Введение к работе
Организм современного человека постоянно сталкивается с воздействием разнообразных веществ, обладающих иммутто тройной активностью. Это могут быть лекарственные препараты, вакцины, производственные вредности, вещества, загрязняющие среду обитания. С этой точки зрения изучение ззаимодепствил иммунной системы и ксенобиотиков, а также вклада в это взаимодействие генетически детерминированных факторов, представляет существенный интерес. Исследования в этой области нкеят особое значение для клинической медицины, располагающей сегодня ппгрогаш арсеналом средств, способных с той или иной степени сгте:ц:фич-ности подавлять иммунные реакции. Сюда могут быть отнесены вещества гормональной природы (глюкокортикоиды), природные вещества (например циклоспорин А), а тагсхе разнообразные химические иммунодепрессанты. Бее эти препараты, влияя на разные иммунные реакции, способны оказывать тот или иной иммуномоду-лирующмй эффект.
При планировании работы, результаты которой представлены в настоящем докладе, мы исходили из следуіга;их предпосылок:
-
практически любой иммуномодулиругащий препарат мчлет ока-эывть влияние на разные звенья сложной цепи иммуногенеза-;
-
каждое гвено этой цепи, по-видимому, обладает гі'опм порогом ЧуВСТВИТеЛЬНОСТИ, В СВЯЗИ С ЧЄМ Нетрудно ПрЭДП'МГЖ'ТТЬ, 4VO
по мере снижения доры количество точек прнложіМ'.нч і:»'м\ ізотропного препарата будет уменьшаться, а специфичность его действия, соответственно, возрастать; (3) пороги чувприг^лъносги для одних и тех же звеньев такой цепи у особей с рааннм генотипом могут быть различными.
Хотл вопрос о вкладе генетически детермнштрс ягш'млг ф.-.кто-роп в действие иммунотропных агентов изучен пока еще очень мало, накоплекный клинический опыт, свидетельствует о различной эффективности применения такого рода препаратов у разных больных, что заставляет думать о генетической природе этого клинического феномена. Эта мысль находит подтверждение в ряде работ, проведенных на лабораторных животных (Пэвкицкий, 1974; Hipkens et al., 1981; Pevnitsky et al. , 1365). К сожалении, исследования а этом направлении носят весьма ограниченный характер, что, вероятно, может быть объяснено тем, что при иэу-
чении тонких механизмов действия какого-либо препарата на иммунную систему, как правило, возникают вопросы, связанные с новой или слабо изученной иммунологической феноменологией, исследование которой отвлекает силы от изучения генетически детерминированных различий чувствительности иммунной системы к действия лекарствс-нных веществ. Тем не менее исследования в атом напрайл'їнии необходимы, а опит нашей работы показывает, что генетический подход к решению вопросов иммунофзрмакодогии может быть достаточно эффективным.
Исходя из приведенных выше предпосылок, мы изучали процессы взаимодействия лекарственного препарата и иммунной системы, используя модели, содержащие два произвольно меняемых параметра: дозу и генотип. Возможности, откьшающиеся при использовании такого рода моделей демонстрируют результаты представленных ни*а зксперитментов.
Актуальность. Вариабельность эффекта применения лекарственных препаратов, обладающих иммунодепрессиЕНой и цитостати-ческой активностью, заставляет думать, что одной на причин этого явлении могут быть различия в индивидуальной чувствительности больных к действию иммунодепрессантов. Справедливость такого предположения подтверждают результаты экспериментальных исследований на мышах разных линий, проведенных ранее под руководством профессора Л. А. Певницкого в лаборатории имму-ногенетики Института медицинской генетики АМН СССР. В то же время современная клиника не располагает методами оценки индивидуальной чувствительности больных к действию иммунодепрес-сантов. Наличие таких методов позволило бы врачу производить оценку индивидуальной чувствительности больного к действию им-мунодэпрессантов на основании результатов лабораторного исследования, а не ex juvantibus, как это имеет место в современной терапевтической клинике.
Нз менее важным направлением исследований современной иммунофармакологии является вопрос о механизмах индивидуальной чувствительности больных к терапии глюкокортикоидными гормонами. Знать заранее иди хотя бы предполагать, какой будет чувствительность Сольного к этим препаратам, означало бы избежать
многочисленных побочных эффектов от приема глгасокортикоидов. Решение этой сложной задачи зависит от понимания механизмов их иммунодепрессивного действия.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение вклада различных факторов в определение индивидуальной чувствительности к действию ряда иммуномодулирувщих агентов, а также изучение механизмов такой чувствительности.
Для достижения поставленной цели в ходе исследования решались следующие задачи:
-
разработка и экспериментальное обоснование количественного метода оценки индивидуальной чувствительности к препаратам с антипролиферативной активностью; ./
-
исследование различий чувствительности лимфоидных itce* ток к антипролиферативному действию некоторых иммунодеирессан-тов у мышей разных генотипов;
-
изучение механизмов генетических различий в чувствительности клеток к антипролиферативному действию иммуясдепрес-сантов;
-
количественная оценка вклада различных генетически обусловленных факторов в индивидуальную чувствительность к им-мунодепрессивному действии препаратов;
Б) разработка метода оценки индивидуальной чувствительности здоровых доноров к антипролиферативному действию д-экса-метазона (Дм);
-
изучение эффективности связывания глткокортикоидов специфическими цитоплаэматическими рецепторами з зависимости от принадлежности донора к той или иной группа чувствительности;
-
изучение распределения частот встречаемости антигенов HLA среди доноров, относящихся к различным группам чувствительности.
-
определение уровня продукции ИЛ-2 лимфоцитами с разным типом чувствительности к Дм;
-
исследование изменения прдукции ИЛ-2 при воздействии широкого диапазона доз Дм;
10) приведение сравнительного анализа между результатами
лечения различных форм гломерулонефрита алкилируюдами препара
тами и данными по определению чувствительности лимфоцитов пе-
риферической крови к антипролиферативному действию этих препаратов.
Научная, новизна.
В ходе проведенных исследований применен оригинальный подход к решению вопросов иммунофармакологии, основанный на использовании экспериментальных моделей, включающих два переменных параметра: генотип животного и дозу изучаемого иммунот-. ропного агента.
Предпринята попытка дать количественную оценкку разным генетически детерминированным факторам, гноеяшим вклад в определение чувствительности мышей данного генотипа к иммунодеп-рессивному действию цяклофосфамида (1Ы.
Разработан метод количественной оценки чувствительности лимфоидных клеток к антипролиферативному действию иммунодеп-рессактов. Предло/йно уравнение, удовлетворительно описьшающэе кривую накопления в крови и выведения из крови алкилируюших метаболитов Цф. Отличительной особенностью этого уравнения является его способность учитывать нелинейные фармзкокикетичес-кие процессы. С помощью предложенной, фармакокинетической модели установлено, чго форма фарыакокинетдчоскай кривой при изменении доэы кативного препарата может претерпевать столь существенные изменения, что обнаруживаемое в крови суммарное количество алкилирующих метаболитов при введении одной дозы препарата мажет быть Сольеє для «цветных одной из сравниваемых инбредных линий, а при изменении дозы ато количество может оказаться большим для животных уже другой линии.
Впервые с помощью гибридологического анализа проведено изучение генетического контроля продукции интерлейкина-2 у мы-пнй инбредных линий.
Впервые получены данные, свидетельстауюцие в пользу того, что мидге-нью действия мафосфамлда (синтетический аналог алкили-рующего метаболита Цф) при использовании ого in vitro в относительно низких, но достаточных для подавления пролкферативно-го ответа, дозах в первую очередь оказывается тяжелая цепь (р75) рецептора для интерлейкина-2. Показано, что этот механизм является ведуїцим в определении межлинэйных различий чувствительности лимфоцитов к антипролиферативному действию мафос-фамида.
Впервые показана возможность оценки в тесте in vitro ин-
-5-.
дивидуальной чувствительности больных гломерулонефритом к терапии алкклируккдкми препаратами.
- Предложен новый метод оценки индивидуальной чувствительности лимфоидкых клеток здоровых доноров к антипролпфе ратин ному действию дексаметазона. С учетом наличия корреляции между высотой пролифератпвного ответа и степенью подавления этого ответа дексзметазоноы удалось выявить 3 типа чувствительности: чувствительный, промежуточный и резистентный. ЛЛЮРГіНО, что это разделение косит не случайный характер, а связано с механизмами антипролифератипного действия глюкокортикондов - эффективностью их рецепции и интенсивностью продукции интерлей-кина-2. Выявлены ассоциации типов чувствительности с антигенами системы HLA: резистентность к антипролифератизному действию дексаметазона ассоциирована с антигенами HLA-B7, В12 и DR2, а чувствительность - с антигеном HLA-B18.
Впервые обнаружен феномен стимуляции прдукции ИЛ-2 малыми дозами глюкокортикоидов.
Показано, что сочетанное- действие на лимфоидкые клетки дексаметазона и мафосфанлда (циклоспорина А) может приводить к резкому угнетения проляфератнзногсі ответа, которое нм-">ет место даже в тех случая;:, когда указанные препараты, npnvoточные по отдельности оказывают очень слабый эффект пли не окаэьл'ыгг его вовсе.
Научно-практическяя значимость работы.
В ходе проведенных исследований на примере цнклі'фосфзми-да продемонсгрирпозакы возможности иммунофармакогекетического подхода для аттаяляз вклада отдельных фэкгорсз в определение типа чувствительности к действий имыунодепресснгных препаратов. Разработаны методы оценки чувствите ль кости лнмфоидннх клеток к антипролиферативному действию алкилируюших препаратов, циклоспорина А и глюкокортикоидных гормонов.
Изучено распределение типов чувствительности к антипролифератизному дейсгвиэ указанных пммунотролных агентов среди популяции здоровых доноров и мьпк-й разных кнбредкых линий. Установлено, что характер распределения по типам чувствительности к антипролифератизному действию хлорбутина среди здоровых . лиц не отличался от такового среди больных ревматоидным артритоим и гломерулонефритом.
Установлена высокая степень соответствия (р<0,05) между эффективностью лечения хлорбутияом различных форм гломерулонефрите у детей и чувствительностью in vitro лимфоидных клеток больных к антипролиферативнэму действию этого препарата. Эти результаты свидетельствуют в пользу принципиальной возможности выявления больных, резистентных к лечению данным препаратом, с помощью лабораторных тестов, а ке ex juvantibus.
Положения, аыяооимш на защэту.
і. Проведенные исследования демонстрируют воэмоюгости генетического подхода для решения вопросов иммунофармакологии.
2. На основа разработанного метода количественной оценки
чувствительности лпмфоидных клеток к анхилролиферативному
действии алкялиругапих агентов, а также с помощью усовершенс
твованной фармакокинетичаокой модели накопления в крови и вы
ведения из крози алкилируюших метаболитов ціпїлофосфанида, ис
следованы механизмы различий чувствительности мышей разных ик-
бредкых линий к шмунодэпрессивкому действий циклсфосфамида и
предложена модель взаимодействия циклофосфамида и иммунной
СИСТеМо!.
-
Проведен генетический анализ межлщэйных различий продукции к акцепции шігерлейкина-2. Исследовано значение этих механизмов для определения типа чувствительности к аитипроли-феративному действию алкклкруюцях агентов.
-
Разработан метод оценки чувствительности лимфоцитов периферической крови Сольных к. антипролиферативному действию алкилирующих препаратов in vitro и показано удовлетворительное совпадение таких исследований с реэультатми лечэния этими пре-паратмк гломерудояефрита у деуей.
-
Разработан метод оценки чувствительности лимфоцитов периферической кроаи к антзшролифератквнсму действии глшокор-тикоидных гормонов. Показано, что разделение здоровых доноров на группы чувствительности, проведенное по этому методу носит неслучайный характер. Это разделение связано как с генетическими маркерами (ассоциации с антигенам*: Н1.А), так и с мэханиз-иами алтипролиферативного действия глякокортикоидов (эффективность рецепции и интенсивность продукции инт&рлейкина-2).
-
Обнаружен феномен стимуляции продукции ингврдейкина-2
малыми дозами глшокортіїкоидов. Установлен диапазон доз, в котором происходит переход от стимуляции продукции интерлейки-на-2 к ее угнетению.
'Внедрение результатов работы.
Разработанный в ходе проведенных исследований метод количественной оценки чувствительностит лимфоцитов периферической крови к антипролиферативкому действию алкидируицих препаратов внедрен в практику в Отелении нефрологии Института педиатрии РАМН.
Апробация работы.
Материалы диссертации обсуждены на II Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека (26-2(3 ноября 1985г., Цущино), на Республиканской конференции "Механизмы иммуностимуляции" (Киев, 1985 г.), на Есосо.такоп конференции по генетике соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-15 окт. 1989г.), на I Всесоюзном съезде иммунологов (1969 г), на Всесоюзном симпозиуме "Проблемы изучения наследсгвон.'.'зоти человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии" (Москва, 1989 г.), на симпозиуме Международной ассоциации по биологической стандартизации (Франция, Аннэси, 1991 г.), на 5-й Международной конференции по иммукофзрмакологин (CUM, Тампа, Флорида, 1991), на I Съезде иммунологон России (Новосибирск, 1992 г.), на конференции Отдела иммунологии Опитадь Кэкер (Франция, Париж, 1991 і\ ), на Ученом ссгете МГНЦ РАМК (1991, 1S92 г. г.), на Международном симпозиуме "Биологические функции белков острой фазы и регуляция их синтеза" (Польша, Краков, 1992).