Введение к работе
Актуальность проблемы. Высшие растения в последнее время все чаше становятся объектами исследований по генной инженерии. В связи с появ-іением методов введения генов в клетки растений реальной становится не только задача клонирования и изучения организации отдельных растительных генов, но и обратная задача - анализ экспрессии генов в клетках растений. Свойство тотипотентности растительных клеток, то есть спо-иобность регенерации полноценного растения из отдельной незародышевой слетки, делает их уникальной моделью, позволяющей вести исследования не на популяции клеток, а на уровне целого организма.
До сих пор наибольшее внимание уделялось анализу либо молекулярной организации растительных генов, либо регуляции экспрессии генов в грансгенных растениях. В практическом плане задача часто сводится к изучению возможности улучшения растений путем введения в них отдельных генов или группы генов. Вместе с тем, важное значение имеет также проблема влияния введенного в растение нового гена как на генотип и фенотип растения в целом, так и на изменение активности собственных растительных генов. Этот аспект генетической трансформации высших растений практически не изучен.
Рост и развитие растений представляет собой сложный, динамичный, но строго контролируемый процесс. Известно, что координированный рост растения осуществляется с помощью регуляторних механизмов, важнейшим из которых является гормональная система. Все жизненные процессы в растениях, начиная от клеток и кончая такими сложными этапами развития как цветение и созревание плода, определяются фигогормонами. Для включения и выключения физиологических и морфогенетических программ используются одни и' те же фитогормоны, но в разных соотношениях. Известно, что сдвиг баланса гормонов в растении может кардинальным образом изменять экспрессию многих генов. В то же время имеются многочисленные доказательства тесного взаимодействия фитогормонов. Для выяснения путей гормональной регуляции роста и развития используют два основных подхода: анализ уровней эндогенных гормонов либо изучение действия экзогенных гормонов на ростовые процессы. Однако, в последнем случае получаемые результаты могут не отражать реальную картину, поскольку не учитываются такие факторы, как поглощение гормонов, их транспорт, ком-партментализация, метаболизм и т.п. Получение трансгенных растений с измененным фитогормональньм статусом представляет собой современный альтернативный подход. В этой связи актуальным является введение в
і
растения генов, изменяющих баланс фитогормонов, и изучение влияниі этих изменений на рост и другие генетические процессы.
В настоящее время известны эффективные векторные системы на основе плазмид Agrobacteriw для введения и экспрессии чужеродных генов і растительных клетках, разработанные усилиями ведущих ученых (Schell, 1987). Однако, к моменту начала данной работы были известны тольк< единичные случаи успешного переноса генов в растения. Вопрос о влияню чухеродных генов на активность растительных генов вообще не ставился. Влияние введенных генов на фитогормональныи баланс обсуждалось лишь і связи с индукцией опухолей у растений. Поэтому существовала необходимость разработки собственных векторных систем для растений.
Настоящая работа посвящена исследованию возможности получения растений с генетически обусловленным изменением фитогормонального статусг путем введения в них генов чужеродного происхождения и изучению последствий введения генов на рост и активность собственных генов растений. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке экспериментальных подход'ов к конструированию трансгенных растений, несущих чужеродные гены, в том числе, гены, изменяющие баланс фитогормонов в растительных тканях, и в изучении возможности использования таких растений как модели для анализа влияния введения чужеродных генов на рост, фитогормональныи статус и генетические процессы у растений. В задачи исследования входило: I)конструирование на основе Ti-плазмиды Agrobacterim tmefaciens
векторов для переноса генов в растения (растительных векторов) и
разработка способа переноса генов в растения с помощью векторной
системы плазмид Agrobacterim; 2)получение укореняющихся трансгенных растений, в клетках которых
экспрессируется бактериальный ген изопентенилтрансферазы ipt (другое
обозначение - T-cyt) из Т-ШК Ti-ллазмиды A. tmefaciens - ключевого
фермента пути биосинтеза цитокининов; 3)поиск и введение в растения других генов, которые могут влиять на
морфологию растения и баланс фитогормонов; 4)анализ влияния введенных чужеродных генов на фитогормональныи статус
растений; 5)изучение возможности использования трансгенных растений с измененным
фитогормональным статусом в качестве модели для анализа гормональной
регуляции экспрессии растительных генов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выдвинута концепция генетически-дегерминированного изменения фитогормонального
статуса растений путем введения генов бактериального происхождения. Обнаружено, что изменение уровня одного из гормонов в трансгенном растении, вызванное экспрессией единственного введенного гена, сопровождается целым комплексом изменений фитогормонального баланса. Показана возможность использования трансгенных растений с измененным гормональным статусом для анализа фитогормональнои регуляции процессов роста и развития у растений.
На основе клонирования и анализа релликона нопалиновой Ті-плазми-ды A. tumefaciens pTiC58 сконструирована векторная "мини-Ті"-плазмида для переноса генов в растения; получена серия растительных экспресси-онных векторов. Разработан оригинальный способ введения генов в растения с помощь» бинарной системы, включающей векторную "мини-Ті"-плазми-ду и плазмиду-помощник pRi A. rhizogenes, защищенный патентом.
Получены укореняющиеся трансгенные растения табака, томата и картофеля, несущие активный ipt-ген. Трансгенные растения "цитокининового типа" способны к нормальному росту, однако, имеют ряд особенностей морфологии, характерных для нарушенного гормонального баланса. Впервые проведен комплексный анализ содержания различных фитогормонов в ткани трансгенных растений с измененным гормональным статусом. Проведено измерение уровней содержания цитокининов, ауксина, гиббереллина и абсцизовой кислоты в трансгенных растениях; растения охарактеризованы также по некоторым параметрам, связанным с метаболизмом гормонов.
Впервые в растения введен ген ксилозоизомеразы (глюкозоизомеразы) E.coli Ixyl) и обнаружено, что экспрессия ху-1-геяа коррелирует с изменением гормонального баланса и морфологии растений. Показано, что концентрация ауксина в грансгенных растениях хуі-типа снижена по сравнению с растениями дикого типа при сохранении неизмененным уровня цитокининов.
Таким образом, впервые получены два различных типа трансгенных растений, у которых баланс фитогормонов изменен в сторону, относительного увеличения содержания цитокининов.
Впервые предложена экспериментальная система для изучения модуляции экспрессии растительных генов в- условиях "цитокининового стресса", вызванного эндогенным изменением баланса фитогормонов в растениях, и продемонстрирована возможность изменения экспрессии собственных растительных генов в трансгенных растениях, экспрессируюших чужеродные гены. Показано, в частности, что в трансгенных растениях обоих описанных типов увеличение относительного содержания цитокининов сопровождается повышением относительного уровня мРНН одного из генов фотосинтеза -
гена большой субьединшы рибулозо-1,5-6исфосфаткарбоксилазы rbcL, , изменением относительных уровней накопления ряда других хлоропластны генов. Сконструированные трансгенные растения являются удобной модель; для изучения регуляции активности растительных генов фитогормонами.
Полученные результаты способствуют дальнейшему более глубокому по ниманию последствий введения и экспрессии чужеродных генов в растени ях, открывают реальные возможности создания новых форм культурных рас тений с полезными признаками. Полученные в данной работе рекомбинанг ные плазмиды, штаммы и трансгенные линии растений переданы в ряд ин ститутов Российской академии наук.и других ведомств, где они нашлі применение в научно-исследовательских и практических работах.
Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада Материалы, использованые в диссертации, получены самостоятельно и і соавторстве с аспирантами и сотрудниками Отдела молекулярной генетик; растений ШГ РАН, возглавляемого Э. С. Пиру з ян; часть исследований вы полнена совместно с сотрудниками Отдела химии физиологически-активны; веществ ИНГ РАН, Лаборатории природных и синтетических регуляторов Ш. РАН, Отдела клеточной инженерии НПО по картофелеводству Россельхозака демии, Лаборатории молекулярной генетики взаимодействия микроорганиз мов с растениями Центра "Биоинженерия" РАН. Автор выражает глубокуі благодарность всем коллегам.