Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературных данных по оценки комбинированной токсичности и её соотношение с практикой оценки многофакторных рисков и гигиенического нормирования .17
Резюме 26
Глава 2. Материалы и методы исследования 27
2.1. Биологические объекты исследований 27
2.2. Воздействующие токсичные вещества 29
2.3. Дизайн экспериментов 33
2.4. Математический анализ экспериментальных данных 40
Резюме 42
Глава 3. Экспериментальная характеристика и математическое описание типов двухфакторного комбинированного действия растворимых химических соединений токсичных элементов 43
3.1 Комбинированная интоксикация бихроматом калия и хлоридом никеля..44
3.2 Комбинированная интоксикация хлоридом марганца и хлоридом никеля.54
3.3. Комбинированная интоксикация бихроматом калия и хлоридом марганца 62
3.4 Экспериментальные данные к проблеме так называемого сочетанного действия химического и физического вредных факторов 73
Резюме 83
Глава 4. Особенности экспериментальной характеристики и математического описания типов двухфакторной комбинированной токсичности металлооксидных наночастиц 85
4.1. Реакция лёгких на однократное комбинированное интратрахеальное воздействие наночастиц 86
4.2. Реакция организма на комбинированное субхроническое парентеральное воздействие наночастиц 96
4.3. К оценке информативности данных, получаемых при оценке сравнительной и комбинированной цитотоксичности металло-оксидных наночастиц in vitro 165
Резюме 185
Глава 5. Обоснование и экспериментальная апробация подходов к характеристике трёхфакторной комбинированной токсичности 187
5.1. Теоретические предпосылки и сущность предлагаемой методологии 187
5.2. Экспериментальная апробация предложенной методологии 192
5.3. Некоторые практические аспекты оценки многофакторной комбинированной токсичности 239
Резюме 242
Глава 6. Разработка и апробация способов повышения устойчивости организма к комбинированной токсичности металлов 243
6.1. Цель и теоретические предпосылки проведенных исследований 243
6.2. Экспериментальные данные 252
6.3. Перспективы практического использования результатов экспериментальной биопрофилактики 284
Резюме 286
Заключение 287
Общие выводы 311
Список использованной литературы 314
Приложение 345
- Обзор литературных данных по оценки комбинированной токсичности и её соотношение с практикой оценки многофакторных рисков и гигиенического нормирования
- Экспериментальные данные к проблеме так называемого сочетанного действия химического и физического вредных факторов
- К оценке информативности данных, получаемых при оценке сравнительной и комбинированной цитотоксичности металло-оксидных наночастиц in vitro
- Экспериментальные данные
Обзор литературных данных по оценки комбинированной токсичности и её соотношение с практикой оценки многофакторных рисков и гигиенического нормирования
Комбинированные (многофакторные) токсические экспозиции, связанные с многокомпонентным химическим загрязнением воздуха рабочей зоны во многих производствах, атмосферного воздуха населённых мест и других сегментов среды обитания, несомненно преобладают над однофакторными (Кацнельсон Б.А., 2002; Жолдакова З.И., 2012). Именно это определило давний и не снижающийся интерес к проблеме комбинированной токсичности (КТ) со стороны профилактической токсикологии, которая одновременно является и одним из направлений общей токсикологии (Курляндский Б.А., 2002), и важной составляющей частью научной гигиены, и одной из основ методологии оценки риска и санитарной практики. Наряду с частными задачами, решаемыми во многих экспериментально-токсикологических исследованиях, занимающемся комбинированной токсичностью на протяжении нескольких десятилетий (Кацнельсон Б.А., 1986; Давыдова В.И., 1988; Давыдова В.И., 1989; Балезин С.Л., 1989; Кацнельсон Б.А., 1990) вся проблема КТ в целом возникла и продолжает оживлённо обсуждаться в литературе как отражение такой реальной ситуации. Однако, как показывает анализ литературы, проблема эта, несмотря на опубликованное на протяжении десятков лет немалое число обобщающих работ, ей посвящённых (Левина Э.Н., 1963; Кустов В.В., 1975; Толоконцев Н.А., 1976; Нагорный П.А., 1984; Сова P.E. 1984; Кацнельсон Б.А., 1986; Федоренко В.И., 1987; Кацнельсон Б.А., 1990; Кацнельсон Б.А., 1993; Каган Ю.С.,1996; Groten J.P., 2001; Кацнельсон Б.А., 2002; Cиницкая Т.А., 2005; Мамонов Р.А., 2010; Ракитский В.Н., 2012; Жолдакова З.И., 2013), всё ещё далека не только от разрешения, но даже от единообразного понимания.
Важным недостатком литературы по проблеме КТ является то, что большинство частных исследований, опубликованных к началу нашей работы, были проведены в отношении острой токсичности, которая оценивалась одним (например, летальным) эффектом (Mowat F.S., 2002; Jingjing Dou., 2014), а оценке полисистемной хронической или хотя бы субхронической КТ по большому числу показателей было посвящено лишь небольшое число работ, причём их результаты редко подвергались адекватному математическому моделированию. Одним из типичных примеров этого может служить работа Yuan G. (2014), исследовавших комбинированную токсичность свинца и кадмия при остром и при субхроническом пероральном воздействии. Авторы оценили острую токсичность этой комбинации как «практически аддитивную», но не дали никакой оценки типа комбинированной субхронической токсичности. Примерно то же самое приходится сказать и о работе Т.И. Герасименко (1996) по комбинированной парентеральной токсичности свинца и цинка, в которой только острая, но не субхроническая КТ была подвергнута математическому анализу. Поэтому имеющиеся в литературе обобщения недостаточны в качестве теоретической основы для прогнозирования комбинированного действия имеющих основное значение в рамках профилактической токсикологии умеренных и даже слабых воздействий, угрожающих развитием хронических интоксикаций, для которых характерны полисистемность и взаимообусловленность эффектов. То, что при этом типы КТ могут быть не одинаковыми по отношению к разным эффектам, выявляется практически всегда, когда этот аспект проблемы исследуется (ASTDR, 2004), но таких исследований всё ещё мало, их теоретическое обобщение недостаточно, а практические выводы из них (в том числе в свете задач санитарного нормирования и оценки риска) не ясны. В качестве сравнительно недавнего примера можно привести работу Rai A. (2010), которые хотя и изучили в действительно хроническом эксперименте с использованием большого числа показателей комбинированную токсичность свинца, кадмия и мышьяка, но свой вывод о её синергетическом характере не обосновали никаким математическим анализом.
Однако наиболее важной неопределённостью проблемы КТ является априорный характер основных теоретических постулатов и противоречивость основных понятий, сжатое представление которых и является целью данной главы нашей диссертации.
В международной токсикологической литературе в качестве основного обозначения типа КТ обычно используется термин «аддитивность» (т.е. способность к сложению), а отклонения от этого типа, обозначаются терминами «синергизм» (синоним: «потенцирование») и «антагонизм».
Вместе с тем, смысл, вкладываемый разными авторами и разными международными документами (Loewe S., 1953; Berenbaum M.C., 1985; Timbrell J., 2000; Groten J.P., 2001; Yeh P.J., 2006; Box G.R.P., 2007; Goldoni M.A., 2007; IPCS, 2009; Myers R.H, 2009; SCHER, 2012; Howard G.J., 2013) даже в основное понятие «аддитивность», различен в зависимости от явного или подразумеваемого предпочтения определённых теоретических представлений, которые складываются на базе двух основных парадигм.
Первая парадигма принимает, что существует особый класс КТ, при которой определённый эффект разных веществ, входящих в комбинацию, обусловлен разными биологическими точками приложения и/или разными механизмами токсического действия. Поэтому эффект каждого вещества, входящего в комбинацию, может развиваться якобы независимо от одновременного развития того же самого эффекта других веществ, её составляющих, так что суммарный эффект комбинированного действия оказывается равным сумме всех эффектов изолированного действии этих веществ - так называемая «аддитивность эффектов». При этом каждый такой изолированный эффект пропорционален дозе конкретного вещества с независимым от других коэффициентом пропорциональности (регрессии). При наличии же некоторого явного или скрытого взаимовлияния эффектов комбинируемых веществ суммарный эффект может оказаться выше или ниже указанной суммы эффектов на определённую величину, зависящую от этого взаимовлияния.
Принимая эту парадигму, приходится допустить, что в целостном организме с его многочисленными прямыми и обратными связями разного уровня при хроническом действии даже всего двух ядов возможны полное несовпадение всех точек приложения этого действия и полная независимость всех вызываемых ими и оцениваемых в эксперименте эффектов токсического действия. Натянутость такого допущения представляется самоочевидной, но в известной нам литературе, как правило, обходится молчанием.
Особые сложности толкования понятия «аддитивность эффектов» возникают тогда, когда речь идёт об эффектах, по которым действие комбинируемых веществ является противоположно направленным. В этом случае алгебраическое суммирование двух эффектов означает арифметическое вычитание одного из другого, то есть формальная аддитивность КТ оказывается токсикологическим антагонизмом. Таким образом, эта терминология является однозначной только для характеристики КТ по однонаправленным1 эффектам. В более общем случае некоторое уточнение в неё может внести различение между «явным антагонизмом» (под которым предлагается понимать разнонаправленность действия двух токсичных веществ по тому или иному эффекту) и «скрытым антагонизмом», который проявляется антагонизмом однонаправленных эффектов. Явный антагонизм иногда называют функциональным (Timbrell J., 2000). В целом, однако разнонаправленность как особый и важный феномен комбинированного токсического действия упоминается крайне редко и анализируется ещё реже. Интересно, что подобное же положение отмечалось (во всяком случае несколько лет тому назад) в родственной по отношению к токсикологии науке, какой является фармакология: “interestingly, little or no attention has been given to active drugs that individually produce effects in the opposite direction” (Tallarida R.J., 2001).
Вторая распространённая в токсикологической литературе парадигма КТ принимает, что два или более веществ, входящих в комбинацию, имеют одну и ту же точку приложения и один и тот же механизм действия, отличающегося только по силе. Иными словами, они действуют, как действовало бы одно и то же вещество в разных дозах. Основной тип КТ в рамках этой парадигмы также называется аддитивностью, но (в отличие от рассмотренной выше «аддитивности эффектов») обозначается как «аддитивность доз», или «гомоаддититвность», или как «аддитивность Лёве» по имени автора, впервые ещё в 20-х годах ХХ века сформулировавшего рассматриваемую парадигму (Loewe S., 1953).
Экспериментальные данные к проблеме так называемого сочетанного действия химического и физического вредных факторов
В отечественной гигиенической терминологии довольно давно стихийно сложилось, хотя и не является официальным, различение понятий «комбинированное действие вредных веществ», под которым подразумевается одновременное или последовательное действие на организм нескольких веществ при одном и том же пути поступления; «комплексное действие вредных веществ», когда они поступают в организм одновременно, но разными путями, и «сочетанное действие» – одновременное или последовательное воздействие на организм факторов различной природы (химических, физических, биологических). Эта терминология не является международной не только потому, что слово «сочетание» переводится на европейские языки как combination (англ.), combinaison (фр.), Kombination (нем.), combinazione (итал.) и т.п., так что термины «комбинированное» и «сочетанное» действие в адекватном переводе с русского на эти языки неизбежно совпадают. К тому же, похожей классификации не находится в зарубежной научной литературе и, например, характерное для алюминиевой промышленности сочетание вредных факторов химической (фториды, ПАУ) и физической природы (магнитные поля) давно было описано как комбинированное вредное действие (Langauer-Lewowicka H., 1983).
Главное, однако, не в этих языковых барьерах, а в том, оправдано ли теоретически такое разграничение тем, что существуют принципиальные различия между рассматриваемыми вариантами двухфакторных вредных экспозиций. Анализ авторитетной научной токсикологической литературы (Кустов В.В., 1975; Толоконцев Н.А., 1976; Кацнельсон Б.А., 2002; Timbrell J., 2000) создаёт твёрдое впечатление, что механизмы комбинированной токсичности меньше всего связываются с химическим взаимодействием ядов в месте поступления (хотя в некоторых случаях и оно играет роль), но значительно больше – с прямым и опосредованным взаимовлиянием сложных и многоуровневых механизмов, контролирующих их токсикокинетику и токсикодинамику.
С этой точки зрения, ни совпадение или несовпадение путей введения ядов, ни одновременность или последовательность их воздействия, хотя вероятно и важны, но едва ли могут играть ключевую роль и служить существенными классификационными критериями. В то же время, ответы организма, в особенности интегральные на действие вредных факторов химической и физической природы имеют очень много общего. Поэтому логично было бы предположить, что механизмы «сочетанного» и «комбинированного» вредного действия могут и не различаться настолько радикально, чтобы оправдать отнесение их к двум принципиально разным классам явлений.
Проведен анализ результатов экспериментального исследования, в котором рассматривался типичный случай «сочетанного» воздействия токсичного химического элемента фтора (в форме фторида натрия) и физического агента (постоянного магнитного поля – ПМП). Практическое значение именно этого сочетания связано с тем, что его воздействию подвергается большое число рабочих, занятых в электролитическом производстве алюминия (Langauer-Lewowicka H.., 1983; Валова Г.А., 1993; Kvande H., 2014), но оно интересовало прежде всего, как пример, важный в методическом и теоретическом отношении. Именно поэтому и общий дизайн эксперимента по плану 22 (непосредственно осуществлённого Н.А. Цепиловым4), и способ математического моделирования эффектов двухфакторного вредного действия были те же самые, что и в выше рассмотренных исследованиях по комбинированной бинарной токсичности.
В обширной литературе, включающей некоторые обзорные документы (Health Protection Agency……, 2008; SCENIHR, 2015), посвящённые полисистемному действию на организм, как правило, сильных ПМП, предлагается большое число первично физических, а также биологически опосредованных механизмов, с которыми может оно быть связано. Однако экспериментальные данные, подтверждающие соответствующие эффекты этого действия, довольно противоречивы. Ещё менее надёжно что-либо известно о вредных эффектах слабых постоянных магнитных полей (Stolfa S., 2007; Marquez-Gamino S., 2008; Akdag M.Z., 2010; Cunha C., 2012; SCENIHR, 2015) и почти ничего – о комбинированном/сочетанном действии таких полей и токсических веществ. Впрочем, согласно мета-анализу литературных данных (Juutilainen J., 2006) ПМП, вероятнее всего, усиливает действие химических канцерогенов.
Что же касается фтора, то его токсическое действие исследовалось и обобщалось в огромном числе работ (Ream L.J., 1981; Bely M., 1997; Shanthakumari D. 2007), относящихся как к клинике профессионального или эндемического флюороза, так и к его экспериментальному моделированию (IPCS, 2002; Кацнельсон Б.А., 2006).
Эксперимент был проведен на аутбредных белых крысах-самках, по 15 особей в каждой группе. В трёх группах создавалась субхроническая фторидная интоксикация повторными в/б инъекциями 0,5 мл раствора NaF в разовой дозе 3.19 мг F/кг, эквивалентной 0,1 ЛД50, 3 раза в неделю на протяжении 6 недель; ещё три группы параллельно получали такие же инъекции физ. раствора. На протяжении тех же 6 недель по две группы из числа получавших и не получавших токсическое воздействие подвергались по 5 раз в неделю 2- или 4-часовому воздействию ПМП с напряжённостью 25±0,05 мТл на всё тело в специально сконструированной установке соленоидного типа. Удвоение времени разовой экспозиции рассматривается как эквивалент удвоения дозы магнитной энергии.
После завершения эксперимента проводили определение показателей состояния организма, представленных в таблице 3.9.
Как и в вышеописанных токсикологических экспериментах статистическая значимость различий между средне-групповыми показателями оценивалась по t-тесту Стьюдента, а для математического моделирования «сочетанного» действия ПМП и фторида был использован метод построения поверхности отклика.
Как видно из таблицы 3.9, статистически значимые сдвиги по сравнению с контрольными величинами получены по 13 оцененным показателям при действии одного фторида, только по одному при действии меньшей дозы ПМП, но по 17 – при действии большей дозы ПМП, в то время как при сочетании этих же доз ПМП с фторидом – соответственно, по 9 и 11. Как эти сдвиги, так и те, по которым статистическая значимость была недостаточной, для многих показателей оказались при действии ПМП и фторида однонаправленными (например, увеличение СПП, снижение числа заглядываний в «норки», снижение относительной массы печени, увеличение содержания билирубина в сыворотке, числа эритроцитов и гематокрита, гранулоцито-моноцитарный лейкоцитоз и др.), но по некоторым другим – противоположными (например, относительная масса селезёнки была значимо увеличена при действии фторида, не изменена при действии меньшей и значимо снижена при действии большей дозы ПМП). Оба фактора вызвали увеличение коэффициента фрагментации ДНК в клетках костного мозга (в случае ПМП – дозозависимое), но только фторид – в циркулирующих ядерных клетках крови. Отметим, что ДНК-фрагментирующее действие ПМП недавно показано «in vitro» (Teodori L., 2014). Заметное и статистически значимое увеличение концентрации фтора в моче (равной в контроле 0,21±0,01 мкг/мл) было выявлено уже при первом измерении и сохранялось до конца эксперимента, но только в группах, получавших NаF обособленно (1,58±0,28 мкг/мл) или в сочетании с ПМП в меньшей (1,73±0,24 мкг/мл) или большей дозировке (1,38±0,28 мкг/мл). Это позволяет рассматривать любые сдвиги показателей в первой подопытной группе по сравнению с контрольной как признаки развивающейся фтористой интоксикации5. Однако практически, ни один из них не является для неё специфичным, как видно хотя бы из вышеприведенного сопоставления с группами, получавшими только ПМП. Следует подчеркнуть, что и этот фактор, несмотря на относительно низкий уровень и малую длительность воздействия, оказался безусловно действующим на организм, хотя, в основном, и столь же не специфично.
Как и при анализе результатов субхронических экспериментов с несколькими бинарными комбинациями токсических веществ, выявлена неоднозначность типа сочетанного/комбинированного действия. Некоторые примеры этой неоднотипности сочетанного действия ПМП и фторида иллюстрируются изоболами на рис. 3.7, и достаточно сравнить их с приведенными выше примерами изобол комбинированной токсичности двух химических веществ, чтобы убедиться в их принципиальном единообразии.
К оценке информативности данных, получаемых при оценке сравнительной и комбинированной цитотоксичности металло-оксидных наночастиц in vitro
Предпосылки к проведению исследования. Как показывает анализ литературы, подавляющее большинство экспериментальных исследований в области нанотоксикологии металлов было проведено на клеточных культурах, и хотя авторами некоторых обзоров (Frhlich Е., 2013) подчёркивалась особая важность и крайний недостаток экспериментов «in vivo», за последние годы это положение изменилось не очень существенно.
Известны только единичные работы, в которых одной и той же лабораторией исследовалась токсичность каких-либо конкретных наночастиц на основе обоих подходов, т.е. и «in vitro», и «in vivo». Так, Horie М. (2011) продемонстрировал развитие под влиянием наночастиц оксида никеля острого оксидативного стресса как на стабильной линии человеческих клеток А549 (рак лёгких), так и на крысах при однократном интратрахеальном введении, получив взаимно не противоречащие результаты. Chen Q. (2013) исследовал изменения клеток печени крыс после однократного внутривенного введения наночастиц SiO2, а в эксперименте на клеточных культурах выявили патогенетическую роль вызванной этими НЧ активации клеток Купфера. Ghosh М. (2016) нашел взаимно подтверждающую оценку роли оксидативного стресса в развитии цито-генотоксических эффектов наночастиц ZnO на культуре мононуклеарных клеток человеческой крови и в острых внутрибрюшинных экспериментaх на белых мышах.
Единственное исследование комбинированного цитотоксического действия практически не растворимых частиц, однако не нанометрового, а микрометрового размера было проведено Приваловой Л.И. ещё около 30 лет тому назад, но только в 2016 году полученные в нём результаты с дополнительным математическим анализом были впервые опубликованы (Privalova L.I., 2016). Важной особенностью этой работы является то, что одни и те же два вещества (а именно микрочастицы диоксида марганца и хромата бария) одним и тем же экспериментатором были исследованы как «in vivo» (в интратрахеальном тесте с большим числом цитологических показателей), так и «in vitro» на первичной культуре крысиных перитонеальных макрофагов по включению красителя трипановый синий, служащему показателем потери жизнеспособности. Интересно отметить, что цитотоксическое действие изученных микрочастиц по этому показателю было антагонизмом, а из всех цитологических показателей БАЛЖ преимущественно антагонизмом оно было как раз по проценту явно дегенерированных альвеолярных макрофагов.
Других экспериментов с комбинированным действием каких-либо частиц на какие-либо клетки «in vitro» не встречалось.
Одновременно ставилась задача подтвердить или снять некоторые методические сомнения, связанные с использованием подхода «in vitro» для моделирования цитотоксичности металло-оксидных наночастиц (МеО-НЧ).
В литературе можно найти немало исследований, проведенных на различных стабильных клеточных линиях при воздействии на них наночастиц оксида никеля (Pietrushka J.R., 2011; Ahamed M., 2013; Duan W.X., 2015), оксидов марганца (Hussain S.M., 2006; Choi J.Y., 2010; Ivask A., 2015; Khan S., 2016; Alafiri S., 2017) или железо (Mahmoudi M.S., 2011) и направленных, главным образом на изучение молекулярных механизмов цитотоксичности этих НЧ. Однако ни сравнительная количественная оценка их цитотоксичности, ни эффекты их комбинированного действия в этих работах не рассматривались. Первая публикация, посвящённая оценке комбинированного действия каких-либо наночастиц на клетки «in vitro», появилась в 2018 году работа Dvilo-Grana A., который исследовал влияние наночастиц Al2O3, CeO2, TiO2 и Y2O3 на цитотоксичность наночастиц ZnO2 для клеток стабильной человеческой линии лейкемических Т-лимфоцитов.
Этот автор не проводил математический анализ комбинированной токсичности, но трактует свои экспериментальные данные как свидетельствующий о возможности как синергизма, так и антагонизма.
Важнейшим условием правильной токсикологической интерпретации показателей повреждения клеток наночастицами «in vitro», является понимание того, что происходит с самими МеО-НЧ под влиянием культуральной среды за время инкубации. Анализ приведенных выше и многих других опубликованных нанотоксикологических исследований «in vitro» свидетельствует о том, что этому аспекту должное внимание уделяется крайне редко. Между тем, можно было предположить, что в условиях экспериментов «in vitro» происходят такие изменения наночастиц, которые едва ли имеют место «in vivo», но могут существенно исказить цитотоксический эффект «in vitro» (прежде всего, существенная внеклеточная агрегация). С другой стороны, было неясно, происходит ли в среде инкубации то частичное растворение МеО-НЧ, не растворимых в водной суспензии, которому придаётся существенная роль в токсикокинетике и токсикодинамике интоксикаций, вызываемых ими «in vivo» (раздел 4.2), и как этот процесс зависит от состава культуральной среды. Именно эти вопросы имелись в виду выше, когда в качестве одной из предпосылок нашей работы были указаны «некоторые методические сомнения, связанные с использованием подхода «in vitro» для моделирования цитотоксичности металло-оксидных наночастиц».
Поэтому представляется целесообразным начать не с тех результатов, которые были получены на клетках, а с тех, которые характеризуют судьбу изученных МеО-НЧ при их инкубации в соответствующих средах.
Как уже указывалось выше, все изученные Ме-НЧ, будучи практически не растворимыми в де-ионизированной воде, а иногда и в физиологическом растворе, обладают заметной и при том не одинаковой растворимостью при добавлении к ней эмбриональной бычьей сыворотки или супернатанта БАЛЖ. Кинетика такого растворения обычно может быть адекватно аппроксимирована экспоненциальной функцией (например, в отношении наночастиц Fe2O3 – см. Sutunkova M.P., 2016), что вероятнее всего, объясняется первоначальным относительно быстрым растворением мельчайших НЧ, приводящим к постепенному снижению удельной поверхности остающейся нано-суспензии. Соответствующие различия растворимости «in vivo», характеризующие наночастицы, разные по размеру или по химическому составу, естественно отражаются различиями их токсикокинетики, что, в частности, показано и при сопоставлении эффектов действия наночастиц NiO и Mn3O4 на органо-системном уровне (раздел 4.2). Всё это придаёт особое значение вопросу о том, воспроизводятся ли указанные закономерности в экспериментальных моделях цитотоксичности тех же МеО-НЧ «in vitro».
Экспериментальные данные
Задачей исследований было оценить возможность повышения устойчивости организма к комбинированному действию растворимых солей марганца, никеля и хрома, токсическое действие которых было описано в главе 3, а также различных комбинацией наночастиц оксидов марганца и никеля, меди -свинца-цинка и титана-алюминия-кремния, описанных в главах 4 и 5. Отметим, что если до этих исследований экспериментальные БПК при комбинированных интоксикациях, вызванных растворимыми солями в модельных бинарных сочетаниях, уже были испытаны в отношении свинца и кадмия (Киреева Е.П., 2006) или свинца и фтора (Katsnelson B.A., 2012; Кацнельсон Б.А., 2012), то зашита от тройной комбинации солей и от какой бы то ни было комбинации металлосодержащих наночастиц испытана впервые.
Как видно из данных, приведенных в главе 5 (таблица 5.1) и частично воспроизведенных в таблице 6.1, по некоторым показателям состояния организма крыс, которым повторно вводилась комбинация солей без биопротекции, отмечены статистически, как правило, недостаточно значимые, но согласующиеся между собой неблагоприятные отличия от величин контрольной группы. Так, о токсическом действии металлов на печень говорят небольшое нарушение её белково-образовательной функции (снижение содержание общего белка и альбуминов в крови при сниженном индексе А/Г), небольшое повышение сывороточной активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и коэффициента де Ритиса, а также содержания в ней церулоплазмина и билирубина; о токсическом действии на почки –увеличение их массы, суточного диуреза и содержания белка в моче. Снижение числа заглядываний в «норки» при укорочении суммационно-порогового показателя (СПП) может свидетельствовать о нарушении баланса между возбуждением и торможением в ЦНС. Имеются признаки анемии (небольшое снижение как содержания гемоглобина, так и числа эритроцитов в крови при сниженном цветовом показателе).
Парадоксальным эффектом оказалось не просто отсутствие угнетения общего уровня окислительно-восстановительного метаболизма, обычно отражаемое снижением активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови, но даже противоположная тенденция к статистически не значимому повышению этого показателя.
При таком вялом развитии интоксикации на системно-организменном уровне особое значение имеет проявление генотоксичности исследованной комбинации, сказавшейся резким и статистически значимым повышением коэффициента фрагментации геномной ДНК ядросодержащих клеток крови (глава 5). Важно отметить, что этот эффект вполне ожидаем, учитывая давно и хорошо доказанную генотоксичность хрома и никеля, которой соответствует их доказанная канцерогенность не только для лабораторных животных, но и для человека (IARC, 1990; IPCS, 1988; IPCS, 1991; IPCS, 2013).
Как это обычно бывает в сравнительно-токсикологических экспериментах такого дизайна, при малой выраженности токсического эффекта трудно доказательно выявить его снижение под влиянием того или иного биопротектора. Поэтому не удивительно, что статистически значимое различие между группами «Комбинация металлов» и «Комбинация металлов+БПК» найдено только по двум токсикодинамическим показателям. Активность щелочной фосфатазы, лишь слегка сниженная в первой, была существенно повышенной во второй, и то же самое обнаруживается при сравнении групп по активности гамма-глютамилтранспептидазы. Нельзя не отметить, что по обоим показателям заметное, хотя и статистически не значимое повышение по сравнению с контрольными величинами вызвало воздействие одного БПК. Такое же благоприятное влияние БПК оказал на креатининовый клиренс, т.е. на фильтрационную способность почек, которая и оказалась наиболее высокой в группе «Комбинация металлов+БПК». Несколько уменьшилось вызванное интоксикацией повышение массы почек и содержания белка в моче. Объём суточной мочи (диурез), напротив, слегка и не значимо увеличился дополнительно, что наблюдалось в подобных экспериментах нередко и могло быть объяснено давно установленным увеличением объёма жидкости, выпиваемой крысой в виде раствора глутамината натрия по сравнении с питьевой водой в контрольной группе. В данном эксперименте, однако, диурез в группе, получавшей только БПК, повышен не был.
Статистически не значимо, но согласованно улучшились упомянутые выше показатели состояния печени. Можно отметить также тенденцию к улучшению состояния ЦНС (нормализация СПП и приближение к контрольному числа заглядываний в «норки»). Вместе с тем, состояние красной крови не улучшилось (более того, снижение числа эритроцитов оказалось статистически значимым только в группе «Комбинация металлов +БПК»).
Важно отметить то, что сам по себе этот БПК не вызвал ни одного статистически значимого сдвига относительно контрольных показателей состояния организма.
Данные о задержке металлов в органах приведены в таблице 6.2.
Учитывая хорошо известный риск поражения ЦНС при экспозиции электросварщиков к подобной комбинации токсичных элементов, наибольший интерес представляют данные по головному мозгу. Они свидетельствуют о том, что в результате затравки в нём статистически значимо увеличилось содержание марганца (почти в два раза по сравнению с контрольным уровнем) и особенно никеля (почти в 10 раз), но совершенно не повысилось содержание хрома. Низкий тропизм хрома к мозговой ткани хорошо известен (Barcelloux D.G., 1999). Совершенно естественно, что на содержание этого металла в мозгу затравка не повлияла и на фоне БПК, однако важно подчеркнуть, что на этом фоне было менее высоким накопление в мозгу более «нейротропных» марганца и никеля (хотя и по этим металлам отличие от группы, подвергавшейся затравке без БПК, не было статистически значимым).
В печени содержание всех трёх металлов оказалось статистически значимо и примерно в равной степени повышенным по сравнению с контрольными показателями. У крыс, подвергавшихся затравке на фоне действия БПК, содержание никеля в этом органе было несколько более высоким (на 9,8%), но это повышение статистически совершенно не значимо. Недостаточно статистически значимым является и снижение на 9,1 % содержания марганца. Единственным статистически значимым различием между группами, подвергавшимися затравке комбинацией металлов без БПК или на фоне БПК, является сниженная в 1,28 раза печёночная задержка хрома.
В селезёнке, в которой незначительное накопление марганца при затравке без БПК по сравнению с контролем не было статистически значимым, и не изменилось на фоне действия БПК. Однако для хрома, задержка которого в этом органе при затравке без БПК была наиболее существенной (10-кратной по сравнению с контролем), эффект БПК был несомненно положительным и резко выраженным: 3-кратное снижение по сравнению группой, получавшей комбинацию металлов без БПК.
Накопление никеля в селезенке по сравнению с контролем было в 4,4 раза выше, на фоне действия БПК содержание никеля оставалось на том же уровне.
Наконец, следует отметить, что БПК оказывает влияние того или иного знака и на фоновое содержание металлов в органах. Наиболее однозначно это относится к содержанию никеля, которое при сравнении групп «БПК» и «Контроль» оказывается существенно и статистически значимо более высоким в первой. Казалось бы, токсикокинетические процессы, от которых зависит распределение в организме металла, попавшего в кровь, из пищи, воды и воздуха, в принципе те же, что и при парентеральном введении сублетальных токсических доз после всасывания их в кровь из первичного депо (в частности, из брюшной полости). Однако для каждого из тех металлов, которые являются эссенциальными микроэлементами (а к ним относятся и хром (МРПТХВ, 68), и никель (МРПТХВ, 58), и марганец (МРПТХВ, 25)) в организме, вероятнее всего, существуют свои гомеостатические механизмы, которые могут быть отличными от токсикокинетических, и поэтому направленность влияния БПК на те и другие не обязательно совпадает.
В отличие от столь неопределённой, хотя в целом и имеющей место эффективности испытанного БПК по токсикодинамическим и ещё менее ясной – по токсикокинетическим показателям, представленный в нижней строке таблицы 6.1 генотоксический эффект комбинации металлов был на фоне действия этого же БПК явно и статистически значимо ослаблен (до уровня, значимо ниже контрольного). Поскольку сам по себе БПК практически никакого влияния на фрагментацию ДНК крыс не оказал, речь идёт о действительном ослаблении генотоксичности - особо опасного эффекта токсичной комбинации и позволяет прогнозировать ослабление её канцерогенного эффекта. К этому результату внимание будет возвращено, рассматривая аналогичный защитный эффект в отношении комбинированной генотоксичности металооксидных наночастиц.