ЭКО
Научные исследования последних лет привнесли значительные изменения в понимание сложнейшей системы регуляции инициации пубертата, цикличности менструальной функции, процессов фолликулогенеза и яичникового стероидогенеза. Ключевым компонентом гармоничного развития человеческого организма ещё до момента рождения является нормальное функционирование соматотрофов гипофиза как основного источника СТГ, определяющего корректное морфологическое и функциональное становление большинства органов и тканей. Вовлечение гормона роста в функционирование репродуктивной системы отмечается как на уровне высших регуляторных механизмов, так и в непосредственном биологическом влиянии на органы - мишени [45]. В течение последнего десятилетия на фоне открытия новых свойств белка кисспептина в физиологии произошла смена парадигмы нейроэндокринной регуляции репродуктивной функции и инициации пубертата. Согласно данным многочисленных исследований, кисспептину отведена ведущая роль в координации работы нейронов, секретирующих гонадотропин-рилизинг гормон (ГнРГ). В то же время остается спорным вопрос о влиянии данного нейропептида на количественные и временные характеристики секреции СТГ. В большинстве исследований не удалось отметить значимого воздействия кисспептина на частоту или амплитуду импульсов гормона роста как у животных, так и у человека [20, 44]. Необходимо отметить, что у мышей с дефектом рецепторов кисспептина наблюдалось снижение массы тела, что косвенно может свидетельствовать о нарушении секреции СТГ [148]. Кроме того, получены данные о значительной дозозависимой стимуляции экспрессии гена гормона роста, а также об увеличении секреции данного гормона при введении кисспептина некоторым видам крыс, рыб, обезьян [100, 149]. Экспрессия рецептора кисспептина в соматотрофах гипофиза визуализирована у некоторых видов животных и рыб [100, 147]. Согласно данным литературы, не получено достоверных сведений о наличии рецепторов СТГ на кисснейронах [119]. Таким образом, прямое моделирующее влияние гормона роста на активность нейронов, секретирующих ГнРГ, маловероятно, но нельзя исключить возможность взаиморегуляции функций соматотрофов и гонадотрофов в гипофизе [45, 119]. В пользу данной гипотезы свидетельствует факт наличия рецепторов гормона роста и его ингибирующих белков в цитоплазме и ядре гонадотрофов. Необходимо отметить, что обязательным компонентом для адекватного развития гонадотропных питуицитов являются соматотрофы [42, 45].
Сведения о влиянии гормона роста на секрецию гонадотропинов противоречивы. У некоторых видов животных отмечено достоверное снижение базальных и стимулированных уровней ФСГ и ЛГ при резистентности к СТГ или при его врождённом дефиците [120]. В то же время введение гормона роста у женщин с аменореей сопровождается снижением амплитуды выброса и концентрации ЛГ без изменения характеристик секреции ФСГ [110. Более вероятно, что СТГ обладают модулирующий ролью в потенцировании эффектов гонадотропинов [119].
Безусловно, гормон роста выполняет значимую роль в регуляции репродуктивной функции не только на уровне гипоталамических и гипофизарных структур, но и непосредственно на уровне органов - мишеней - яичников и матки. СТГ стимулируют выработку эстрадиола и прогестерона клетками гранулезы у животных и человека, при этом его действие модифицируется в зависимости от фазы менструального цикла [75, 111, 165]. Гормон роста потенцируют эффекты ФСГ, способствуя активации ранних реакций стероидогенеза посредством повышения локальной секреции IGF-I и, как следствие, продукции прогестерона. В то же время гормон роста ингибируют ФСГ - индуцированную активацию ароматазы и, соответственно, синтез эстрадиола. С большей вероятностью механизм, обеспечивающий возможность реализации антагонистического действия СТГ на стероидогенез, обусловлен увеличением концентрации IGF-I на поздних этапах стероидогенеза с последующей блокадой негативного влияния гормона роста на синтез эстрадиола. Временное разнонаправленное действие гормона роста также подтверждается рядом экспериментов на животных, демонстрирующих модификацию эффектов гормона роста до и после периода полового созревания, а также в ранние утренние часы и в вечернее время [165].
Ввиду расхождений результатов экспериментов in vivo и in vitro, данные о воздействии гормона роста на фолликулогенез противоречивы [182, 195]. Предположительно СТГ играет важную роль в росте и созревании фолликулов. Так, у животных с мутациями рецептора гормона роста наблюдалось увеличение числа примордиальных фолликулов наряду с повышением частоты фолликулярной атрезии и уменьшением вторичных, преантральных и антральных фолликулов. У трансгенных мышей повышенная экспрессия гормона роста сочеталась с усилением фолликулогенеза, увеличением массы яичников, частоты овуляции, что, однако, не приводило к усилению репродуктивного потенциала ввиду выраженных нарушений углеводного обмена [21]. При проведении экспериментов in vitro показано, что у грызунов СТГ усиливает пролиферацию тека - клеток и клеток гранулезы в преантральных фолликулах [164]. Аналогичное влияние гормона роста продемонстрировано в отношении улучшения качества ооцитов человека при проведении протоколов экстракорпорального оплодотворения [22, 66, 81, 117, 206, 224]. По мнению ряда исследователей, СТГ играет роль как в ядерном, так и в цитоплазматическом созревании яйцеклеток человека. Кроме того, увеличение концентрации гормона роста в фолликулярной жидкости ассоциировано с быстрым делением и хорошей морфологией эмбрионов, а также с их высоким имплантационным потенциалом [69]. Полагают, что позитивные эффекты гормона роста реализуются за счёт кумулюсных клеток. В эксперименте у крыс положительное влияние гормона роста регистрировалась только в ооцит -кумулюсных комплексах, но не в случае ооцитов, освобождённых от яйценосного холмика [105].
Рецепторы гормона роста визуализированы в клетках жёлтого тела. У мышей с дефектами рецептора СТГ зафиксировано меньшее количество жёлтых тел [126]. У человека гормон роста стимулирует пролиферацию лютеинизированных клеток гранулезы [171].
В настоящее время все большее внимание уделяется вопросам локальной овариальной секреции гормона роста. У человека иммунореактивность к СТГ отмечена в клетках гранулезы, ооцитах и практически отсутствует в тека - клетках и клетках кумулюса [188]. Выделение мРНК гормона роста только в цитоплазме ооцита и редко в гранулёзных клетках примордиальных фолликулов свидетельствует об инициации экспрессии гена СТГ в период раннего развития фолликулов. В пользу наличия аутокринной овариальной системы гормона роста выступает также факт сочетанной коэкспрессии гена рецептора СТГ [102]. Физиологическое значение яичниковой секреции гормона роста и факторов, ответственных за регуляцию его локальной выработки, является дискуссионным. Некоторыми авторами высказывается предположение о влиянии классических факторов, усиливающих секрецию гормона роста, на основании изучения иммуннореактивности фолликулярной ткани человека по отношению к рилизизинг - гормону и его рецептору, что, тем не менее, не подтвердилось в экспериментах на животных [107, 162]. Под влиянием грелина продемонстрировано стимулирование секреции гормона роста, но отсутствуют данные об усилении его синтеза [178].
Пролиферативный эффект является ведущим компонентом много факторного действия СТГ. У женщин с дефицитом гормона роста отмечаются меньшие размеры матки [108, 196]. Необходимо отметить, что у пациенток с гипогонадотропным гипогонадизмом или пангипопитуитаризмом использование адъювантной терапии СТГ приводит к эстроген-зависимому увеличению размеров матки. Учитывая прямую корреляцию экспрессии мРНК СТГ с эстроген - индуцированной гипертрофией матки [108], логично предположить, что гормон роста выполняет значимую функцию в подготовке эндометрия к имплантации. У мышей с блокадой гена рецептора СТГ наблюдалось меньшее количество сайтов имплантации [126].
Вклад главного медиатора эффектов гормона роста, IGF-I, в реализацию и нейроэндокринный контроль репродуктивной функции в экспериментах in vivo оценить достаточно сложно. Большинство исследователей придерживаются мнения, что регуляторная роль IGF-I реализуются на уровне яичников, при этом отсутствуют значимые исследования, посвященные изучению влияния данного ростового фактора на секрецию гонадотропинов и гонадолиберина. Проведение экспериментов затрудняется тем, что особи с дефектом рецептора IGF-I погибают в ранние сроки после рождения ввиду развития острой дыхательной недостаточности [163]. Общеизвестно, что биодоступность IGF-I определяется количественными характеристиками шести белков, связывающих IGF-I [114]. В случае гиперэкспрессии IGFBP-6 у трансгенных мышей наблюдалось снижение уровня ЛГ [134], а при избытке IGFBP-1 визуализировалась гонадотрофная гиперплазия [185]. Несколько десятилетий назад в эксперименте in vitro было убедительно продемонстрировано влияние IGF-I на секрецию ГнРГ. Показано, что IGF-I обладает способностью активировать промотор гена ГнРГ [183] и стимулирует его выработку при добавлении к нейрональным клеткам линии GT 1 -7 [215].
Клинико-анамнестическая характеристика пациенток с прогнозируемым «слабым» ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами
Средний возраст обследованных женщин составил 37 (34; 39,5) лет. Статистических различий по этому параметру между пациентками основной и группы сравнения I установлено не было (36 (33; 39) и 39 (30; 45) лет, соответственно (U=171, р=0)).
Анализ показателей репродуктивной функции обследованных женщин выявил, что артифициальный аборт в анамнезе наблюдался в 30,67% (23/75) случаев, невынашивание беременности, а именно самопроизвольный аборт и неразвивающаяся беременность до 12 недель, встречались с одинаковой частотой (22,22%, 10/45 и 22,22%, 10/45, соответственно). Медикаментозное прерывание беременности не проводилось. Основную причину неразвивающейся беременности удалось установить в 4 случаях из 10 (25%). При цитогенетическом исследовании абортивного материала были диагностированы следующие хромосомные мутации: полная трисомия по 16 паре хромосом (кариотип абортуса 46XY,+16), полная трисомия по 22 паре хромосом (кариотип абортуса 46XY,+22), полная трисомия по 21 паре хромосом (кариотип абортуса 46ХХ,+21) и триплоидия (кариотип абортуса 69,ХХХ). Следует отметить, что хромосомные нарушения не были наследственно обусловлены и возникли впервые de novo, поскольку при проведении кариотипирования супружеских пар с невынашиванием беременности в анамнезе во всех случаях диагностирован кариотип 46 XX, нормальный женский и кариотип 46 XY, нормальный мужской. Частота выявления эктопической трубной беременности у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами составила 12% (9/75), предыдущие беременности закончились срочными родами в 13,33 % (10/75) случаев.
Сравнительная характеристика репродуктивной функции женщин обследованных групп представлена в таблице 1.
Достоверных различий в показателях репродуктивной функции пациенток сравниваемых групп выявлено не было (таблица 1).
Анализ структуры сопутствующей гинекологической патологии у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами выявил высокую частоту встречаемости нормогонадотропной недостаточности яичников (84%, 63/75). В результате проведенного обследования было установлено, что недостаточность яичников проявлялась хронической ановуляцией у 45 (71,43%) больных, недостаточность желтого тела диагностирована у 18 (28,57%) женщин.
Воспалительные заболевания органов малого таза явились вторыми по частоте в структуре гинекологической патологии у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами (69,33%, 52/75). Необходимо отметить, что данной категории пациентов проводились неоднократные курсы антибактериальной, противовоспалительной и иммуномодулирующей терапии. Встречаемость инфекций, передающихся половым путем, в анамнезе представлена на рисунке 5. Анализ анамнестических данных выявил, что наличие гидросальпинкса явилось причиной удаления маточных труб у 16 (30,77%) обследованных женщин, органосохраняющие и реконструктивно-пластические операции на маточных трубах были выполнены в 14 (26,92%) случаях.
Генитальный эндометриоз представлял третье по частоте гинекологическое заболевание у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами (56%, 42/75). В большинстве случаев распространенность наружного генитального эндометриоза соответствовала III - IV степени (42,86%, 18/31). Стоит отметить, что комбинированную терапию, включающую хирургическое лечение с последующим назначением агонистов ГнРГ или диеногеста в течение 4-6 месяцев, получали лишь 19 (61,29%) больных.
Сравнительная структура гинекологических заболеваний женщин обследованных групп представлена в таблице 2.
Достоверных различий в структуре гинекологических заболеваний женщин сравниваемых групп выявлено не было (таблица 2).
Оперативные вмешательства на органах малого таза имелись в анамнезе у всех женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами, причем в 25,33% (19/75) случаев данной категории пациентов были выполнены повторные лапароскопии. Сравнительная структура оперативных вмешательств на органах малого таза у женщин обследованных групп представлена в таблице 3.
Достоверных различий в характеристике оперативных вмешательств на органах малого таза у женщин сравниваемых групп выявлено не было.
Анализ структуры объемов хирургических вмешательств у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами выявил высокую частоту проведения резекции яичников по поводу функциональных кист и доброкачественных образований (41,33%, 31/75). Рецидивирующее течение наружного генитального эндометриоза с образованием эндометриоидных кист в 58,06 % случаев явилось причиной резекции яичников (рисунок 6).
В результате гистероскопического исследования полости матки с последующим гистологическим и/или иммуногистохимическим исследованием полученного материала была выявлена высокая частота патологических изменений эндометрия у женщин с прогнозируемым слабым ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами (43/75, 57,33%). Лидирующее место в структуре патологии эндометрия занимали гиперпластические процессы эндометрия (25/43, 58,14%), также с высокой частотой диагностировался хронический эндометрит (14/43, 32,56%). Результаты гистологического исследования эндометрия представлены в таблице 4.
Результаты корреляционного анализа взаимосвязи клинико-лабораторных показателей и исходов протоколов ЭКО
Результаты корреляционного анализа клинико-лабораторных данных и особенностей этапов протокола ЭКО представлена в таблице 15 и 16.
Результативность программ ЭКО во многом зависит от овариального ответа на гонадотропную стимуляцию. Уровень ФСГ на 2 - 3 день спонтанного менструального цикла рассматривается в качестве достаточно надежного предиктора реакции яичников на индукторы овуляции. Отмечена значительная положительная корреляционная связь между концентрацией ФСГ и такими показателями стимуляции яичников в программе ЭКО, как суммарная и эффективная доза гонадотропинов, длительность стимуляции. Необходимо подчеркнуть, что получена отрицательная взаимосвязь между уровнем IGF-I в сыворотке крови на 2 - 3 день менструального цикла и эффективной дозой гонадотропинов. Кроме того, концентрация IGF-I в фолликулярной жидкости отрицательно коррелировала с суммарной и эффективной дозой гонадотропинов, а также длительностью стимуляции.
Не подлежит сомнению, что получение большого числа ооцитов в программе ЭКО является одним из факторов, который позволяет отобрать для переноса наилучшие по качеству эмбрионы. Проведенный корреляционный анализ показал наличие отрицательной взаимосвязи между уровнем ФСГ и количеством полученных ооцит-кумулюсных комплексов, ооцитов на стадии мейоза II (МП), двупронуклеарных (2р) зигот и морфологически качественных эмбрионов на 3-й день культивирования. Кроме того, отмечена положительная корреляционная связь между концентрацией АМГ и количеством ооцитов на стадии мейоза II (МП), морфологически качественных эмбрионов на 3-й день культивирования, уровнем IGF-I в сыворотке крови на 2 - 3 день менструального цикла и количеством полученных ооцит-кумулюсных комплексов.
Таким образом, проведенный анализ результатов, позволяет рассматривать уровень IGF-I в сыворотке крови в качестве практически значимого критерия для прогнозирования характера ответа яичников на гонадотропную стимуляцию. В пользу данной гипотезы свидетельствует наличие значимых корреляционных взаимосвязей между уровнем ФСГ, АМГ и концентрацией СТГ, IGFBP-3 в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в день проведения ТВП. В рамках полученных результатов представляет большой интерес анализ ассоциации лабораторных данных и особенностей этапов протокола ЭКО в условиях адъювантной терапии СТГ.
Получена обратная зависимость между увеличением концентрации СТГ в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в день ТВП в ходе овариальной стимуляции и уровнем ФСГ (гамма=- 0,37, р=0,046), а также эффективной дозой гонадотропинов (R=-0,55, р=0,03). Характеризуя связь между качеством переносимых эмбрионов и вероятностью наступления беременности, следует отметить, что в условиях адьювантной терапии СТГ в программе ЭКО установлена прямая зависимость между увеличением концентрации IGF-I в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в день ТВП и количеством полученных ооцитов (R=0,52, р=0,039), эмбрионов класса A (R=0,57, р=0,02; гамма=0,56, р=0,026). Кроме того, выявлена ассоциация между снижением активности IGFBP-3 в фолликулярной жидкости и количеством полученных ооцитов (R=0,58, р=0,0017) , двупронуклеарных зигот (R=0,66, р=0,005) и морфологически качественных эмбрионов (R=0,62, р=0,01).
Разработка математической модели для прогнозирования эффективности программ ЭКО у пациенток со «слабым» ответом яичников на стимуляцию
С целью выявления критериев, обладающих максимальной прогностической значимостью в отношении исходов программ ЭКО у женщин со «слабым» ответом яичников на гонадотропную стимуляцию, проведен логистический регрессионный анализ.
Формирование комплекса потенциальных предикторов наступления беременности было основано на определении статистически значимой взаимосвязи между признаками, приведенными в таблице 17.
В результате использования много факторной логистической регрессии была получена регрессионная функция в виде уравнения:
где р - вероятность наступления беременности в программе ЭКО,
X - адъювантная терапии СТГ в программе ЭКО (терапия проводилась - код составляющей 1; терапия не проводилась - код составляющей 0),
ФСГ - концентрация ФСГ в сыворотке крови на 2 - 3 день спонтанного менструального цикла,
АМГ - концентрация АМГ в сыворотке крови на 2 - 3 день спонтанного менструального цикла.
Значения р 0,5, полученные при использовании данной математической модели, прогнозируют высокую вероятность наступления беременности после проведения программы ЭКО; значения р 0,5 являются предиктором неблагоприятного исхода программы ЭКО.
На основании полученных данных была построена кривая ROC (рисунок 7). Величина площади под кривой (AUC) составила 0,838542 (95%ДИ: 0,75027 0,926813), что свидетельствует о высокой точности прогнозирования результатов при использовании данной математической модели.
Высокая чувствительность (83,33%) и специфичность (85,72%) предложенной математической модели позволяет использовать ее для решения вопроса о целесообразности преодоления бесплодия в программах ВРТ с использованием донорских ооцитов среди женщин старшего репродуктивного возраста с прогнозируемым «слабым» ответом яичников на гонадотропную стимуляцию.