Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 12
1.1. Современное видение этиологии и патогенеза гипертонической болезни .12
1.2. Достижения в области генетики гипертонической болезни .16
1.3. Эпоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты (АК) и роль эпоксиэйкозатриеновых кислот в регуляцию сосудистого гомеостаза 20
1.4. Генетико-биохимическая характеристика цитохромов Р450 семейства 2 25
1.5. Влияние ДНК полиморфизмов генов CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 на развитие сердечно-сосудистых заболеваний 29
Глава 2. Материалы и методы исследований .32
2.1. Общая характеристика материала исследования 32
2.2. Характеристика методов исследования
2.2.1. Молекулярно-генетические методы 34
2.2.2. Статистические методы исследования 38
Глава 3. Результаты собственных исследований .40
3.1. Общая характеристика частот аллелей и генотипов цитохромов Р450
семейства 2 и их связь с развитием гипертонической болезни у жителей Центрального России 40
3.2. Анализ ассоциации полиморфизмов генов системы цитохромов P450 эпоксигеназ с риском развития гипертонической болезни 46
3.3. Гендерные особенности в ассоциациях полиморфизмов генов системы
цитохромов P450 эпоксигеназ с риском развития гипертонической болезни 51
3.4. Роль взаимодействия между генами цитохромов P450 эпоксигеназ в формировании предрасположенности к гипертонической болезни 57
3.5. Анализ гаплотипов, неравновесия по сцеплению и гаметических корреляций между ДНК-полиморфизмами и риск развития гипертонической болезни 69
3.6. Биоинформатический анализ регуляторного потенциала полиморфизмов генов CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 .75
Глава 4. Заключение 81
Выводы 92
Список литературы
- Эпоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты (АК) и роль эпоксиэйкозатриеновых кислот в регуляцию сосудистого гомеостаза
- Влияние ДНК полиморфизмов генов CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 на развитие сердечно-сосудистых заболеваний
- Молекулярно-генетические методы
- Роль взаимодействия между генами цитохромов P450 эпоксигеназ в формировании предрасположенности к гипертонической болезни
Введение к работе
Актуальность работы. Гипертоническая болезнь (ГБ) – одно из самых
распространенных сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), основным
проявлением которого является устойчивое повышение систолического и/или
диастолического артериального давления, оказывающее влияние на все
системы органов [Чазов Е.И., 1997; Гогин Е.Е., 2003]. По статистике Минздрава
России, уровень заболеваемости ГБ в Российской Федерации в течение
последних лет наблюдался на уровне 40% от общего числа населения
[Александрова Г.А., Поликарпов А.В., 2016]. ГБ опасна своими
сопутствующими заболеваниями, увеличивая риск возникновения мозгового инсульта, ишемической болезни сердца [Гармаш В.Я. и др., 2010].
Этиология ГБ сложна, и в данное время ведущая концепция говорит о многофакторности заболевания. Наряду с большим числом средовых факторов, таких как психоэмоциональный стресс [Ланг Г.Ф., 1950; Чернова И.М. и др., 2012], курение, гиподинамия [Brook et al., 2009; Foraster et al., 2014], выявлено большое число генов-кандидатов предрасположенности к заболеванию. Наиболее хорошо изученными являются мутации генов ангиотензин-превращающего фермента, ангиотензина, ренина, аддуцина и др. [Чистяков Д.А. и др., 2001; Padma G. et al., 2014], а также гены, имеющие отношение к регуляции сосудистого тонуса [Kusec R., 2013; Kooffreh M.E., 2013]. Несмотря на выявление большого числа генов-кандидатов ГБ в различных популяциях мира, многие аспекты этиологии и патогенеза болезни остаются не выясненными, а распространенность артериальных гипертензий продолжает расти, в том числе и по причине относительно низкой эффективности существующих лечебных и профилактических мероприятий. В связи с этим возрастает необходимость в дальнейшей расшифровке молекулярных механизмов ГБ и выявления новых мишеней для терапии болезни. В настоящее время одним из актуальных направлений в изучении патогенеза ССЗ является недавно открытый класс жирных кислот – эпоксиэйкозатриеновых кислот (EETs), который представляет собой группу биологически активных веществ, регулирующих сосудистый тонус и контролирующих функционирование сердечно-сосудистой системы, что делает метаболизм EETs многообещающей мишенью для разработки новых подходов к фармакологической коррекции артериальных гипертензий [Wu S.N. et al, 2007; Полоников А.В. и др., 2016].
Настоящее исследование посвящено изучению вовлеченности системы цитохром P450 эпоксигеназы в патогенез гипертонической болезни. До сих пор комплексного анализа по влиянию этой системы на риск развития ГБ не проводилось.
Степень разработанности темы. Активность работы системы цитохром
P450 эпоксигеназ и их экспрессия в различных тканях сильно варьирует,
причины этого сложны и не выяснены окончательно. Исследования показали
участие эпоксиэйкозатриеновых кислот в регуляции гипертонии, в развитии
инфаркта миокарда и других повреждений сердца, развитии воспаления [Chen
C., Wang D.W., 2013; Westphal C. et al., 2011]. В связи с этим, гены,
кодирующие систему цитохром P450 эпоксигеназ, рассматриваются как возможные кандидаты, вносящие вклад в развитие ГБ. Но необходимо отметить, что в последние годы количество публикаций, посвященных изучению влияния системы цитохром P450 эпоксигеназ на развитие ССЗ и ГБ, растет [Spiecker et al, 2004; Zhu et al., 2013; Mark K.D., 2014; Yan et al., 2015; Geng S. et al., 2017]. Однако при анализе результатов генетико-эпидемиологических исследований, выполненных в различных популяциях мира, обнаруживаются противоречивые результаты, что не дает целостного представления о вовлеченности генов системы цитохром P450 эпоксигеназ в формирование гипертонической болезни [King et al, 2005; Wu S.N. et al, 2007]. Объяснить это можно генетической гетерогенностью исследуемых популяций, особенностями отбора участников исследования. Вышеизложенное говорит о необходимости комплексного анализа вовлеченности полиморфных вариантов генов системы цитохром P450 эпоксигеназ в развитие ГБ.
Цель исследования. Провести комплексный анализ полиморфизмов
генов цитохромов Р450 эпоксигеназ, вовлеченных в метаболизм
эпоксиэйкозатриеновых кислот, и их вклад в развитие гипертонической болезни у жителей Центральной России.
Задачи исследования:
1. Изучить частоты аллелей цитохромов Р450 подсемейств 2J и 2С и
оценить их ассоциации с риском развития гипертонической болезни у жителей
Центральной России.
2. Установить различия во взаимосвязях полиморфизмов генов
цитохромов Р450 эпоксигеназ с риском развития гипертонической болезни у
мужчин и женщин.
3. Дать оценку роли взаимодействия между генами цитохромов P450
эпоксигеназ в формировании предрасположенности к гипертонической
болезни.
4. Провести анализ гаплотипов, неравновесия по сцеплению между
полиморфизмами генов цитохромов Р450 эпоксигеназ и оценить их связь с
риском развития гипертонической болезни.
5. С помощью биоинформатического анализа оценить регуляторный потенциал исследованных ДНК-полиморфизмов генов CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19.
Новизна исследования. Впервые у жителей Центрального России
исследованы частоты аллелей и генотипов полиморфизмов генов цитохромов
Р450 семейства 2 и оценена их связь с риском развития гипертонической
болезни. Впервые охарактеризованы пол-специфические эффекты
полиморфных вариантов генов цитохромов Р450 эпоксигеназ в отношении
предрасположенности к ГБ. Впервые установлено, что взаимодействия между
генами цитохромов Р450 семейства 2 составляют значимую основу для
формирования предрасположенности к гипертонической болезни.
Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использоваться для поиска новых фармакологических подходов в лечении ГБ и выявления новых мишеней для таргетной терапии болезни, а также при создании диагностических панелей для тестирования генетической предрасположенности к ГБ. Результаты исследования могут быть востребованы в практической деятельности врачей-генетиков, кардиологов и терапевтов, специалистов в области медицинской профилактики для разработки мероприятий по оптимизации лечения и профилактики ГБ. Результаты исследования могут использоваться для преподавания курсов медицинской и клинической генетики, патофизиологии и биохимии в вузах медицинского и медико-биологического профиля.
Методология и методы исследования. Методология исследования состояла в изучении ассоциаций полиморфных вариантов генов цитохромов Р450 эпоксигеназ (CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19) с риском развития ГБ в общей выборке и в зависимости от пола с целью выявления потенциальных механизмов вовлеченности данного класса генов в патогенез заболевания.
Степень достоверности материалов исследования. Степень
достоверности исследования определяется достаточным числом участников исследования (1558 человек: 913 пациентов с ГБ, 645 - в контрольной группе), группы больных ГБ и контроля были сопоставимы как по полу, так и по возрасту. Диагноз ГБ устанавливался квалифицированными врачами-кардиологами в соответствии с рекомендациями ВНОК. Статистический анализ проведен с использованием современных методов генетико-статистического анализа и биоинформатики.
Апробация работы. Материалы диссертационного исследования
доложены на VII Международной научной конференции молодых ученых-
медиков «Молодежная наука и современность» (Курск, 2013), Международной
научно-практической конференции, посвященной 81-летию Курского
государственного медицинского университета и 50-летию фармацевтического факультета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2016г.), 3-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2016), 26-м съезде European Meeting on Hypertension and Cardiovascular Protection (Париж, 2016), IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика» (Москва, 2017).
Личный вклад автора. Диссертантом выполнен анализ отечественных и
зарубежных источников по теме исследования, на основе данного анализа
сделан литературный обзор. Диссертантом лично проведено выделение
геномной ДНК из биобанка крови НИИ генетической и молекулярной
эпидемиологии Курского государственного медицинского университета на
выборке из 1558 человек. Автором выполнено генотипирование данной
выборки на базе Томского НИИ Медицинской генетики в Центре
коллективного пользования «Медицинская геномика» на масс-спектрометре
MassARRAY Analyzer 4 (Seqeunom/Agena Bioscience, США). Кроме того,
автором проведена статистическая обработка полученных данных,
интерпретация и описание результатов и подготовка основных публикаций.
Исследование выполнено в рамках проекта «Метаболизм
эпоксиэйкозатриеновых кислот и нарушения сосудистого гомеостаза при артериальной гипертензии и атеросклерозе: молекулярные аспекты патогенеза болезней и новые горизонты для таргетной и персонализированной терапии» при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение № 15-15-10010).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 3 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикаций результатов диссертационных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
-
Полиморфизмы генов цитохромов Р450 эпоксигеназ являются важной компонентой генетической предрасположенности к гипертонической болезни у жителей Центральной России.
-
Взаимосвязь полиморфизмов генов цитохромов Р450 эпоксигеназ с риском развития гипертонической болезни характеризуется выраженными половыми различиями в предрасположенности к заболеванию.
-
Значительный вклад в предрасположенность к гипертонической болезни вносят взаимодействия между генами цитохромов Р450 эпоксигеназ.
-
Полиморфизмы генов цитохромов Р450 эпоксигеназ являются функционально значимыми вариантами, и их регуляторный потенциал может определяться влияниями широкого спектра транскрипционных факторов и микроРНК, многие из которых могут быть патогенетически связаны с развитием гипертонической болезни.
Структура и объем диссертации. Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, глава результатов собственных исследований и заключение в виде обсуждения полученных результатов, выводы, список литературы и приложения. Работа представлена на 136 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы и 8 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает 180 источников, из которых 123 зарубежные.
Эпоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты (АК) и роль эпоксиэйкозатриеновых кислот в регуляцию сосудистого гомеостаза
АК играет значительную роль в регулировании взаимодействии лиганда и рецептора, изменении динамики ионных каналов и активности различных ферментов, работающих внутриклеточными медиаторами [Bonventre J.V., 1992]. Действие ее отмечено на рост мышечной ткани, защиту ткани мозга от оксидативного стресса, а также на развитие когнитивных функций у пациентов с болезнью Альцгеймера [Rapoport S.I. et al., 2006; Wang Z.J. et al., 2006; Amtul Z. et al., 2012].
АК высвобождается из мембранных фосфолипидов под действием фосфолипаз трех видов: сердечной ФЛА2, цитозольной (цитоплазматической) и секреторной. Пройдя мобилизацию, АК может пойти по пути четырех различных метаболических превращений. Это циклооксигеназный, липоксигеназный, Р-450-эпоксигеназный и изопростановый пути [Garrett J. G. et al., 2005]. Циклоксигеназный путь метаболизма АК, с помощью фермената ПГН синтетазы, приводит к превращению ее в эндоперекиси – простагландины, тромбоксаны A2 и простациклины. Липоксигеназный путь - это путь образования гидропероксиэйкозатетраеновых кислот (НРЕТЕ), которые в дальнейшем превращаются в гидроксипроизводные (НЕТЕ) и лейкотриены. Изопростановый путь приводит к образованию стереоизомеров простагландинов – изопростанов, имеющих вазоконстрикторный эффект на сосуды почек [Браунвальд Е. и др., 1993].
Эпоксигеназный путь превращений АК является одним из наиболее важных метаболических путей, который представляет интерес для исследователей этиологии и патогенеза ГБ в связи с образованием широкого спектра биологически активных эйкозаноидов, имеющих вазоактивные свойства [Wlodawer P., Samuelsson B., 1973; Smith W.L., Song I., 2002; Powell W.S., Rokach J., 2015]. В рамках данного метаболического пути превращения АК изоферменты микросомальных Р-450-монооксигеназ превращают арахидоновую кислоту в четыре разновидности эпоксиэйкозатриеновых кислот (EETs) [Spector A.A. et al., 2004]. Типичный механизм высвобождения EETs это брадикинин или ацетилхолин, действующие через соответствующие рецепторы (брадикининовый рецептор 2, мускариновый рецептор ацетилхолина М1 или М3), стимулируют васкулярные эндотелиальные клетки для их создания. Они участвуют в метаболизме разнообразных ксенобиотиков, которые, попадая в организм, влияют на синтез EETs, активность эпоксигеназ. В связи с чем уровень EETs у людей широко варьирует и зависит от окружающей среды, питания и некоторых других внешних факторов [Shahabi P. et al., 2014] .
Эти вещества нестабильны и быстро превращаются в соответствующие дигидроксиэйкозатриеновые (DHET) кислоты при участии фермента цитозольной эпоксигидролазы, которая образует их путем добавления воды через эпоксид [Harris T.R., Hammock B.D., 2013]. В отличие от простагландинов ЕЕТ и DHET могут включаться и депонироваться в фосфолипиды клеточных мембран [Deng Y. et al., 2010]. Связанная с мембраной микросомальная эпоксидная гидролаза может метаболизировать EETs в их дигидрокси-продукты, особенно это характерно для мозговой ткани, где уровень активности данного фермента высокий [Morisseau C., Hammock B.D., 2013]. Существуют и другие пути превращения, так EETs могут быть ацилированы в фосфолипиды. Такое изменение несет временный характер, и они могут быть активированы вновь при необходимости [Spector A.A., Kim H.Y., 2015]. Инактивация EETs происходит через бета и омега окисление, удлинение структуры различными ферментами, участвующими в синтезе жирных кислот. Такое большое количество путей метаболизма лимитирует работу лекарственных средств, направленную на повышение уровня EETs [Morisseau C., Hammock B.D., 2013].
EETs выполняют большое число регуляторных функций. Это высвобождение кальция, повышение активности мембранных каналов, повышение пролиферации клеток, снижение активности циклооксигеназы [Boron W.F., 2003]. В последние годы в литературе появляется все больше источников, указывающих на роль эпоксиэйкозатриеновых кислот в воспалительных процессах, в поддержании сосудистого тонуса. Они ингибируют адгезию лейкоцитов, защищают от миокардиальной ишемии, способствуют выживанию эндотелиальных клеток. Некоторые авторы отмечают важность разработки фармакологических средств, влияющих на данные вещества, как перспективного и нового направления в лечении сердечнососудистых заболеваний [Campbell W.B., Fleming I., 2010].
Метаболиты, полученные в Р-450-эпоксигеназном пути превращения в результате гидроксилирования АК, такие как 20-гидроэйкозатриеновые кислоты, имеют вазоконстрикторный эффект, а также обладают воспалительным действием во время реперфузии. При эпоксигенации арахидоновой кислоты цитохром 2J2 продуцирует 4 вида эйкозатриеновых кислот (EETs), 5, 6 - эпокси - 8 , 11, 14- эйкозатриеновые кислоты, 11, 12- эпокси -5, 8, 14- эйкозатриеновые кислоты, 8,9-эпокси-8, 11, 14- эйкозатриеновые кислоты и 14, 15- эпокси -5, 8, 11- эйкозатриеновые кислоты, для которых было отмечено участие в уменьшении ишемического и реперфузионного повреждения в сердце и сосудистой системе [Wu et al., 1996], а также стимуляция ангиогенеза и снижение агрегации тромбоцитов [Boron W.F., 2003].
Субстратом для данных преобразований могут быть полиненасыщенные кислоты, которые фермент превращает в сигнальные молекулы [Arnold et al., 2010; Fer et al., 2008]. CYP2J2 метаболизирует линолиевую кислоту в 9, 10 -эпоксиоктадекаеновую кислоту (вернолиевую кислоту или лейкотоксин) и 12, 13 - эпоксиоктадекановую (коронарная кислота или изолейкотоксин), и эйкозапентановые кислоты в различные эпоксиэйкозатриеновые кислоты. CYP2J2 вместе с CYP219, CYP2C8, CYP2C9, и, возможно, CYP2S1 главные производители эпоксиэйкозатриеновых кислот [Westphal C., 2011]. Важная физиологическая роль ЕЕТs проявляется в регулировке кровообращения.
Влияние ДНК полиморфизмов генов CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 на развитие сердечно-сосудистых заболеваний
Выделение ДНК производили из размороженной венозной крови эталонным методом фенольно-хлороформной экстракции, происходящим в два этапа [Маниатис Т. и др., 1984]. Лейкоциты осаждались центрифугированием с PBS, затем лизировались в ТЕ-буфере с протеиназой К в присутствии SDS. После этого пробы выдерживали не менее 9 ч. в термостате при постоянной температуре 37С. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: сначала фенолом, насыщенным ТRIS-HCl (pH=8,0), затем фенолом и хлороформом (в равных долях) и затем только хлороформом. Преципитацию ДНК производили 96% этанолом, охлажденным в морозильной камере при -20С, просушивали и растворяли в ТЕ-буфере, после чего измеряли концентрацию ДНК, разводили до концентрации 5-10 нг/мкл, аликвотировали и замораживали при -20C до проведения молекулярно-генетических исследований.
Выбор генов и ДНК-полиморфизмов для исследования Гены, кодирующие ферменты цитохром Р450 эпоксигеназы и вовлеченные в биосинтез эпоксиэйкозатриеновых кислот, были отобраны с использованием информационных баз данных KЕGG PАTHWАY (www.genome.jp/kegg/pathway.html), Reаctome Pаthwаy (www.reactome.org) и PharmGKB (www.pharmgkb.org). Всего было отобрано 4 гена, кодирующих ключевые эпоксигеназы подсемейства цитохромов Р450 2, катализирующие биосинтез эпоксиэйкозатриеновых кислот: CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19.
При выборе ДНК-полиморфизмов (SNP, single nucleotide polymorphism маркеров) применялся подход, заключающийся в отборе так называемых таргетных (tagger) SNPs или tagSNPs, включающих в себя соседние или близко расположенные аллели, наследуемые совместно чаще, чем это можно ожидать при случайном распределении, то есть находящиеся в неравновесии по сцеплению друг с другом (linkage disequilibrium, LD). Отбор tagSNPs подобным образом обеспечивает максимально полное покрытие каждого гена. Отобранные таким образом полиморфизмы охватывали основные SNP, находящиеся в пороговой корреляции с tagSNP соответствующего блока при значении LD D 0.8. При подборе SNPs учитывали маркеры с частотой минорного аллеля (MAF) не менее 5%, а также потенциальную функциональность полиморфизма, оцененную in silico с помощью биоинформатической программы SNP Function Prediction, разработанной Xu и Taylor [2009] и доступной на сайте SNPinfo Web Server (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm). В результате было отобрано 14 ДНК-полиморфизмов (SNP-маркеры), из них 8 полиморфизмов гена CYP2J2, 2 полиморфизма CYP2C8, 3 полиморфизма CYP2C9 и 1 полиморфизм гена CYP2C19 (табл. 2).
Генотипирование ДНК-полиморфизмов проводилось в центре коллективного пользования «Медицинская геномика» в НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ. Мультиплексное генотипирование выбранных для исследования SNP проводилось на основе технологии iPLEX методом MALDIOF масс-спектрометрии на генетическом анализаторе MassARRAY-4 (Seqeunom/Agena Bioscience, США). Для амплификации участков генома, охватывающих интересуемые SNP, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в режиме реального времени, при использовании прибора CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США) с помощью праймеров (таблица 3), синтезированных компанией Евроген (г. Москва).
Подбор праймеров осуществлялся с помощью программного обеспечения Sequenom Assay Design (Seqeunom/Agena Bioscience, США). Структура праймеров для каждого исследуемого полиморфизма, которые были использованы при генотипировании, приведена в таблице 3.
Третий этап включал проведение iPLEX-реакции. В образцы добавляли раствор, содержащий iPLEX буфер, ДНК-полимеразу, четыре dNTPs и смесь пролонгирующих праймеров. Так как концентрации низкомолекулярных праймеров должны быть ниже высокомолекулярных, все пролонгирующие праймеры делили на 4 группы по их молекулярной массе и вносили их в раствор в определенном объеме в соответствии с номером группы. Программа амплификации включала денатурацию 30 сек при 94С, далее 40 циклов, состоящих из денатурации 5сек при 94С, отжига 5 сек при 52С, элонгации 5 сек при 80С. После образцы инкубировали 5мин при 72С. Все реакции проводились в одном планшете.
Затем проводилось обессоливание образцов путем обработки смолой Spectro-CLEAN. В каждую лунку добавляли смолу в количестве 15 мг, устанавливали планшет на ротатор и вращали в течение 15мин, после чего их центрифугировали 5 мин. Перенос образцов на спектро-чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser RS1000 (Seqeunom/Agena Bioscience, США). После чего чип помещали в рабочую камеру масс-спектрометра, где происходила последовательная ионизация образца в каждой лунке чипа и разделение ионизированных частиц по массе. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения MassARRAY TYPER 4.0.
2.2.3. Статистические методы анализа
Для оценивания соответствия распределения частоты генотипа ожидаемому значению при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), а также для сопоставления распределений частот аллелей и генотипов исследуемых SNP между группами больных ГБ и контроля использовали критерий х2 Пирсона [Вейр Б., 1995]. О наличии ассоциаций аллелей или генотипов с предрасположенностью к ГБ делали вывод по величине отношения шансов (OR) - числовому показателю, показывающему, как вероятность попасть в группу "случай" (больные ГБ) отличается от вероятности попать в контрольную группу (здоровые индивиды) для человека с изучаемым генотипом [Pearce N., 1993].
Связь аллелей, генотипов и гаплотипов с риском развития ГБ оценивалась методом логистического регрессионного анализа с коррекцией по полу и возрасту с помощью программы SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm) [Sol et al, 2006] и программной среды R (пакет SNPassoc) [Gonzlez et al, 2006]. Тестировались кодоминантная, рецессивная, доминантная и сверхдоминантная генетические модели ассоциации исследуемых полиморфизмов и риском развития ГБ. Самая лучшая генетическая модель выбиралась по наименьшим рассчитанным значениям AIC (Akaike s Information Criterion).
Анализ ассоциации парных межгенных сочетаний с риском развития ГБ проводили путем сравнения парных сочетаний генотипов между генами эпоксигеназ, а также в пределах отдельных генов. Для этого строили таблицы сопряженности 3х3, которые затем сравнивали с помощью критерия %2 на предмет статистически значимых различий в накоплении определенных сочетаний генотипов у больных ГБ в сравнении с контрольной группой.
Анализ гаплотипов и их сравнение между группами проводился с помощью статистического пакета с помощью программы SNPStats [Sol et al., 2006]. Для оценивания величин неравновесия сцепливания пар SNP-маркеров использовали показатели D иг2, отражающие разницу в наблюдаемых и ожидаемых отношениях гаплотипов выбранных аллелей двух локусов при нулевой гипотезе о том, что они наследуются независимо [Lewontin R.C., 1988].
Статистический анализ данных проводился при использовании пакетов программ Excel 2007 (Microsoft, США) и Statistica 10.0 (StatSoft, США). О наличии статистически значимых различий между группами в частотах аллелей, генотипов, сочетаний генотипов и гаплотипов между группами судили при р 0,05.
Молекулярно-генетические методы
и модель сверхдоминирования, все полученные данные вынесены в приложение Следующий этап исследования включал анализ ассоциаций генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов эпоксигеназ с риском развития гипертонической болезни. В таблице 8 представлены результаты анализа ассоциаций исследуемых днк-маркеров с риском развития гб (кодоминантная генетическая модель). Нами проанализированы также доминантная, рецессивная (приложение №1).
При сравнительном анализе группы контроля и больных было выявлено, что для полиморфизма rs890293 гена CYP2J2, в котором у больных встречаемость генотипов СС выше чем у контрольной группы (OR 1,00; р=0,03), наблюдалась статистически значимая ассоциация аллеля С с повышенным риском развития ГБ (OR 1,54; 95%CI 1,11-2,12; p=0,01). Однако наиболее выраженная ассоциация данного полиморфизма гена CYP2J2 выявлена для доминантной генетической модели (OR 1,54; 95%CI 1,10-2,17; p=0,01 AIC=1725,2; приложение 1). Для других полиморфизмов гена CYP2J2 не было найдено статистически значимых отличий между контрольной группой и группой больных ГБ. Однако наблюдалась отчетливая тенденция в ассоциации полиморфизма rs11572325 CYP2J2 с повышенным риском развития ГБ при доминантной генетической модели (OR 1,28; 95%CI 0,98-1,66; p=0,07 AIC=2108,8; приложение 7). Кроме того, между группами больных ГБ и здоровых установлены статистически значимые различия в частотах аллелей и генотипов полиморфизма rs9332242 гена CYP2C9. Аллель G был ассоциирован с повышенным риском развития ГБ (OR 2.15; 95%CI 2.10-3.66; p=1.7 10-20), а частота встречаемости генотипа GG была в два раза выше у больных ГБ, чем в контрольной группе (OR 2,77; 95%CI 2,10-3,66; p=7.4 10-13). Наименьшее значение AIC (2036,8) установлено для кодоминантной модели ассоциации данного полиморфизма и риска развития ГБ (приложение 11). В таблице 9 представлены частоты аллелей и генотипов, а также рассчитанные значения отношения шансов и уровни статистической значимости ассоциаций маркеров с риском развития ГБ по выявленным ассоциациям с коррекцией по полу и возрасту. Из таблицы следует, что ассоциации аллелей и генотипов полиморфизмов rs890293 CYP2J2 и rs9332242 CYP2C9 с повышенным риском развития гипертонической болезни оставались статистически значимыми после поправки на пол и возраст пациентов (p 0.05).
Учитывая существование полового диморфизма в предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям, а также во взаимосвязях ДНК-полиморфизмов и других биологических маркеров с риском развития различных патологий [Ober et al., 2008; Mittelstrass et al., 2011] представлялось важным исследовать ассоциации полиморфных вариантов генов цитохром P450 эпоксигеназ раздельно у мужчин и женщин.
В таблицах 10 и 11 представлены данные о распределении частот аллелей и генотипов у изучаемой выборки. Как видно из представленных в таблицах данных, отдельные аллельные варианты генов системы цитохромов P450 эпоксигеназ 2J2 ассоциировались с риском развития заболевания. Так в сравнении с контрольной группой, в группе больных ГБ женщин отмечалось статистически значимое накопление частоты аллеля C (OR 2,08; 95%CI 1,29-3,34; p=0,003). Носительство генотипа CA, процент которых среди больных 17,83 и здоровых 8,94, ассоциировалось с повышенным риском развития ГБ (OR 2,18; 95%CI 1,31-3,36; p=0,01). Аллели и гетерозиготные варианты генотипов полиморфизмов rs2280275 и rs11572325 гена CYP2J2 у женщин были ассоциированы с риском развития ГБ. Для аллеля G полиморфизма rs7909236 гена CYP2C8 и аллеля C полиморфизма rs61886769 гена CYP2C9 у женщин характерна ассоциация с риском развития ГБ (ОR 1,35; 95%СI 1,03-1,17; р=0,03; ОR 0,74; 95%СI 0,57-0,98; р=0,04, соответственно), однако, для генотипов данных локусов не было найдено статистически значимых различий.
Роль взаимодействия между генами цитохромов P450 эпоксигеназ в формировании предрасположенности к гипертонической болезни
В работах некоторых ученых была показана способность эйкозаноидов понижать кровяное давление, стимулировать артериальную вазорелаксацию, ингибировать задержку почками солей и воды для уменьшения объема циркулирующей крови [Campbell W.B., Fleming I., 2010]. Также они обладают противовоспалительным влиянием, регулируют клеточные сигнальные пути, вазодилятацию, ангиогенез, увеличивают кровоток в органах и защищают от ишемического и реперфузного поражений [Wu et al., 1996; Boron W.F., 2003]. В экспериментах на животных была показана возможность предотвращение последствий повышенного АД, таких как сердечные приступы, инсульты благодаря введению эйкозаноидов Подобное действие возможно благодаря не только их антигипертензивному действию, но и противовоспалительному действию, оказываемому на кровеносные сосуды, ингибированию адгезии тромбоцитов [Spector A.A. et al., 2004].
Все вышеперечисленные свойства указывают на то, что гены системы цитохромов P450 эпоксигеназ, ответственные за эпоксигеназный путь преобразования АК, могут являться генами-кандидатами патогенеза ГБ, а также могут принимать участие в формировании ответной реакции на лечение ГБ. До настоящего времени исследований, направленных на изучение взаимосвязи широкого спектра полиморфизмов генов системы цитохромов P450 эпоксигеназ 2J2 с развитием гипертонической болезни не проводилось. Выбор панели полиморфизма генов для изучения в данном исследовании обусловлен их вкладом в формировании всех основных ферментов, синтезирующих эпоксиэйкозатриеновые кислоты. В рамках данной работы был изучен вклад 14 полиморфных вариантов из 4 генов системы цитохромов P450 эпоксигеназ 2J2 CYP2J2, CYP2C8, CYP2C9 и CYP2C19 в формирование предрасположенности к ГБ. В выборку больных вошли 913 индивидов, для которых был поставлен диагноз ГБ, и 645 относительно здоровых лиц контрольной группы. В результате мультиплексного генотипирования результативность (call rate) по выбранным генам составила 90% и выше. Выборка была сопоставима по полу и возрасту.
В распределении частот аллелей в исследуемой выборке коренных жителей Центральной России в сравнении Европейской популяции для абсолютного большинства полиморфизмов нами не было найдено статистически значимых различий, что свидетельствует о генетической гомогенности населения Центральной и Восточной Европы и ЦентральноЧерноземной России в отношении исследуемых полиморфизмов. По полиморфному варианту rs9332242 гена CYP2C9 были найдены статистически значимые различия, частота встречаемости мутантного аллеля, более чем в два раза выше в выборке жителей Курской области, что говорит о некоторой специфичности изучаемой популяции. При анализе соответствия частот генотипов полиморфизмов генов системы цитохромов P450 эпоксигеназ 2J2 популяционному равновесию Харди-Вайнберга, в общей выборке и раздельно для группы больных ГБ и контроля, статистически значимых различий обнаружено не было. Уровень гетерозиготности варьировал от 0,13 для полиморфизма rs890293 гена CYP2J2 до 0,46 в полиморфизме rs1155002 того же гена. При этом частоты всех аллельных вариантов, изученных полиморфизмов, превышали порог в 2%, т.е. являлись полиморфизмами, а не мутациями.
Для достижения поставленных задач был проведен анализ вовлеченности полиморфизмов исследуемых генов в формирование предрасположенности к ГБ. В общей выборке больных были установлены статистически значимые ассоциации для двух полиморфных вариантов – rs890293 гена CYP2J2, гетерозиготный генотип которого ассоциирован с повышенным рисков возникновения ГБ, и rs9332242 гена CYP2C9, гомозиготный генотип мутантного типа которого также ассоциирован с повышенным риском развития ГБ.
Для более корректного отражения полученных результатов была введена корректировка распределения аллелей и генотипов у контрольной группы и группы больных ГБ по полу и возрасту, что подтвердило ранее выявленные ассоциации. Литературных данных об ассоциациях rs9332242 гена CYP2C9 с какими-либо заболеваниями в других популяциях найдено не было, но после опубликования результатов нашего исследования, возможно, данный ДНК маркер подвергнется более детальному рассмотрению в работах других ученых. Ассоциация между полиморфизмом rs890293 и ГБ былa обнаружена у мужчин европейской популяции [King L.M. et al., 2005]. Тогда как для китайской и шведской популяции статистически значимых различий между частотами генотипов в группах больных и здоровых обнаружено не было [Fava C. et al., 2010; Zhu Q. et al., 2013].
Таким образом, результаты исследований по поиску ассоциаций полиморфизма rs890293 гена CYP2J2 с риском развития ГБ в различных популяциях противоречивы, что свидетельствует о межпопуляционной специфичности этого полиморфизма. Влияния вариантных генотипов полиморфизма rs890293 на риск развития ГБ, могут реализоваться через снижение уровня экспрессии гена у носителей данных вариантов, в результате чего нарушается биосинтез EETs. Данные активные метаболиты арахидоновой кислоты способны поляризовать клетки гладких мышц сосудов, что приводит к расслаблению стенок сосудов и снижению уровня гидродинамического давления крови. Следствием снижения уровня EETs может стать сниженная активность ионных каналов, регулирующих вазорелаксацию, недостаточное стимулирование образования вазодилататоров, увеличение сократительной способности сердечной мышцы и частоты сердечных сокращений, повышение уровня ренина и снижение выделения натрия в почках, способствование апоптическому и окислительному повреждению сосудов [Spector A.A. et al., 2004]. В почках было обнаружено, что EETs, которые образуются в проксимальных канальцах и кортикальных собирательных трубочках, уменьшают транспорт иона натрия и воды путем ингибирования натрий-водородного транспортера - Na+/H+ обменника [Fleming I., 2014]. Все указанные изменения могут способствовать повышению артериального давления у носителей вариантных генотипов полиморфизма rs890293 гена CYP2J2.