Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Гексаполоидная тритикале 10
1.1.1. Направления использования тритикале 11
1.1.1.1. Фуражное направление 11
1.1.1.2. Продовольственное направление 12
1.1.1.3. Производство кормов 13
1.1.1.4. Другие направления использования
1.1.2. Устойчивость к абиотическим факторам окружающей среды 14
1.1.3. Устойчивость к биотическим факторам окружающей среды 14
1.2. Гены короткостебельности 16
1.2.1. Открытие генов короткостебельности 16
1.2.1.1. Открытие генов короткостебельности пшеницы 16
1.2.1.2. Открытие генов короткостебельности ржи
1.2.2. Номенклатура генов короткостебельности пшеницы 20
1.2.3. Роль гиббереллина в контроле высоты растений 21
1.3. Молекулярная характеристика генов короткостебельности 22
1.3.1. Гены короткостебельности ржи 22
1.3.2. Гены короткостебельности пшеницы
1.3.2.1. Rht-B1b 24
1.3.2.2. Rht-B1e 25
1.3.2.3. Rht8 и Ppd-D1 25
1.4. Распространение генов короткостебельности 26
1.4.1. Распространение генов короткостебельности ржи 27
1.4.2. Распространение генов короткостебельности пшеницы 27
1.5. Плейотропное влияние генов короткостебельности 30
1.5.1. Влияние гена Ddw1 на хозяйственно-ценные признаки озимой тритикале 30
1.5.2. Влияние генов короткостебельности на хозяйственно-ценные признаки ржи 31
1.5.3. Влияние генов короткостебельности на хозяйственно-ценные признаки мягкой пшеницы 1.5.3.1. Высота 33
1.5.3.2. Урожайность 34
1.5.3.3. Начало фазы цветения 36
1.5.3.4. Способность к адаптации к различным климатическим условиям 36
1.5.3.5. Биомасса 37
1.5.3.6. Длина колеоптиле 37
1.5.3.7. Длина корней 39
1.5.3.8. Устойчивость к патогенам 40
1.6. Использование молекулярных маркеров в изучении короткостебельности
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Растительный материал 47
2.1.1. Характеристика сорта озимой тритикале Хонгор 49
2.1.2. Характеристика сорта Валентин 90 51
2.1.3. Характеристика сорта яровой тритикале Dublet 52
2.2. Методы исследований 53
2.2.1. ДНК-маркеры 53
2.2.3. Выделение ДНК 55
2.2.4. Клонирование и секвенирование 56
2.2.5. Анализ хозяйственно-ценных признаков 56
2.2.5. Статистическая обработка данных 57
ГЛАВА 3. Результаты исследования 58
3.1. Изучение коллекции яровой тритикале по генам короткостебельности 58
3.1.1.Валидация ДНК-маркеров генов короткостебельности у яровой гексаплоидной тритикале 60
3.1.1.1. Валидация ДНК-маркера аллеля короткостебельности Rht-B1b у яровой гексаплоидной тритикале 60
3.1.1.2. Валидация ДНК-маркеров аллеля короткостебельности Rht-B1е у яровой гексаплоидной тритикале 61
3.1.1.3. Валидация ДНК-маркера гена короткостебельности Ddw1 у яровой гексаплоидной тритикале 66
3.1.2. Распространение генов короткостебельности среди сортообразцов
яровой гексаплоидной тритикале 68
3.1.2.2. Распространение замещения хромосом 2R/2D среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале 73
3.1.2.3. Определение замещения у образца яровой гексаплоидной тритикале Л2412 76
3.1.2.4. Распространение гена короткостебельности Rht8 среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале 78
3.1.2.5. Распространение аллеля нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1а среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале 79
3.1.2.6. Распространение гена короткостебельности Ddw1 среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале 81
3.1.3. Средняя высота сортообразцов, охарактеризованных по наличию генов короткостебельности 82
3.2. Создание молекулярного маркера (CAPs) на ген Ddw1 86
3.3. Влияние генов Ddw1 и Rht-B1b на хозяйственно-ценные признаки яровой гексаплоидной тритикале
3.3.1. Оценка гибридности растений F1 от скрещивания сортов Валентин 90 Dublet и Хонгор Dublet 95
3.3.2. Условия вегетационного опыта 95
3.3.3. Оценка влияния генов Ddw1 и Rht-B1b на хозяйственно-ценные признаки яровой тритикале в условиях вегетационного опыта
3.3.3.1. Популяция F2 от скрещивания сортов Валентин 90 и Dublet 96
3.3.3.2. Популяция F2 от скрещивания сортов Хонгор и Dublet 106
3.3.3.3. Сопоставление влияния генов короткостебельности на некоторые
хозяйственно-ценные признаки двух популяций яровой тритикале 115
3.4. Заключение 123
Практические рекомендации 124
Выводы 125
Список сокращений 127
Список литературы 128
- Устойчивость к биотическим факторам окружающей среды
- Влияние гена Ddw1 на хозяйственно-ценные признаки озимой тритикале
- Характеристика сорта яровой тритикале Dublet
- Распространение аллеля нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1а среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале
Устойчивость к биотическим факторам окружающей среды
Аллели короткостебельности Rht-B1b и Rht-D1b снижают чувствительность растения к гибберелловой кислоте, хотя количество гиббереллина в самом растении при наличии этих аллелей возрастает. Такая же ситуация наблюдалась у арабидопсиса при наличии гена gai и у кукурузы при наличии гена d8. Peng с соавторами (1999) показали, что гены Rht-B1 и Rht-D1 являются ортологами генов GAI и D8. Ген GAI арабидопсиса кодирует белок DELLA, который служит репрессором сигнала ГК. Белок DELLA у арабидопсиса и других видов состоит из N-терминального домена DELLA, чувствительного к восприятию сигнала ГК, и C-терминального региона, который обладает функцией репрессора. Исследования на арабидопсисе и рисе показали, что белок DELLA дикого типа взаимодействует с рецептором ГК GID1 в присутствии ГК и образует комплекс ГК-GID1-DELLA, который способствует последующей деградации белка DELLA. Аллель Rht-B1b образовался в результате мутации аллеля дикого типа Rht-B1a, заключающейся в замене нуклеотида T на G. Эта мутация заменяет кодон Е61 (GGA) на стоп-кодон (TAG) вскоре после начала трансляции. Но благодаря рибосомальному сканированиию, начинающемуся после остановки трансляции, трансляция продолжается с какого-либо из нескольких метионинов, близко расположенных к стоп-кодону, в результате чего образуется белок DELLA, усеченный с N-конца (Peng et al., 1999). Структура мутантного белка DELLA не позволяет ему связываться в комплекс ГК-GID1-DELLA, поэтому он может осуществлять свою функцию репрессора ГК.
Другой источник нечувствительной к ГК короткостебельности был обнаружен у российского мутанта сорта Безостая1 – Krasnodari 1 (Worland, 1986; Borner et al., 1996). При сравнении сиквенсов аллелей короткостебельности Krasnodari 1 (Rht-B1e) и Безостая1 (Rht-B1b) было выявлено, что новая мутация также состоит в замене одного нуклеотида (Pearce et al., 2011). Замена нуклеотида А на Т изменяет кодон Lys-61 (AAG) на стоп-кодон (TAG), но находится мутация Rht-B1e на три кодона раньше, чем точка мутации аллеля Rht-B1b (Li et al., 2012). Основываясь на сходстве природы и позиции мутаций внутри кодирующего региона, Pearce с соавторами (2011) предполагают, что мутация Rht-B1e, также как и Rht-B1b, приводит к образованию белка, усеченного с N-конца, который подавляет ответ на ГК.
Korzun с соавторами (1998) установили тесную связь (0,6 cM) между аллелем короткостебельности Rht8с и аллелем 192 п.н. микросателлитного локуса Xgwm261, расположенного на хромосоме 2DS. На данный момент этот аллель является диагностическим для выявления наличия аллеля Rht8с. Всего выявлено 20 аллелей микросателлитного локуса Xgwm261, а соответственно, и гена Rht8: 164, 165, 174, 190, 192, 194, 195, 196, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 210, 212, 215 и 216 п.н. (Worland et al., 1998a, 1998b; Liu et al., 2005). Но при анализе 870 сортов пшеницы разных стран мира около 90% несли один из трех аллелей: 165, 174 и 192 п.н. (Worland et al., 2001). Ген Rht8 тесно сцеплен с геном нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1. Он относится к семейству генов PRR (Pseudo Response Regulator), известных регуляторов суточных ритмов у арабидопсиса (Turner et al., 2005). Реакция на фотопериодичность у пшеницы бывает чувствительной, когда своевременное цветение происходит только в условиях длинного дня, и нечувствительной, при которой цветение наступает как в условиях длинного, так и в условиях короткого дня. Известно, что от чувствительности растения к длине дня зависят процесс удлинения стебля и наступление фазы цветения. Worland с соавторами (1996) сообщают, что наличие доминантного аллеля Ppd-D1a снижает высоту на 10 см и ускоряет время цветения растений, уменьшая их жизненный цикл, в среднем, на неделю, в то время как аллель короткостебельности Rht8 снижает высоту лишь на 8 см и имеет минимальное плейотропное влияние на другие признаки. Доминантный аллель гена Ppd-D1, обеспечивающий нейтральную реакцию на фотопериод, отличается от рецессивного аллеля делецией размером 2089 п.н. (Beales et al., 2007).
Гены короткостебельности имеют важнейшее значение в селекции полевых культур. Получение коммерческих сортов пшеницы, ржи, риса, несущих эти гены, привело к значительному росту урожайности этих культур (Peng et al., 1999). После открытия генов короткостебельности стало активно изучаться их молекулярное строение, плейотропное влияние, биохимические процессы. Немаловажным направлением исследований является изучение распространения генов короткостебельности среди сортов, возделываемых в различных климатических зонах (Чеботарь, 2008; Divashuk et al., 2013; Guedira et al., 2010; Knopf et al., 2008; Toovic-Maric et al., 2008). Такие исследования дают возможность оценить экономическую эффективность использования различных генов короткостебельности, способность адаптации сортов с этими генами к разным климатическим условиям, а также выявить дополнительные эффекты генов короткостебельности и/или их сочетаний методами ассоциативной генетики (Rebetzke et al., 2012; Jamali and Ashraf, 2008; Zhang et al., 2006). Такие исследования, в основном, проводятся на пшенице, т.к. снижение высоты растений этой культуры обеспечивается разнообразными генами. У ржи короткостебельность сортов обеспечивается, в основном, одним геном, Ddw1. На тритикале, в частности, яровой, таких исследований не проводилось.
Рожь является довольно высокорослой культурой. Открытие гена Ddw1 привело к широчайшему его распространению среди сортов этой культуры благодаря сильному влиянию на высоту растений. Он снижает высоту диплоидной ржи на 40%, а тетраплоидной – до 55% (Кобылянский, Солодухина, 2012). Благодаря этому ген Ddw1 стал основным геном снижения высоты ржи, и на сегодняшний день он присутствует у 90% сортов ржи российской и европейской селекции (Гончаренко, 1984, 2012; Кедрова, 2000; Пономарева, 2001, 2012).
У пшеницы на сегодняшний день обнаружено 22 гена, контролирующих высоту растения (McIntosh et al., 2013). Из них наиболее распространенными являются гены Rht-B1b, Rht-D1b, Rht-В1е и Rht8с.
Гены Rht-B1b и Rht-D1b – это первые гены короткостебельности, которые стали целенаправленно использоваться для снижения высоты растений пшеницы. После открытия этих генов, они быстро распространились по всему миру. По данным Evans (1998) на сегодняшний день около 70% мировых сортов несут один из генов «зеленой революции». Однако распределение этих генов в разных странах различно. Так, в Сербии ген Rht-B1b несут 40% сортов, а ген Rht-D1b – лишь 22% (Toovic-Maric et al., 2008). В Германии же соотношение другое: 38% и 6% соответственно (Knopf et al., 2008). В Украине снижение высоты 16% сортов обеспечивает ген Rht-B1b, а у 34% сортов укорочение стебля происходит благодаря гену Rht-D1b (Чеботарь, 2008). Среди сортов мягкой пшеницы юга России ген короткостебельности Rht-B1b присутствовал у 38% сортов, а ген Rht-D1b у 13% сортов (Divashuk et al., 2013).
Аллель короткостебельности Rht-В1е был обнаружен у мутанта сорта Безостая1 Краснодари1. О нем стало известно относительно недавно, поэтому широкого распространения этот аллель еще не получил. Тем не менее, на юге России он обеспечивает короткостебельность и увеличение урожайности многих сортов, его несут 16,5% сортов озимой пшеницы отечественной селекции (Divashuk et al., 2013).
Аллель короткостебельности Rht8с широко распространен главным образом в Южной и Восточной Европе. Так, он присутствует у 94% сортов пшеницы Украины, у 62% сербских сортов, 86% сортов Югославии и 80% болгарских сортов (Chebotar et al., 2006; Toovic-Maric et al., 2008; Zheleva et al., 2006). Во многих странах, таких как Нидерланды, Швейцария, Германия и Великобритания, этот аллель не был обнаружен ни в одном из исследованных сортов (Knopf et al., 2008; Worland et al., 2001). В некоторых странах (Франция, Мексика, США, Австрия) аллель Rht8с присутствует у небольшого количества сортов, частота его встречаемости варьирует от 2 до 8% (Guedira, 2010; Worland et al., 2001). Распространение генов короткостебельности не всегда диктуется только условиями окружающей среды. Например, в Украине большую роль в распространении генов среди сортов имеет селекционный центр: встречаемость гена Rht8с в сортах Селекционно-генетического института составляет 98%, а в сортах Мироновского института пшеницы – 50%, хотя климатические условия для создаваемых сортов сходны (Chebotar et al., 2006).
Влияние гена Ddw1 на хозяйственно-ценные признаки озимой тритикале
Включен в Госреестр по Северо-Кавказскому (6) и Нижневолжскому (8) регионам. Двуручка. Гексаплоидный. Куст промежуточный. Растение средней длины - длинное. Время колошения среднее - позднее. Восковой налет на влагалище флагового листа сильный. Опушение шейки стебля среднее. Колос белый, средней длины, средней плотности, наполовину остистый. Ости на конце колоса короткие - средней длины. Наружная поверхность нижней колосковой чешуи неопушенная, зубец короткий - средней длины. Зерно средней крупности, овально-удлиненное, светло-красное. Масса 1000 зерен 40,4-53,8 г. Зернокормовой. Средняя урожайность зерна в Северо-Кавказском регионе - 46,5 ц/га, Нижневолжском - 33,5 ц/га, выше средних стандартов на 4,8 ц/га. Средняя урожайность сухого вещества в Северо-Кавказском регионе 67,7 ц/га, на уровне среднего стандарта. Рекомендуется для возделывания в
Республике Адыгея, Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области, Республике Калмыкия. Вегетационный период 234-287 дней. Зимостойкость на уровне стандартов. Высота растений 110-138 см. На высоком агрофоне при загущенном посеве склонен к полеганию. В полевых условиях очень слабо поражался септориозом, слабо - бурой ржавчиной. По данным заявителя, при искусственном заражении не поражался желтой ржавчиной, мучнистой росой, пыльной головней; устойчив к твердой головне, бурой ржавчине, септориозу; восприимчив к фузариозу колоса. (http://www.agroxxi.ru/spravochnik-sortov-semjan/sort-9610548.html). На Рисунке 4 представлена родословная сорта Валентин 90. Рисунок 4. Родословная сорта Валентин 90 (Ковтуненко, 2008).
Сорт яровой тритикале Dublet имеет стебель высотой 110 см, полый или слабо выполненный между основанием колоса и узлом стебля ниже. Флаговый лист длиной 18-21 см, шириной 1,5 см. Колос полностью остистый, белый, длиной 13 см, с 27 колосками в колосе. Ости длинные, ровные. Зерно удлиненное, окрашенное. Среднеспелый сорт. Средняя урожайность за 2006 2008 годы испытания составила 70,9 ц/га. Сорт обладает высокой продук тивной кустистостью и формирует к уборке значительную густоту колосьев, устойчив к полеганию. Вегетационный период в среднем по республике составляет 95 дней. Масса 1000 семян в среднем составляет 40,4 г, натура зерна 708 г/л. Среднее содержание белка 12,2%, крахмала 67,0%. Число падения 200 секунд. Сорт зернофуражного направления (http://agrosbornik.ru/sorta tritikale/47-2011-11-06-17-26-33/598-2011-11-08-19-59-22.html). 2.2. Методы исследований 2.2.1. ДНК-маркеры
Для определения наличия аллелей Rht-B1b и Rht-B1a использовали праймеры, разработанные Ellis с соавторами (2002). Для выявления аллеля Rht-B1e применяли два ДНК-маркера, разработанные Pearce с соавторами (2011) и Li с соавторами (2012). Наличие гена Ddw1 определяли с помощью праймеров на микросателлитную последовательность REMS1218 (Tenhola-Roininen, Tanhuanpaa, 2010). Для определения аллельного состояния гена Rht8 использовали микросателлитный маркер Xgwm261 (Korzun et al., 1998). Определение аллельного состояния гена Ppd-D1 проводили с помощью праймеров, разработанных Beales с соавторами (2007).
Наличие замещений определяли при помощи молекулярных маркеров: SSR: Xwmc111 (2DS), Xgvm349 (2DL), Xbarc168 (2DS), Xgwm102 (2DS), Xgwm484 (2DS), Xgwm539 (2DL), Xbarc271 (1DL), Xbarc149 (1DS); STS Sec2 (2RS) (Lee et al., 1994); PLUG: TNAC1204, TNAC1176 (Lijun et al., 2012). Условия проведения ПЦР с ДНК-маркерами были аналогичны описанным в статьях по разработке этих маркеров.
Продукты амплификации маркеров TNAC1204 и TNAC1176 рестрицировались с помощью эндонуклеазы рестрикции BsuR I при температуре 37С в течение ночи.
При разработке маркера CAPS на ген Ddw1 продукты амплификации микросателлитного маркера REMS1218 рестрицировались с помощью эндонуклеаз рестрикции Sse9I и BseRI. Рестрикция с использованием эндонуклеазы рестрикции Sse9I проходила при 55С в течение ночи, с добавлением в пробирки масла для предупреждения испарения продукта, а с использованием эндонуклеазы рестрикции BseRI – при 37С в течение 6 часов без добавления в пробирки масла. Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле в трис-боратном (TBE) буферном растворе при напряжённости электрического поля 6В/см. В качестве маркера размеров использовали «100 bp Ladder» («Fermentas», Литва). Окрашивание проводили бромистым этидием для последующей визуализации в УФ-трансиллюминаторе.
Определение аллелей микросателлитов REMS1218 и Xgwm261 проводили с помощью фрагментного анализа с использованием генетического анализатора 3130xl Genetic Analyzer.
Скрещивания сортов Хонгор (Ddw1+Rht-B1b) и Валентин 90 (Ddw1) с сортом Dublet (Rht-B1b) проводили в теплице Центра молекулярной биотехнологии. Семена материнских сортов (Хонгор и Валентин 90) высевали в вегетационные сосуды по 10 штук. В фазе кущения растения были помещены в яровизационную комнату на 2 месяца. После прохождения яровизации в фазе колошения растения кастрировались и опылялись методом подстановки. В результате скрещиваний было получено 73 гибридных семени от скрещивания сорта озимой тритикале Хонгор с сортом яровой тритикале Dublet и 55 гибридных семян от скрещивания озимого сорта Валентин 90 с сортом Dublet.
Гибридные растения выращивались в теплице в вегетационных сосудах. В фазе кущения у каждого отдельного растения отбирался фрагмент листа длиной около 2 см для выделения ДНК и проверки гибридности по генам Ddw1 и Rht-B1b.
Характеристика сорта яровой тритикале Dublet
Для определения наличия аллеля Rht-B1e у небольшого количества образцов гексаплоидной тритикале возможно использование как маркера, разработанного Pearce c cоавторами (2011), так и маркера, разработанного Li с соавторами (2012), с единственным уточнением, что при использовании первого маркера необходим более продолжительный по длительности электрофорез. Однако, праймеры BF, WR3 и MR3 (Pearce et al., 2011) позволяют обнаруживать гетерозиготные растения, т.к. показывают наличие или отсутствие сразу двух аллелей – дикого и короткостебельного. Поэтому их применение будет удобным для генотипирования расщепляющихся популяций в селекции тритикале. Еще одним достоинством этих праймеров является то, что они всегда показывают наличие одного из аллелей, и исследователь может не сомневаться в том, что не было ингибирования ПЦР. В отличие от них, праймеры NF.BF.2 и Me.R показывают наличие лишь аллеля короткостебельности, а в случае, если ПЦР не прошла, отсутствие бэнда можно принять за отрицательный результат. Но при проведении селекционной работы на основе молекулярных маркеров, когда количество исследуемых растений велико, а временные и материальные ресурсы для проведения анализов ограничены, необходимость длительного электрофореза и трудность интерпретации данных представляют собой существенную проблему, как с методической, так и с организационной стороны процесса. В то же время, для селекции крайне необходимым является применение кодоминантных маркеров, позволяющих идентифицировать гетерозиготы. Поэтому при работе с тритикале в селекционном процессе мы рекомендуем применять следующую комбинацию маркеров: на аллель Rht-B1а использовать праймеры BF/WR3, а на аллель Rht-B1е праймеры NF.BF.2/Me.R. При применении именно такой комбинации мы получим модифицированный кодоминантный маркер, на работу которого не будет оказывать влияние наличие генома ржи, что позволит, с одной стороны, существенно сэкономить как время, так и расходные материалы, а с другой – значительно облегчит интерпретацию полученных результатов
Помимо генов пшеницы тритикале может нести в своем геноме и гены короткостебельности ржи. Выделяют 14 генов короткостебельности ржи, но наиболее перспективным для селекции и распространенным среди сортов является доминантный ген Ddw1 (Кобылянский, 1972; Кобылянский, 2007; Borner et al., 1996; Kobyljanski, 1975; Stojaowski et al., 2014). Наличие гена Ddw1 укорачивает высоту растений до 40% у диплоидной и до 55% – у тетраплоидной ржи. Этот ген, как и гены короткостебельности пшеницы, обладает широким плейотропным эффектом: увеличивает размер колоса, число колосков и зерен в колосе, мощность корневой системы, кустистость растений, площадь листовой поверхности (Кобылянский, Солодухина, 2012; Hackauf et al., 2012; Kobyljanski, 1975; Kondratenko, Goncharenko, 1975).
Ген Ddw1 был включен во многие селекционные программы для предотвращения полегания ржи. С использованием источников и доноров гена доминантной короткостебельности создано около 80% российских сортов ржи и около 90% сортов стран СНГ (Кобылянский, Солодухина, 2012). Установлено, что Ddw1 является гомеологом гена карликовости пшеницы Rht12 (Borner et al., 1996; Korzun et al., 1997). Он расположен на длинном плече хромосомы 5R (Korzun et al., 1996) и тесно сцеплен с микросателлитным локусом REMS1218 (Tenhola-Roininen, Tanhuanpaa, 2010).
Наличие гена Ddw1 можно определить только с помощью микросателлитного маркера REMS1218 (Tenhola-Roininen Tanhuanpa a, 2010). Размеры амплифицируемых фрагментов у образцов, несущих и не несущих ген Ddw1, различаются всего на 4 нуклеотидных основания. Эти различия можно обнаружить только с помощью фрагментного анализа. По данным Tenhola-Roininen и Tanhuanpaa (2010), если микросателлитный анализ показывает наличие одного фрагмента размером 317 п.н. – растение не несет ген Ddw1, если же анализ показывает наличие двух фрагментов размером 317 и 321 п.н., это значит, что у растения есть этот ген (рисунок 9). Однако все исследования по этому вопросу ограничивались только двумя селекционными образцами ржи.
У яровой тритикале помимо двух типов амплификации, описанных в статье по разработке микросателлитного маркера, нами было обнаружено еще пять типов амплификации (таблица 5).
При этом у контрольных образцов пшеницы амплификация с данным маркером полностью отсутствовала. Таким образом, выявленные нами различия связаны с вариативностью микросателлитной последовательности, на которую разработаны праймеры. Теоретически, так как ген Ddw1 был изначально выявлен у образца ЕМ-1, и ее тип амплификации соответствует 317+321 п.н., то остальные типы амплификации можно интерпретировать, как отсутствие гена Ddw1. Однако с учетом возможных рекомбинаций в результате скрещиваний, необходимо проводить дополнительные анализы для выявления гена короткостебельности в том или ином образце. В случае проведения селекции с помощью молекулярных маркеров, пока наиболее удобным представляется подбор пар для скрещивания, в которых у второго родителя (отсутствие гена короткостебельности) будет амплифицироваться фрагмент размером 317 п.н. Данная комбинация представляется наиболее удобной для проведения анализов на молекулярные маркеры, так как другие типы амплификации могут «скрывать» наличие гена Ddw1 в индивидуальных растениях расщепляющейся популяции.
После валидации молекулярных маркеров на гены короткостебельности у яровой тритикале, следующим этапом нашей работы было изучение коллекция яровой гексаплоидной тритикале.
Коллекция яровой гексаплоидной тритикале кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, состоящая из 86 образцов, была проанализирована с помощью молекулярных маркеров на наличие генов короткостебельности Rht-B1b, Rht-B1e, Rht8с и Ddw1. Также был проведен анализ наличия замещения хромосом 2R/2D и гена нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1, тесно сцепленного с геном Rht8. 3.1.2.1. Распространение генов короткостебельности Rht-B1b и Rht-B1e среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале
Наличие аллеля Rht-B1b определялось с помощью праймеров, разработанных Ellis с соавторами (2002) (рисунок 10). Он был выявлен у 73 анализируемых образцов, что составило 84,9% образцов коллекции (таблица 6). У трех образцов (PI-587265, PI-519877, PI-520445) анализ показал либо расщепление, либо одновременное наличие обоих аллелей, Rht-B1a и Rht-B1b. В расчетах эти образцы не использовались. Наличие аллеля Rht-B1e определялось с помощью праймеров, разработанных Pearce с совторами (2011), и проверенных нами на предыдущих этапах работы (рисунки 6, 7). Аллель Rht-B1e не был найден ни у одного из образцов (рисунок 11). Исследуемые образцы и все используемые ДНК-маркеры представлены в таблице 6.
Распространение аллеля нечувствительности к фотопериоду Ppd-D1а среди сортообразцов яровой гексаплоидной тритикале
При оценке влияния генов Ddw1 и Rht-B1 на массу зерна с главного колоса статистически значимых различий между шестью группами не обнаружено. Если говорить о тенденциях, то наличие аллеля Rht-B1b увеличивает массу зерна с главного колоса: в отсутствие аллеля Ddw1 масса увеличивается на 8,3%, а при наличии Ddw1 – на 4,8%. Аллель Ddw1 как в отсутствие аллеля Rht-B1b, так и при его наличии уменьшает массу зерна с колоса – на 9,1% и 12,5% соответственно. Сочетание этих аллелей уменьшает массу на 4,5% (таблица 9).
Определение массы зерна с растения не показало статистически значимых различий между группами с разными генами и их сочетаниями. Аллель Ddw1 уменьшал среднее значение признака как при наличии аллеля Rht-B1b, так и при его отсутствии. Наличие аллеля Rht-B1b не оказывало влияния на массу зерна с растения ни в сочетании с аллелем Ddw1, ни при его отсутствии.
На такие признаки как число зерен с растения, общее число колосков в колосе, число озерненных колосков в колосе, длина и плотность колоса аллели Ddw1 и Rht-B1b также статистически значимого влияния не оказывали. Если судить по средним показателям, то при наличии аллеля Ddw1 наблюдается тенденция к увеличению плотности колоса, при этом наблюдается уменьшение длины колоса; на число зерен с главного колоса и с растения, завязываемость и число колосков ген Ddw1 влияния не оказывал. Аллель Rht-B1b не оказывал влияния на число зерен с растения, число колосков в колосе, длину и плотность колоса; наблюдалась тенденция к снижению продуктивной кустистости (таблица 9).
Исследование завязываемости зерен у растений F2 в условиях вегетационного опыта не выявило достоверных различий у шести групп по наличию аллелей короткостебельности. Хотя наблюдается тенденция к увеличению этого признака при наличии аллеля Rht-B1b. Самый высокий показатель завязываемости был выявлен у групп, гомозиготных по аллелю Rht-B1b, а самый низкий – у группы без аллеля Rht-B1b и с аллелем Ddw1. Выявить тенденцию к увеличению или уменьшению завязываемости при наличии аллеля Ddw1 невозможно: в отсутствие аллеля Rht-B1b аллель Ddw1 снижал завязываемость, при гетерозиготном и гомозиготном состоянии аллеля Rht-B1b не влиял на этот признак (таблица 10).
Если разделить популяцию только по аллелю Rht-B1b и не учитывать аллельное состояние гена Ddw1, то выявляется явная тенденция к повышению завязываемости при наличии у растения данного аллеля, находящееся, однако, в пределах доверительного интервала. Различие между двумя гомозиготными группами составляет 14,6%. Гетерозиготная группа по гену Rht-Bl имеет промежуточное значение. При разделении популяции на две группы по проявлению гена Ddwl средние значения двух групп были одинаковы.
Хотя статистически значимых различий и не было выявлено, по-видимому, увеличение числа зерен с главного колоса в случае наличия Rht-BlЪ можно как раз связать с увеличением завязываемости.
Завязываемость 1,9±0,3 1,7±0,2 1,9±0,2 1,9±0,1 2,1±0,2 2,1±0,2 Тритикале характеризуется в целом наличием щуплого зерна. Современные сорта лишены этого недостатка. Однако определение щуплости остается одним из наиболее важных критериев оценки селекционных образцов. Анализ доли растений с полностью щуплым зерном у шести групп генотипов показал, что доверительные интервалы этих групп пересекаются, но наблюдается явное увеличение доли при наличии аллеля Rht-Blb. Доминантный аллель Ddwl увеличивал долю растений со щуплым зерном только в группе с аллелем Rht-Blb в гомозиготном состоянии. В группе, гетерозиготной по аллелю Rht-B1b и без этого аллеля, влияния аллеля Ddw1 не выявлено (таблица 10).
Доминантный аллель Ddw1 в отсутствие аллеля Rht-B1b задерживает фазу начала цветения в среднем на два дня, а при наличии Rht-B1b – не влияет на этот признак. Аллель Rht-B1b не влияет на дату начала цветения независимо от наличия гена Ddw1.
Сорт озимой тритикале Хонгор несет два гена короткостебельности: Ddw1 и Rht-B1b, у сорта Dublet один ген короткостебельности – Rht-B1b. Данная комбинация скрещивания была выбрана для создания селекционного материала, сочетающего в себе оба гена короткостебельности, а также для предварительной оценки влияния гена Ddw1 на хозяйственно-ценные признаки в присутствии аллеля Rht-B1b в гомозиготном состоянии.
Ген Ddw1 является доминантным. В выполненных ранее работах ввиду отсутствия кодоминантного маркера анализируемые растения делились на две группы: Ddw1/- и ddw1/ddw1 (Кобылянский, Солодухина, 2012; Kalih et al., 2014; Tenhola-Roininen, Tanhuanpaа, 2010). После разработки кодоминантного маркера CAPS стало возможным разделить анализируемую популяцию на три группы – Ddw1/Ddw1, Ddw1/ddw1 и ddw1/ddw1 – и проанализировать также влияние гетерозиготы на все исследуемые признаки. Количество растений в каждой группе представлено в таблице 11. Влияние гена Ddw1 на хозяйственно-ценные признаки яровой тритикале представлено в таблицах 12, 13 и 14.