Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Интенсивная химизация различных областей хозяйственной деятельности, расширение ассортимента и значительное увеличение объема производства химической промышленности в последние десятилетия диктуют необходимость усиления научных и технических разработок, направленных на предотвращение неблагоприятного действия веществ, загрязняющих окружающую среду.
Трудами многих гигиенистов и токсикологов создана научно обоснованная поэтапная система предупредительных мер, призванная предотвратить неблагоприятное действие вредных веществ на организм человека. Важную роль при этом играют гигиенические нормативы ШДК, ОБУВ и т.д.), величины которых устанавливаются на основе результатов строго регламентированных экспериментальных исследований. Однако число утвержденных в настоящее время нормативов значительно отстает от требований народного хозяйства. При потребности в комплексной токсикометрии до 1000 соединений в год, реально выполняются исследования около 100 веществ Ш.В.Саноцкий, 1988). Такое отставание возможно устранить либо путем резкого увеличения объема научных исследований, проводимых с целью гигиенического регламентирования, либо путем разработки ускоренных методов нормирования. Наиболее перслективныл, особенно с экономической точки зрения, является второй путь. Однако сокращение программы исследований не должно сказываться на надежности разработанных нормативов. Одной из рациональных возможностей повышения надежности прогнозирования гигиенических регламентов по результатам краткосрочных экспериментов является введение в схему исследований новых мето- дических подходов, основанных на достижениях современной науки по изучению фундаментальных реакций наиболее значимых структур организма.
Актуальность исследований по указанной проблеме отражена в решениях 1-го Всесоюзного съезда токсикологов (IS86) и Всесоюзной научной конференции по ускоренным методам санитарно-гигиенического норлирования вредных веществ в воздухе рабочей зоны (1988).
Успехи последних десятилетий по изучению структуры и функций биологических мембран позволяют считать, что реакции клеток и тканей на внешние воздействия в значительной степени зависят от состояния клеточной поверхности, которая является не только важным структурным элементом, но и универсальным регулятором существенных проявлений жизнедеятельности клеток - проницаемости, межкле-
точных взаимодействий, устойчивости к повреждающим воздействиям и т.д. (Ю.А.Владимиров, Г.Е.Добрецов, 1980; А.А.Болдырев, I9B6; А.Ф.Блюгар, А,Я.Майоре, I98G; С.В.Конев, 1967). Использование информации о состоянии клеточных мембран при изучении механизмов вредного' действия химических вещоств начато сравнлтельно недавно и принесло ряд вачсных результатов (А.А.Покровский, 1976; А.Ф.Ешо-гер, А.Я.Майоре, В.К.Залцмане, І98І; С.Н.Голиков, И.Ь.Саиоцкий, Л.А.Тиунов, 1986). Проводится поиск новых подходов для применения мембранных тестов при определении пороговых уровней воздействия (Г.А.Красовский и др., 1989).
Важную роль в реакции эпителиальных тканей играют контактные взаимодействия эпителиоцитов, осуществляемые с помощью специализированных мембранных ультраструктур: щелевых, плотных и простых соединений, дэсмосом и ион слипания. Исследование структуры и функций межклеточных соединений является в настоящее время одним из наиболее успешно развиваемых разделов момбранологии в ведущих научных странах мира. Однако информации о состоянии этих структур . не используется в токсикологических исследованиях и особенно при гигиеническом регламентировании содержания вредных веществ в объектах, окружающей среды.
Несоответствие уровня использования информации о состоянии контактных поверхностей клеток при гигиеническом нормировании вредных химических соединений важности контактных взаимодействий в формировании реакции ткани обусловлено, по нашему мнению, следующими причинами:
не разработаны достаточно чувствительные количественные методы оценки состояния отдельных ультраструктур поверхностных мембран;
не известны закономерности реагирования межклеточных соединений в зависимости от уровня и продолжительности экспозиции при воздействии вредных химических веществ на организм;
не проведена оценка гигиенической значимости реакций ультраструктур межклеточных контактов при воздействии промипленных веществ и возможности использования этих реакций при регламентировании.
ЦШ> К ЗЩ.Ш ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось выяснение закономерностей контактных взаимодействий поверхностных мембран гопатоцитов в норме и их реакций при действии промышленных веществ В ЗаВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЭКСДОЗУ.ЦЕИ,
выявление наиболее гигиенически значимых изменений ультраструктур контактных поверхностей и разработка на этой основе модели прогнозирования безопасных уровней содержания химических веществ в воздухе рабочей зоны.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие
задачи: 0^
X. Отработать систему адекватных методических п^^одов для изучения свойств отдельных ультраструктур контактных поверхностей гепатоцитов,
-
Изучить свойства ультраструктур контактных поверхностей ґепатоцитов в норме.
-
Разработать концептуальную модель контактной поверхности клетки.
-
Изучить закономерности реагирования контактных поверхностей гепатоцитов в зависимости от уровня и продолжительности экспозиции ^химических веществ с известным характером действия.
-
Исследовать токсичность, опасность и характер действия ряда новых цромышлешшх веществ с учетом реакции поверхностных мембран гепатоцитов с целью гигиенического нормирования их содержания в воздухе рабочей зоны.
-
Разработать модель прогнозирования безопасных уровней содержания промышленных веществ в воздухе рабочей зоны на основе регистрации нарушений контактных взаимодействий поверхностей гепатоцитов.
концептуальная модель контактной поверхности гепатоцита-как целостной механической системы (модель основана на собственных результатах по изучению механических свойств межклеточных соединений и анализе современных сведений о структуре и функциях ультраструктур клеточной поверхности);
доказательство существования универсальной реакции контактных поверхностей гепатоцитов при воздействии химических веществ, отличительными особенностями которой являются зависимость уровня реакции от интенсивности воздействия и различная чувствительность отдельных ультраструктур поверхности;
научное обоснование способа ускоренного гигиенического нормирования промышленных химических веществ, основанного на оценке реакции контактных поверхностей гепатоцитов при однократном воздействии.
МУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. С помощью разработанных методов впервые изучены механические свойства ультраструктур поверхностей гепатоцитов. Анализ данных литературы и собственных исследований позволил разработать новую концептуальную модель контактной поверхности гепатоцита, по которой ультраструктуры межклеточного контакта с помощью подмембранных микрофилаїлент объединены в целостную механическую систему. Точками отсчета в этой системе являются десмосомы, жестко связанные с цитоскелетом. Наиболее механически подвижными являются плазматическая мембрана в области простого соединения и щелевые соединения, наименее лабильны десмосомы. Межклеточные соединения распределены в ряд по возрастанию адгезионной прочности. Поверхность гепатоцита обладает свойствами текучести и'упругости.
Изучение влияния ряда модельных химических веществ (четырех-хлористый углерод, ашшловый спирт, трихлорэтилен, стирол, конка-навалин А, фенобарбитал и др.) на поверхность гепатоцита позволило выявить универсальную реакцию контактной поверхности гепатоцита, основными особенностями которой являются рост числа ультра-структур, вовлеченных в ответ'ткани на воздействие, с увеличением интенсивности экспозиции и различная чувствительность межклеточных соединений. Наиболее функционально лабильными являются низкоадгезивные участки простого соединения, менее чувствительны высс-коадгезивные участки, недифференцированная часть простого соединения и десмосомы. Наиболее устойчивы к воздействию химических веществ щелевые соединения, зоны слипания и плотные соединения. Установлен минимальный уровень ответной реакции ультраструктур поверхности клетки, позволяющей оценивать величину порога вредного действия веществ на печень. Наибольшую гигиеническую значимость имеют изменения контактных взаимодействий мембран в области простых соединений.
Получены регрессионные уравнения, связывающие величину порога острого' действия, установленного по реакции поверхности гепатоцита, со значением гигиенического норматива (ПДК). Предложен способ прогнозирования ПДК в воздухе рабочей зоны для веществ, обладающих избирательным действием на печень. Способ основан не оценке реакции контактной поверхности гепатоцита при однократном ингаляционном воздействии.
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. І. В результате проведенных исследований обоснованы 8 ПДК и І СБУВ для химических веществ в воздухе ра-
бочей зоны (3-аллия-3-этил-4~кетс-5(1 -аюталдигадроханслгден-4 --этклидвн)-4' .б'-даїїзнил-тіазсл'шіотиазолоцканинзтилсульфат (сєн-сисилнзатор С2); к,д' -бас-(тркизт;иі)-2,5-двметім-п-ксилилендиач-ионнй хлорид (ТЗДК); диаллиловый эфир пзсфталевой кислоты (ДЗІО); яд' - ыетялен-бЕс(в -Шіалсульфс-іі/^шропиокамид) (І.ІВСП); І,3-ди-метил-5(3' -ucЕілаирратаднншіздеп-2 '-зммядє.ч) -ютідозслидинткон--(2)-СН (4) (сенсибилизатор СІ); дитозилат-3,3'(і",2'-бис(зтокси) эгилен-бие СІ-зтил-2-^лвтпл-5-2лорбензалидазолляІ.(активатор); гяд-рохсиламин сернокислый, оксид кальция, цинк углекислый основной).
-
Результаты по изучению свойств ультраструктур контактной поверхности гепатсцита отрьзены в коллективной монограф'/.ч "Структура и функции межклеточных контактов" под общей редакцией В.И. Архиленко к А.Г.ііалаякова (Хаев, "Здоров'я", IS82).
-
Получены 2 авторских свидетельства и 2 полсзито-ьных решения по заявкам на изобретения.
-
Разработанные подход к исследованию влияния химических ве-щестз на поверхностную мембрану гепатоцитов послужил основой для введения в '"Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зона" Ш., IS65) сценки состояния мембран гепатоцитов при определении ОБУЗ гепатотоксических веществ. '
-
Материалы, полученные в работе, использувтея в курсах гистологии, патологической анатомии и урологии при обучении студентов Днепропетровского медицинского института.
ЇЇУБИІКА1ЇІЙ. По теме диссертации опубликовано 45 работ в -vyp-налах, сборниках, монографій, а также в материалах съездов и конференций.
АПР0БЩЇЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБСШ. Материалы диссертации доложены и обсуздеяы на: 9-і: Ііе-дународком съезде геронтологов (Киев, 1972); 6-м Всесоюзной съезде АГЭ (Ташкент, 1974); 6-й Украинской Республиканской конференции АГЭ (Тернополь, 1075); 2-й Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Таллинн, 1979); Первой Всесоюзной школе по морфематрип (Днепропетровск, IS84); 1-м и 2-м съездах АГЭ УССР (Винница, 1^50, Полтава, 1985); 10-м Всесоюзном съезде АГЭ (Зиннща, ISS6); Первом Всесоюзном съезде токсикологов (Ростов-на-Дону, ISS6); Всесоюзной конференции "Регуляция тканевого гомеостаза" (Тбилиси, 1387); Всесоюзной конференции "Ускорешше метода санитарно-гигиенического норлироваиил вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (Ереван, 1988); заседаниях Днепропетровске-
го областного общества токсикологов (I987-I99I); на секции "Про-мипленная токсикология" Всесоюзной Проблемной Комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии" (IS84-I99I).
Апробация диссертационной работы проведена на объединенном заседании областных обществ токсикологов, анатомов, гистологов и шбриологов, кафедр медико-биологической физики, гистологии, анатомии человека, оперативной хирургии и топографической анатомии, биологии, общей гигиены и ЦНИИ Днепропетровского медицинского института 27 декабря 1991 года.
0П7КГУРА и ОБЪЕМ. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, указателя литературы и приложений.
Диссертация изложена на 451 страницах машинописи, иллюстрирована 59 таблицами, 54 рисунками и 56 приложениями.-Указатель литературы содержит 543 источника, в том числе 237 отечественных в- 306 иностранных.
ШЕШЛЫ, МЕТОДЫ И ОЕКШ ИСОЩОВАНИЙ. Для решения поставленных задач проведены исследования ультраструктуры поверхностей гепатоцитов в норме, при воздействии 10 модельных веществ, изучены токсичность, опасность и характер вредного действия 9 внедряемых в промышленность веществ с учетом реакции контактных поверхностей гепатоцитов.
Исследования проведены на 7320 белых крысах:, 850 мылах, 420 морских свинках и 35 кроликах. Животных содержали в виварии Днепропетровского медицинского института на стандартном пищевом рационе.
Изучение вредного действия веществ проводили при различных путях поступления в организм экспериментальных животных - ингаляции, введение в желудок, аппликации на кожу и слизистые оболочки глаз в соответствии с "Методическими указаниями к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов в воздухе рабочей зоны? (* 2163-80).
Состояние животных после ингаляционного воздействия оценивали с помощью интегральных тестов и показателей, отражающих состояние важнейших органов и систем. Б качестве интегральных показателей использовали: массу животішх, двигательную активность в открытой поле, спонтанную и модифицированную двигательную активность в актографе, норковый рефлекс, работоспособность, скорость потребления кислорода, силу пищевого ре^ялсса и суммационно-пороговый показатель.
-.7 -
Силу пищевого рефлекса, оцениваемую по времени побежки, реакции, открывания двери и количеству сшибок, двигательную активность в актографе, скорость потребления кислорода и работоспособность определяли с помощью разработанной совместно с А.П.Королевым автоматизированной систем "Политест". Поведенческие реакции исследовали в соответствии с "Методическими рекомендациями по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования" 0? 2166-80). Суммационно-порогс— вый показатель определяли по методу И.З.Сперанского CIS65).
для оценки состояния сердечно-сосудистой системы .записывали электрокардиограммы с помощью энцефалографа и определяли систоле— ческий показатель по Л.В.Чернобай (I98Q), частоту сердечных сокращений п величины интервалов PQ, QS, qt, ев.
Частоту дыхания, качественный и количественный состав смывов с верхніх дыхательных путей и легких использовали для оценки состояния дыхательной системы в соответствии с "іівтодпчвскташ указаниями к постановке исследовании по изучению раздражающих свойств и оооснованию предельно допустимых концентраций избирательно дейс-твусяих раздракакш'-х вєшеств в воздухе рабочей зопы" (JS 2153-ЬО).
При хронических ингаляциях определяли гемоглобин, число эритроцитов к леіжощітоз периферической крови, осмотическую резистентность эритроцитов U.A.Базарова, 1382; ЇІ.К.Иванов, Ф.И.Комаров,. Б.&.Коровкин и др., Is75).
Функциональное состояние печени оценивали с помощью гпшгуро-боі; пробы, характеризующей детоксикационную функцию, и определения активности специфически: и неспецифических ферментов в сыворотке крови: фруктозомокофосфатальдолазы (ША), аланик- и аспартатам»-нотраноферазы (AjIT, ACT;, лактатдегідрогенази ЦДГ) и щелочной фос;атазы Ші; Б.Г.Колб, В.С.КамьшникоБ, 1976).
для оценки мочевкыообразовательной функции печени и водо-, соле- и азотовкдзлительной функции почек определяли концентрации мочевины в крови *. моче, клиренс мочевины, суточный диурез, экскрецию белка и хлоридов СїІ.И.Иванов, Ф.И.Комаров, В.Ф.Коровкин и др., 1975; К.М.І'рахтєнбзрг, Л.А.Тимофиавская, И.Я.Квятковская, 1987).
Изучение свойств ультраструктур поверхности геиатоцита проведали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. 1'кани фиксировали путем погрукения кусочков печени в раствор глутарового альдегида или с помощью перфузии органа раствором фиксатора при
_ 8 -
низкой (10-15 мм рт.ст.) и повышенном давлении (45-50 да рт.ст.) по разработанной нами методике (В.Ф.Ушаков, 1982). Кусочки печени постфшссировали четырехохисыо осмия, контрастировали уранилацета-том, обезвоживали в этиловом спирте и заключали в зпонаралдитную смесь. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме УЫТП-3. Срезы дополнительно контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе аШ-100 АК.
При электронномикроскопическом исследовании измеряли линейные размеры ультраструктур клеточной поверхности с помощью морфо-метрической сетки, нанесенной на лшинисцентный экран микроскопа. Определяли длины высокоадгезивных (ВАУ), низкоадгезивных (НАУ) участков и недифференцированной части (НПО) простого соединения, зоны слипания (ЗС), щелевого (ЩЗ) и плотного соединений (ПлС); подсчитывали количество Ш, ВАУ, НАУ, ШС и десмосом (Д), приходящихся на 10 мкы сечения контакта, расположенного между синусо-идным капилляром и желчным канальцем. Для оценки распределения межклеточных соединении на контактной поверхности гепатоцита измеряли расстояния между серединами ВАУ, НАУ, НДС, Д и зоной слипания. Измерения проводили на 20 сечениях контактов у кавдого животного.
деформируемость клеточной поверхности определяли по разработанной нами методике (В.Ф.Ушаков, С.Д.Крамарь, Д.А.Балпенко, Н.П. Гршаа, 1986) путем подсчета количества тест-точек планиметрической сетки, приходящихся на впячивания поверхности. Впячивания образуются при повышенном внутриорганном давлении на васкулярной и контактной частях поверхности гепатоцита. Измерения проводили на полутонких срезах, окрашенных метиленовим синим и основным фуксином, в 6 полях зрения (объектив 40, окуляр 10).
В конце хронического эксперимента и после восстановительного периода сотрудниками нашей лаборатории Д.А.Палиенко и Н.П.Гришой. выполнены гистологические исследования легких, печени, селезенки, почки и сердца в соответствии с "Методическими рекомендациями к проведению морфологических исследований при экспериментальном обосновании гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (2939-83).
Статистическую обработку результатов измерении проводила по программам, составленным для микроЭШ электроника UK-SI и МК-54. Расчет уравнений регрессии выполне:: на ЗШ іви рс/ат zsitboh.