Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Цитодифференцировка клеток 9
1.2. Эпителий хрусталика как объект исследования 18
1.3. Политенные хромосомы как объект исследования 22
1.4. Биофизические аспекты стимуляции инфракрасным излучением 29
Глава 2. Материал и методика 53
2.1. Методы исследования воздействия низкоэнергетического инфракрасного излучения на высшие водные растения 53
2.1.1. Ряска малая 53
2.1.2. Элодея канадская 55
2.2. Методы исследования эмбрионального развития рыб при воздействии инфракрасным лазерным излучением 58
2.2.1. Суматранский барбус 60
2.2.2. Данио-рерио 61
2.3. Методы изучения воздействия НИЛИ на митотическую активность эпителия хрусталика травяной лягушки 63
2.4. Методы изучения воздействия НИЛИ на дифференциальную активность генов 68
Глава 3. Результаты и обсуждение 72
3.1. Рост высших водных растений при стимуляции инфракрасным излучением 72
3.1.1. Ряска малая 72
3.1.2. Элодея канадская 74
3.2. Воздействие ИК- излучения на эмбриогенез рыб 77
3.2.1. Барбус суматранский 77
3.2.2. Данио-рерио 78
3.3. Экспериментальное изучение механизмов низкоинтенсивной лазерной стимуляции хрусталика 81
3.4. Изменение дифференциальной активности генов при действии НИЛИ 83
Заключение 89
Выводы 93
Литература 94
- Эпителий хрусталика как объект исследования
- Биофизические аспекты стимуляции инфракрасным излучением
- Методы исследования эмбрионального развития рыб при воздействии инфракрасным лазерным излучением
- Воздействие ИК- излучения на эмбриогенез рыб
Введение к работе
Одной из основных проблем в рыбной отрасли и в гидробиологии является сохранение и воспроизводство гидробионтов - объектов разведения и промысла. Усиливающееся антропогенное воздействие на водоемы резко снижает их продуктивность и популяционный состав.
В данной работе основное внимание уделяется такому вопросу, как влияние низкоинтенсивного импульсного инфракрасного излучения на рост и развитие гидробионтов. Общеизвестно, что травматизация органов и тканей у животных приводит в одних случаях к стимуляции пролиферации, в других случаях к её ингибированию. Применение низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) может привести также к ускорению процессов роста и цитодифференцировки, что важно в практическом отношении, особенно для объектов аквакультуры. Однако действие лазерного излучения на гидробионтов исследовано не достаточно полно - под его влиянием могут происходить изменения на клеточном уровне, которые могут далее перейти на более высокие уровни организации живой материи (Попов и др., 1997). Эти изменения могут быть как положительными, так и отрицательными, поэтому необходимо определить такие параметры воздействия НИЛИ как: длина волны, частота импульса излучения, продолжительность облучения, с помощью которых задается плотность потока мощности (облученность) и плотность потока энергии (доза).
В процессе наших исследований изучался онтогенез ряда гидробионтов под воздействием импульсного инфракрасного лазерного излучения в экспериментальных условиях. Изучаемые нами объекты тестирования, принадлежали к различным трофическим уровням биоценоза, и признаны одними из наиболее перспективных для изучения процессов роста и цитодифференцировки. Кроме того, исследуемые объекты подбирались таким образом, чтобы исследовать влияние НИЛИ на различные уровни организации живой материи: субклеточный, клеточный и организменный. Для этого изучалось воздействие инфракрасного лазерного излучения на пролиферацию клеток в монослойном эпителии хрусталика травяной лягушки, дифференциальную активность генов в политенных хромосомах хирономид, а также воздействие излучения на рост и развитие гидробионтов, в нашем случае на высшие водные растения и на рыб.
В настоящее время появляется все больше научных работ, связанных с воздействием инфракрасного лазерного излучения на процессы эмбрионального развития, клеточной пролиферации и регенерации тканей (Владимиров, 1999; Попов и др., 1997).
В представленной работе также оцениваются результаты проведенных исследований по интенсификации процессов роста и развития пресноводных биологических объектов при использовании низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения.
В качестве тест-объектов для исследования воздействия низкоинтенсивного инфракрасного когерентного (лазерного) излучения (НИЛИ) на рост и размножение были выбраны некоторые представители пресноводнго биоценоза, относящиеся к различному систематическому положению. Исследовались: высшие водные растения - элодея канадская Elodea canadensis и ряска малая Ьетпа minor, личинки хирономид Chironomus plumosus, рыбы Barbus tetrazona tetrazona, Brachydanio rerio и амфибии Rana temporaria.
У элодеи канадской исследовалось действие НИЛИ на скорость прироста побегов и корней в сравнении с ростом контрольных растений. На ряске малой изучалось воздействие облучения на динамику численности.
Для оценки влияния инфракрасного излучения на представителей членистоногих мы использовали политенные хромосомы из слюнных желез хирономид. При этом оценивались дифференциальная активность генов, степень политении и пуффинг хромосом, а также их изменения после облучения.
У барбуса суматранского и данио-рерио нами исследовался эмбриогенез после воздействия НИЛИ. При этом на первых этапах эмбриогенеза можно следить за дроблением оплодотворенной икры, а на более поздних, за процессами клеточной дифференцировки у эмбрионов рыб в условиях энергетической стимуляции.
У травяной лягушки исследования велись на эпителии хрусталика глаза - удобном объекте для изучения митотической активности клеток (Бородин, Симаков, 2000).
Хрусталик позвоночных животных представляет собой уникальное образование, метаболизм и морфологическое строение которого отличается от любого другого органа (Гудвин, 1979).
Во-первых, рост хрусталика не приостанавливается почти всю жизнь. По мере его роста старые клетки не отторгаются, а дифференцируются в волокна, на которые новыми пластами наслаиваются молодые волокна хрусталика. Поэтому в экваториальной части хрусталика происходит постоянная дифференцировка новых волокон. Во-вторых, хрусталик не содержит нервов и кровеносных сосудов, что делает этот объект похожим на чистую культуру клеток (Кауфман, 1990).
Цель настоящей работы - изучение влияния НИЛИ (Х,=890 нм) на рост, клеточную пролиферацию и размножение гидробионтов различного систематического уровня.
Для выполнения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на скорость роста побегов элодеи канадской Elodea canadensis.
Изучить влияние низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на динамику численности ряски малой Lemna minor.
Выявить воздействие низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения с различной частотой импульса на выживаемость икры рыб семейства карповых Cyprinidae.
Провести исследования по влиянию низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на митотическую активность эпителия интактного и травмированного хрусталика травяной лягушки Rana temporaria.
Исследовать степень политении и пуффинг политенных хромосом из слюнных желез Chironomns plumosus после низкоинтенсивного инфракрасного лазерного облучения. Научная новизна данной работы заключается в том, что исследуется действие низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на процессы роста и цитодифференцировки гидробионтов различного систематического уровня.
Показано стимулирующее действие низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития у ряда гидробионтов.
Исследовано влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на такие генетические процессы в политенных хромосомах, как дифференциальная активность генов, степень политении и пуффинг хромосом под влиянием облучения.
Разработаны методы стимуляции икры рыб с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения с целью повышения ее выживаемости.
Практическое значение. Предлагается новый способ стимуляции роста и развития гидробионтов за счет использования низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения. Помимо этого найдена возможность ускорения регенерации эпителия хрусталика после травматизации, что поможет бороться с образованием травматических катаракт у рыб. Применение низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения при инкубировании икры, способствует ее выживаемости, и дает дополнительную возможность увеличения производительности инкубационных цехов рыбзаводов. Материалы диссертации могут также использоваться в учебном процессе при подготовке студентов по специальностям «Водные биоресурсы и аквакультура» и «Биоэкология» при прохождении таких курсов как: эмбриология рыб, гидробиология, биофизика.
Эпителий хрусталика как объект исследования
Для изучения воздействия НИЛИ на дифференцировку клеток необходимо было найти удобные объекты исследования. Одним из таких объектов может быть эпителий хрусталика глаза гидробионтов.
Эпителий хрусталика глаза является одной из наиболее удобных систем для изучения митотической активности клеток. Преимущества этой системы и некоторые результаты, полученные при ее исследовании, рассмотрены в статье Клэйтона (Clayton, 1970).
Эпителий хрусталика позвоночных животных представляет собой монослой клеток с различной степенью дифференцировки. Эпителиальные клетки в хрусталике взрослого животного располагаются только под передней полусферой капсулы хрусталика от переднего полюса вплоть до экватора. По характеру дифференцировки клеток в эпителии хрусталика можно выделить три зоны (Гексли, Бер, 1936; Bloemendal, 1977). Центральная зона, наибольшая по площади, простирается от переднего полюса хрусталика почти до экватора. Центральная зона представлена преимущественно плоскими эпителиальными клетками неправильной формы. Возле экватора находится герминативная (ростовая) зона, в которой обнаруживается большинство делящихся клеток. В экваториальной зоне эпителиальные клетки приобретают шестиугольную форму и выстраиваются рядами. Непосредственно на экваторе клетки поворачиваются на 90, удлиняются в сторону полюсов и дифференцируются в новые волокна хрусталика (Mann, 1949; Гирберт, 1993). В хрусталике на протяжении всей жизни откладываются новые волокна благодаря медленной пролиферации клеток эпителия (Дашевский, 1956; Balinsky, 1970; Arey, 1974). Хрусталик в процессе развития образуется из эктодермы в ответ на индуцирующий стимул из развивающегося глазного бокала. Сначала образуется пузырек из слоя одинаковых эпителиальных клеток - vesicular ophthalmica (Аникин, 1961; Бодемер, 1971). Затем некоторые клетки удлиняются и в конце концов заполняют просвет пузырька. Такие удлиненные клетки представляют собой первичные хрусталиковые волокна (Mann, 1949). На следующей стадии развития в зародышевой зоне, располагающейся по экватору хрусталика, начинается размножение эпителиальных клеток; образующиеся при делении клетки смещаются назад и начинают дифференцироваться, давая дополнительные вторичные хрусталиковые волокна. Эти вторичные волокна формируются постоянно в течение всей жизни и образуют ряды клеточных слоев вокруг первичных волокон. Вторичные волокна подобны первичным во всех отношениях, за исключением происхождения и расположения (Гирберт, 1993). Дифференцировку клеток волокна, аналогичную нормальной дифференцировке, можно получить и в условиях культуры. Клетки, изолированные из эпителия хрусталика цыпленка, поддерживали в культуре в течение почти 50 дней. Некоторые из этих клеток дифференцировались и становились похожими на нормальные хрусталиковые волокна. Об этом сходстве свидетельствовали как данные электронной микроскопии, так и накопление специфического белка хрусталика - Р-кристаллина (Okada et al., 1971). Кристаллины, составляющие значительную часть хрусталика, делятся на три группы, которые называют а-, р-, и у-кристаллинами. В каждую из этих групп входят молекулы, которые в свою очередь построены из субъединиц нескольких типов (Truman et al., 1971).
По мере того как волокна дифференцируются из эпителиальных клеток, происходят заметные изменения в их морфологии и ультраструктуре. Особенностью дифференцировки является значительное удлинение клеток, сопровождающееся продольным ориентированием микротрубочек вдоль внутренней стороны мембраны (Platlgorsky, 1972). Сначала увеличиваются ядра и ядрышки, происходит синтез РНК и ДНК, возрастает количество внутриклеточных рибосом. Затем, когда клетка вытягивается, в ней накапливаются в высокой концентрации структурные белки-кристаллины, которые в конце процесса составляют 30% сырого веса клетки. Одновременно клетка постепенно утрачивает многие органеллы. Исчезают митохондрии, и образование энергии в клетке теперь в основном зависит от анаэробного гликолиза. Рибосомы обнаруживаются в клетках лишь в виде небольших агрегатов, затем распадается клеточное ядро, и разрушается ДНК. Таким образом, зрелая клетка хрусталикового волокна, подобно эритроциту млекопитающего, безъядерна. Такая клетка представляет собой конечный продукт дифференцировки, так как она уже не способна дать начало клеткам какого-нибудь другого типа (Робертис и др., 1967; Макеева, 1992).
Пирс и Зваан (Pearce et al., 1970) показали, что клетки удлиняются и в культуре. Следовательно, способность клеток хрусталикового волокна удлиняться, присуща самим клеткам, а не появляется в результате действия внешних сил. Эти авторы полагают, что хотя микротрубочки, по-видимому, необходимы для изменения формы клеток, вытягивание клеток обусловливают не только они.
По мере дифференцировки различных частей глаза меняется и их оптическое поглощение, что указывает на биохимическую дифференцировку (Березин и др., 1999; Пири, ван Гейнинген, 1968). У некоторых видов амфибий после удаления первоначального хрусталика, ткани глаз могут дедифференцироваться, а потом редифференцироваться и вновь образовывать ткань хрусталика. Например, у головастиков жабы Xenopus laevis после дедифференцировки клетки хрусталика могут образоваться из клеток радужной оболочки, сетчатки и роговицы. Действительно, если фрагмент роговицы глаза инкубировать в культуре в отсутствие хрусталика, то некоторые клетки делятся и образуют выросты роговицы. Затем их морфология, а также способность окрашиваться гистологическими красителями может измениться, и они становятся похожими на хрусталиковые волокна. Более того, у них можно обнаружить антигены, характерные для дифференцированного хрусталика. При добавлении фрагмента хрусталика к сформированным культурам роговицы дифференцировка, по-видимому, подавляется. Создается впечатление, что в норме присутствие хрусталика мешает образованию ткани хрусталика из роговицы. Это указывает на существование механизма обратной связи, контролирующего эту дифференцировку (Campbell et al., 1968).
Биофизические аспекты стимуляции инфракрасным излучением
В настоящее время существует обширное количество литературы, в которой изложены различные аспекты механизмов воздействия НИЛИ на биологические объекты: количественные законы воздействия видимого света и ИК-спектра на клетки, молекулярный механизм. В литературе имеются обобщенные данные о воздействии излучения на различные клетки, включая культуры клеток in vitro, Escherichia coli, микроорганизмы и лимфоциты человека (Рубин и др., 1971;Belkin et al., 1988; Berns et al., 1988; Basford, 1989; Karu, 1987, 1988, 1989, 1990, 1991a, 19916, 1992, 1996a, 19966; Smith, 1991; Мантейфель и др., 1996; Бахрамов, 1999).
При пролиферации и дифференцировке клеток следует учитывать, что лазерное излучение может адсорбироваться тканями, отражаться от них и вызывать тепловые и электромеханические эффекты. Не исключается фоторазрушение и прохождение фотохимических реакций. Все перечисленные факторы могут оказывать воздействие на цитодифференцировку (Cammarata et al., 1999).
При дифференцировке тканей воздействие лазерного излучения может стимулировать процессы неадиабатического характера, особенно при действии монохроматическим излучением (Компанец и др., 1996).
Экспериментально показано на срезах живых клеток, что действие низкоинтенсивных лазеров с различными длинами волн приводит к возрастанию НАДН-дегидрогиназной активности и цитохром-с-оксидазы, а при действии высокоинтенсивного лазера происходит снижение активности указанных ферментов (Мантейфель и др., 1996). При нормальной дифференцировке тканей световые поля обладают способностью к саморепродукции и к самореставрации под влиянием клеточных структур, однако, нарушение цитодифференцировки может нарушать распределение лазерного излучения. Установленное свойство, связанное с цитодифференцировкой тканей, имеет также практическое значение, так как оно должно учитываться при разработке лазерных медико-биологических приборов (Малов и др., 1996).
В настоящее время облучение низкоинтенсивными инфракрасными лазерами все чаще применяется в медицине и ветеринарии. Наблюдаемые в клинике эффекты низкоэнергетичного стимулирования могут быть связаны с ростом активности фагоцитов, усилением пролиферации клеток, улучшением циркуляции крови по сосудистому руслу (Файн, 1968; Дудкевич и др., 1994; Владимиров, 1999).
Было сделано предположение, что лазерное облучение может вызывать три различные фотохимические реакции (Владимиров, 1994): - фотоокисление липидов в клеточных мембранах; - фотореактивацию фермента супероксиддисмутазы; - фотолиз комплексов окиси азота N02. Позднее эти предположения были подтверждены экспериментальным путем для гелий-неонового лазера с длиной волны 633 нм (Владимиров, 1999). Тот же автор задается вопросом: «...как объяснить действие инфракрасного лазера...где нет полос поглощения, связанных с электронными переходами у биологически важных молекул?». Импульсное инфракрасное лазерное излучение, как и любое другое лазерное излучение, обладает монохроматичностью, пространственой и временной когерентностью, а также поляризованностью. Эти свойства оказывают стимулирующее воздействие на кровообращение, мембранный клеточный обмен веществ, активизацию нейрогуморальных факторов, иммунокомпетентные системы. К основные эффектам низкоинтенсивного лазерного излучения относятся: - активизация синтеза белка; - активизация ферментов; - повышение выработки АТФ; - улучшение микроциркуляции; - гармонизация биохимического состава крови и ее агрегатного состояния; - регенерация тканей; - усиление синтеза коллагена; - противовоспалительное действие; - противоотечное действие; - обезболивающее действие; - снижение уровня холестерина; - стимуляция иммунной системы; - мощный антиоксидантный эффект; - рост синтеза простогландинов; - снижение уровня перекисного окисления липидов (Гамалея, 1972; Ohshiro, Calderhead, 1988; Горбатенкова и др., 1988; Козлов и др., 1993; Кару и др. 1995; Горяйнов, 1996; Методические рекомендации..., 2001). В нашей работе в качестве источника низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения использовался аппарат РИКТА-01.
Энергия фотонов лазерного излучения аппарата РИКТА-01 менее 1,5 эВ и она слишком мала для того, чтобы вызвать ионизацию (диссоциацию) органических молекул, нарушить естественные процессы, разорвать биополимерные связи. Этим обеспечивается отсутствие риска осложнений, отсутствие побочных явлений и высокий уровень лазерной безопасности данного аппарата квантовой терапии.
Глубину проникновения в ткани определяют параметры аппарата, в частности, длина волны импульсного лазера 890 нм. В диапазоне, соответствующем ближнему инфракрасному излучению, то есть порядка 740-3000 нм, биологические ткани считаются оптически прозрачными (Евстигнеев, 1994). Явление оптической прозрачности биотканей в инфракрасном диапазоне неоднократно подтверждено в работах отечественных и зарубежных ученых. Глубина проникновения излучения зависит также от поглощения его различными тканями. В частности: кожа, подкожная клетчатка, мышцы поглощают от 20 до 30% энергии, кости около 50%, паренхиматозные органы до 100% (Kara, 1987, 1988, 1989, 1990, 1991а, 19916; Belkin et al., 1988; Berns et al., 1988; Basford, 1989; Козлов и др., 1993). Это видно на рис. 2, где представлен график зависимости глубины проникновения света в биоткань (т.е. прозрачности биоткани) от длины волны излучения.
Из графика видно, что для ближнего инфракрасного диапазона спектра биологические ткани обладают максимальной оптической прозрачностью. Следовательно, именно длина волны лазерного излучения предопределяет, в первую очередь, глубину проникновения энергии в биоткань.
Методы исследования эмбрионального развития рыб при воздействии инфракрасным лазерным излучением
В качестве тест-объектов использовались эмбрионы рыб, легко доступных и хорошо переносящих содержание в лабораторных условиях - суматранский барбус Barbus tetrazona tetrazona и данио-рерио Brachydanio rerio, как одни из наиболее удобных представителей аквариумного рыбоводства. Это обусловлено достаточной легкостью получения оплодотворенной икры, а также быстротой ее инкубации (около 48 часов).
Для получения икры самок и самцов отделяли друг от друга и кормили живым кормом. Плотность посадки рыб в этот период не отличается от обычного содержания. Наиболее подготовленных к нересту рыб отлавливали и помещали в нерестовый аквариум.
Нерестовый аквариум наполняли свежей отстоянной водой с жесткостью не более 4,0 мг экв/л, с температурой около 27 С и рН 6,8 -6,9. В аквариум должна быть помещена сетка с ячеями 3 мм, которая служит для предохранения от поедания икры и личинок рыб взрослыми рыбами. Отложенная оплодотворенная икра опускается на дно, проходит сквозь сетку и становится недоступной для рыб. При размещении сетки следят, чтобы над сеткой осталось не менее одного литра воды для плавания производителей.
В нерестовый аквариум утром помещают самок и кормят сухим кормом, а вечером в этот же аквариум помещают по 2-3 самца на каждую самку, еще раз кормят всех рыб, а затем выключают свет. Стимулом к нересту служит утреннее включение света. После нереста взрослых рыб отсаживают, а оплодотворенные икринки помещают в чашки Петри.
Обычно выклев эмбрионов происходит через 48 ч после нереста, а еще через 48 ч предличинки начинают переходить на активное питание и становятся личинками. Переход предличинок на активное питание завершает данный этап исследований.
Для определения воздействия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения на эмбрионы и личинки рыб вели наблюдение за выклевом эмбрионов и выживаемостью предличинок в контроле, и после воздействия НИЛИ.
Для содержания рыб-производителей использовали аквариумы объемом от 25 л, заполненные отстоянной водопроводной водой с температурой 22 С. Для кормления может быть использован сухой корм, но при подготовке к нересту необходимы живые корма (дафния, циклоп, мотыль, трубочник).
Основными показателями воздействия инфракрасного лазерного излучения являются выживаемость эмбрионов и личинок, морфометрические параметры.
Процент оплодотворения выявляется уже через сутки после нереста. Неоплодотворенные икринки белеют и легко отличаются от нормально развивающихся икринок, которые остаются прозрачными.
Становятся белыми также и погибшие эмбрионы вследствие коагулирования белка. Гибель эмбрионов бывает наибольшей в начале и в конце эмбрионального периода.
Выклев - наиболее важный этап, завершающий эмбриональное развитие у рыб. Эмбрионы, достигшие стадии выклева, в результате неблагоприятного воздействия часто оказываются неспособными выйти из оболочек и погибают. Морфометрические исследования лучше всего проводить на выклюнувшихся предличинках. Появление уродств свидетельствует о тератогенном действии. Уродливые эмбрионы, погибшие во время эмбрионального развития, включались в число погибшей икры, а средний процент уродств подсчитывался после выклева и прохождения стадии предличинки.
Личинки, которые былиспособны нормально плавать, и переходили на активное питание, считались выжившими. Нормальными считались те особи, которые не имели морфологических отклонений.
В природе суматранский барбус Barbus tetrazona tetrazona обитает на островах Суматра, Борнео, Калимантан. Окраска серебристо-желтая, с четырьмя зеленовато-черными полосам поперек тела. Он не прихотлив в питании и содержании. Плодовитость от 150 до 500 икринок (Кочетов, 1991; Стюарт, 1999).
Эксперимент проводился по стандартной методике для эмбрионов и личинок рыб (Методические рекомендации..., 1998). При реализации этого метода после воздействия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения контролировалось эмбриональное развитие рыб, выклев свободных эмбрионов (предличинок) и выживаемость предличинок после выклева. Каждая группа (контроль и опыт) исследовалась с трехкратной повторностью по 10 оплодотворенных эмбрионов в повторности. Испытания проводились в чашках Петри (одна повторность в чашке). Икринки помещались в отстоянную водопроводную воду. Температура водной среды составляла 27±1 С, как наиболее оптимальная для развития эмбрионов (Плонский, 2000). Чашки Петри помещались в термостат, поддерживающий постоянную температуру.
Воздействие ИК- излучения на эмбриогенез рыб
Исследование развития икры барбуса при действии лазерного инфракрасного излучения с частотой импульсов 5 Гц позволило установить следующее. На активное питание перешли: в опытной группе - все выклюнувшиеся предличинки, а в контроле на 3% меньше. Как видно из таблицы 8 вероятность расхождения опытной и контрольных групп составляет 99,8%. Таким образом можно утверждать, что низкоинтенсивное инфракрасное излучение с частотой 5 Гц стимулирует выживаемость эмбрионов барбуса с высокой степенью достоверности.
Исходя из правила Арндт-Шульца представляло интерес исследование оптимума воздействия НИЛИ. Попытались выявить и возможный отрицательный эффект. Одним из лучших объектов для этого является икра рыб. С этой целью был поставлен эксперимент на выживаемость эмбрионов данио-рерио Brachydanio rerio.
В результате эксперимента выяснилось, что наиболее благоприятным режимом воздействия является частоты 5 Гц и 50 Гц. Таким образом, результаты эксперимента с данио-рерио подтверждают и дополняют данные, полученные во время опытов с суматранским барбусом. Как видно из таблицы 7 режим облучения с частотой в 1000 Гц оказал статистически достоверное неблагоприятное воздействие на выживаемость эмбрионов и личинок. Большой отход в этой группе обусловлен низким процентом выклева - 52,5%. Примерно у 40% выклюнувшихся личинок в этой группе наблюдались уродства -они не смогли выпрямиться. Возможно, большинство не выклюнувшихся яиц имело таких уродливых эмбрионов. Вероятно низкий процент выживаемости в данной группе связан прежде всего с высокой степенью облученности - 100 мкВт/см и плотностью потока энергии 12 мДж/см . Излучение с такими характеристиками вызвало, по-видимому, патологические изменения в развитии эмбрионов данио-рерио.
Из этого эксперимента можно сделать вывод, что эффект от воздействия НИЛИ зависит от дозы, а также существует оптимум . Так как биомолекулы прозрачны в ИК-спектре, прямого воздействия НИЛИ на молекулярном уровне едва ли можно ожидать. Известно, что вода является акцептором ИК-лучей, при воздействии на нее повышается температура, и нарушаются водородные связи между молекулами воды. Поэтому воздействие ИК-излучения можно ожидать и на гидратные оболочки биополимеров (что может привести к повышению их рецепторной активности), а также на макромолекулы, где водородные связи являются решающими в их работе - ДНК. О возможной роли изменений в ДНК под действием НИЛИ, указывает пролонгированность действия, как это показано в предыдущих опытах, влияние на рост и пролиферацию клеток, а также общность действия на исследованные организмы различного систематического положения.
В связи с вышеизложенным, потребовалось исследовать воздействие НИЛИ на генетическом уровне. Для этого изучалась митотическая активность на примере эпителия хрусталика лягушки Rana temporaria, а также на степень политеннии и пуффинг политенных хромосом хирономид Chironomus plumosus.
Наибольшая митотическая активность отмечается в группе, подвергшейся облучению и дополнительной травматизации. В герментативной зоне наблюдается достоверный эффект стимуляции митотической активности как при травмировании, так и без него. В предэкваториальной зоне достоверный эффект наблюдается только при дополнительной травматизации. В зоне переднего полюса митозы отмечались только при действии излучения и дополнительной травматизации, и в обеих группах значения МИ практически не отличаются друг от друга.
Результаты стимулирующего воздействия НИЛИ на митотическую активность эпителия хрусталика позволяют предположить, что хромосомы могут быть акцепторами ИК-излучения. Эффект стимуляции усиливается при предварительной травматизации, которая сама по себе ускоряет пролиферацию. Это указывает на то, что рабочие участки ДНК где проявляется экспрессия генов более подвержены воздействию НИЛИ.
В связи с полученными данными мы попытались проанализировать влияние НИЛИ на активные и репресированные участки политенных хромосом Chironomus plumosus.
Исследование действия низкоинтенсивного инфракрасного лазерного излучения в импульсном режиме с частотами 5 и 50 Гц на политенные хромосомы Chironomus plumosus показало некоторые изменения в их структуре. Проведенный анализ позволил сравнить дифференциальную активность генов в хромосомах у различных особей при различных параметрах воздействия.
На рис. 12 показана дифференциальная активность генов в хромосоме № 1. После воздействии импульсного лазерного излучения с частотой импульса 50 Гц данные хромосомы практически не отличались от контроля, степень политении и дифферинциальная активность генов не изменились.
