Экспериментальное и теоретическое обоснование системы краткосрочных тестов на цитотоксичность малорастворимых промышленных пылей для их гигиенической оценки Шарапова, Надежда Евгеньевна

Введение к работе

Актуальность темы. Промышленная пыль является одним из самых распространенных вредных факторов производственной среды, и пневмокониозы, пылевые заболевания легких, занимают ведущее место в структуре профессиональных заболеваний (Лебедева Н.В., 1986). Несмотря на значительные успехи в развитии технических мер пылеподавления, опасность возникновения новых случаев профессиональных заболеваний от действия пыли не устранена в ряде отраслей промышленности, в т.ч. и в высоко развитых промышленных странах (Fraumeni J.F., Foreward Д.,1986), что наносит значительный экономический и социальный ущерб обществу. Поэтому наряду с поиском эффективных методов борьбы с пылеобразованием и методов биологической профилактики пылевых, заболеваний легких, актуальное значение сохраняют задачи прогнозирования вредного действия на организм промышленных аэрозолей, образующихся при технологических процессах, и регламентации их допустимого содержания в воздухе рабочей зоны. Решение этих задач не должно отставать от освоения новых месторождений ископаемых, внедрения в производство новых материалов .

Для целей гигиенической характеристики промышленных пылей по-прежнему широко используются хронические экспериментальные исследования, но такие эксперименты требуют больших временных и материальных затрат, что делает актуальным создание набора адекватных краткосрочных тестов "in vivo" и "in vitro".

Способность пыли вызывать повреждение макрофага, независимо от механизмов такого повреждения, принято называть ее цитотоксичностью. Эту характеристику оценивают в различных кратковременных тестах, что связано с господствующими представлениями о ключевой роли повреждения пылевыми частицами макрофагов в патогенезе силикоза и других пнев-мокониозов (Величковский Б.Т., Кацнельсон Б.А., 1964; Ве-личковский Б.Т.,1980; Кацнельсон Б.А. и соавт.,1995) . Используются также тесты, основанные на регистрации феноменов активации макрофага или на том или ином сочетании этих явлений. Однако трактовка результатов тестирования и их использование для прогнозирования действия пыли на организм часто проводятся без учета роли процессов активации и

повреждения макрофага как в механизмах, лежащих в основе теста, так и в патогенезе пневмокониозов. .

Недостаточно учитывается в такой трактовке и то, что кинетические характеристики накопления пыли в легких, являющегося обязательным условием развития 'пневмокониоза, также зависят от её цитотоксичности для легочных макрофагов .

При этом совершенно не развиты подходы к использованию показателей цитотоксичности для прогнозирования способности пылевых, частиц к их накоплению в легких, что делает использование указанных тестов недостаточно полным.

Большинство исследований ограничивается использованием какого-либо^ одного из известных тестов на цитотоксичность. Однако едва- ли может быть назван краткосрочный метод, предпочтительный для всех случаев, поскольку каждый ускоренный тест имеет свои достоинства и недостатки. Следовательно, для повышения надежности скрининга возникает необходимость создания и использования минимальной, но достаточной батареи тестов. В связи с этим необходимы поиск новых информативных тестов, а также развитие теоретических основ их использования, уточнение показаний к применению тех или иных тестов, их ограничений, сравнительная оценка информативности отдельных тестов.

Не изучено, в какой мере соответствует сравнительная оценка цитотоксичности, полученная на крысиных клетках, сравнительной'цитотоксичности тех же пылей для клеток человека. ' Выяснение этого вопроса необходимо для обоснования экстраполяции на человека выводов о сравнительной цитотоксичности разных пылей, которые получены при тестировании на клетках крысы.

Для всех тестов на цитотоксичность пылей "in vitro", наряду с их общими,достоинствами (быстрота, дешевизна и т.д.), характерен и общий недостаток, связанный с существенными отличиями культуральных сред от того микроокружения, в котором происходит взаимодействие макрофага и пылевых частиц "in vivo". Широко используемый способ оценки цитотоксичности по клеточному составу бронхо-альвеолярного лаважа, полученного после интратрахеального введения малых доз пыли, с оценкой числа нейтрофилов и отношения нейтро-филы:альвеолярные макрофаги, дает возможность получения более объективных результатов, но лишь в тех случаях, ко-

гда экспериментальные животные не подвержены скрытым воспалительным изменениям в легких. Такие воспалительные изменения нередко становятся причиной искаженных показателей, из-за чего страдает надежность метода. Таким образом, возникает необходимость разработки других методов оценки цитотоксичности "in vivo".

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось углубление теоретических основ и расширение возможности тестирования цитотоксичности малорастворимых пылевых частиц для прогнозирования их пневмокониозоопасности и ускорения гигиенической оценки, а также регламентации новых пылеобразующих материалов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1. Разработать новые тесты на цитотоксичность пыли "in vitro" на основе изменения способности макрофагов к адгезии и активности 5'-нуклеотидазы, а также сопоставить их данные с результатами оценки цитотоксичности тех же пылей на основе снижения жизнеспособности в тесте с трипановым синим.

2. Исследовать соотношение процессов повреждения и активации макрофага в культуре макрофагов и причинно-следственную связь между этими эффектами на примере .тех же тестов.

3. Разработать новый тест на цитотоксичность пылей "in vivo", основанный на количественной оценке реакции перито-неального фагоцитоза, и оценить его информативность .

4. Обосновать прогноз сравнительной способности к накоплению пыли в легких и лимфоузлах по данным оценки их сравнительной цитотоксичности с использованием математической модели кинетики накопления пыли и результатов хронических ингаляционных экспериментов.

5. Сопоставить ранговую оценку цитотоксичности разных пылей, полученную на крысиных и человеческих клетках.

6. Оценить информативность батареи краткосрочных тестов при сопоставлении показателей сравнительной цитотоксичности некоторых групп промышленных пылей с результатами хронических экспериментов и использовать этот экспериментальный материал для их гигиенической регламентации.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований :

- впервые с применением математической модели кинетики накопления пыли в легких и лимфоузлах показана возможность использования показателей цитотоксичности разных пылей для прогнозирования количественных различий этого накопления и интенсивности пневмокониотических изменений;

разработан и апробирован новый способ оценки цито-токсического действия пылей на культуру макрофагов по снижению активности 5¹-нуклеотидазы, показана высокая информативность этого метода, признанного изобретением;

выявлена зависимость' показателей реакции перитонэ-ального фагоцитоза от дозы и цитотоксичности пыли, тем самым впервые показана перспективность его использования в качестве теста на сравнительную цитотоксичность "in vivo";

продемонстрировано совпадение ранговой оценки цитотоксичности разных пылей, полученной на человеческих и крысиных клетках;

обнаружено, что стишовит, одна из модификаций кремнезема, существенно более цитотоксичен, чем силикозогеннзл кварцитная пыль, и не может считаться биологически инертным .

Основные положения, выносимые на защиту:

7. Повреждающее действие пылевой частицы на макрофаг (цитотоксичность) является ключевым свойством, определяющим вероятность длительной задержки этой частицы в легочной ткани и в ткани легочно-ассоциированных лимфоузлов и интенсивность их ответной реакции.

8. Эффекты повреждения и активации макрофага, наблюдаемые в культуре макрофагов при инкубации с пьшєеьіми частицами, оказывают различное влияние на показатели цитотоксичности в тестах "in vitro", причем активация имеет по преимуществу вторичное происхождение по отношению к повреждению макрофагов.

9. Для получения надежных прогнозов кониозоопасности пьши необходимо применять батарею краткосрочных тестов. В составе такой батареи информативным и адекватным является новый тест по оценке активности 5'-нуклеотидазы.

10. Культура крысиных перитонеальных макрофагов является адекватным тест-объектом для целей сравнительной оценки цитотоксичности "in vitro".

11. Ранговые порядки цитотоксичности и фиброгенности в пределах группы пылей, родственных по физико-химическим

характеристикам, в большинстве случаев соответствуют друг другу, что подтверждает важное значение тестирования цито-токсичности для обоснования ПДК малорастворимых промышленных аэрозолей.

Практическая значимость работы заключается в разработке методических подходов по ускоренной гигиенической оценке и регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей .

Материалы проведенных исследований использованы при разработке:

1. методических рекомендаций "Использование клеточных систем "ин витро" и "ин виво" для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей" ( утверждены 21.02.95 г. ГК Санэпиднадзора РФ, №01-19/24-17);

2. ПДК в воздухе рабочей зоны для четырех групп пыле-образующих материалов:

- фторидов редкоземельных металлов (утверждено Поста
новлением N'4 Госкомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993
г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88);

пыли стекла и стеклянных строительных материалов (утверждено Постановлением №4 Госкомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993 г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88 ) ;

пыли молотого угольного шлака и стройматериалов на его основе /шлакозит/ (утверждено Постановлением №12 от 20 октября 1993 г., дополнение №9 к перечню ПДК №4617-88);

дунита и изготавливающихся на его основе магнезиаль-но-силикатных (форстеритозых) изделий (утверждено Постановлением N4 Госкомсанэпиднадзора России от 18 марта 1993 г., дополнение №8 к перечню ПДК №4617-88).

3) патента на изобретение "Способ определения цитоток-
сичности малорастворимых пылей"( № 2019832 от 15.09.94
г.) .

Методика по оценке активности 5'-нуклеотидазы применяется в научных и практических целях (Справка №09/106 МНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий г.Екатеринбурга от 05.04.96.; Справка №01/3-119 Областного Центра санитарно-эпидемиологического надзора Свердловской области от 04.04.96.).

Апробация диссертации. Материалы исследований докладывались и обсуждались на конференциях МНЦ профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий г.Екатеринбурга (14.06.90г., 22.11.90г., 05.12.91 г., 16.04.92г., 30.09.93г., 12.05.95 г.), 7-ом Всероссийском съезде гигиенистов и сан. врачей (Ростов-на-Дону, 1991г.), международном симпозиуме "Проблемы токсикологии и прикладной экологии" (Москва-Пермь, 1991г.), 2-ом Международном симпозиуме "Silica, Silicosis and Cancer" (San Francisco, California, USA, 1993), Всероссийской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" ( Санкт-Петербург, 21-23 ноября 1995г.), межотдельческой конференции в Московском НИИ гигиены им.ф.ф.Эрисмана (31.05.96 г.) .

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных публикаций, 4 из них - в зарубежных научных журналах.

Структура и объем диссертации.