Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11-44
1.1. Молекулярные основы этиологии и патогенеза эссенциальной гипертензии .11-21
1.2. Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение 21-32
1.3. Вовлеченность генов матриксных металлопротеиназ в формирование эссенциальной гипертензии и ее осложнений .32-44
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования .45-63
2.1. Общая характеристика групп исследования. 45-49
2.2. Выбор однонуклеотидных полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ 49-51
2.3. Молекулярно-генетические методы 51-58
2.3. Биометрические и генетико-статистические методы 59-63
ГЛАВА 3. Иccледование ассоциаций полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ с формированием эссенциальной гипертензии 64-152
3.1. Изучение патогенетически значимых признаков и факторов риска эссенциальной гипертензии 64-69
3.2. Анализ ассоциаций генов матриксных металлопротеиназ с формированием эссенциальной гипертензии 69-89
3.3. Значение индекса массы тела и дислипидемий в характере ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием эссенциальной гипертензии 89-97
3.4. Изучение генно-средовых взаимодействий при формировании эссенциальной гипертензии 97-116
3.5. Анализ ассоциаций генов матриксных металлопротеиназ с уровнем артериального давления 116-125
3.6. Исследование роли полиморфизмов матриксных металлопротеиназ в формировании ишемического инсульта на фоне эссенциальной гипертензии .125-152
Обсуждение 153-168
Заключение .169-171
Выводы 172-173
Список литературы
- Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
- Вовлеченность генов матриксных металлопротеиназ в формирование эссенциальной гипертензии и ее осложнений
- Молекулярно-генетические методы
- Значение индекса массы тела и дислипидемий в характере ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием эссенциальной гипертензии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются
глобальной проблемой современного здравоохранения и занимают второе
место в структуре общей смертности [Болевич С.Б.и др., 2012; Максимович
Н.А., 2014; Панченко Е.А., 2015; Chowdhury T.Т. et аl., 2016; Battistoni A. et
аl., 2016]. В настоящее время среди сердечно-сосудистых заболеваний
колоссальное клиническое значение по влиянию на здоровье,
трудоспособность, продолжительность жизни имеет эссенциальная
(первичная) гипертензия (ЭГ) [Perk J. et аl., 2012; Seravalle G. et аl., 2014; Chen Z.R. et аl., 2016; Singh M. et al., 2016]. Распространенность ЭГ в Российской Федерации достигает 39,2% среди мужчин и 41,1% среди женщин [ВНОК, 2010; Крюков Н.Н. и др., 2011]. По некоторым оценкам, число пациентов с эссенциальной гипертензией достигнет к 2025 году 1,56 млрд [Taljaard M. еt al., 2014; Wang J. et al., 2016]. Ежегодно в мире регистрируется более 9,4 млн. случаев смерти в результате осложнений ЭГ, таких как инсульт, инфаркт миокарда, почечная недостаточность и др. [Чазова И. Е. и др., 2010; Ward A.M. et аl., 2012; Schroen B. et al., 2014; Lind L. et al., 2015; Koakowska U. et al., 2015; Li Y.Y. et al., 2016].
В развитие и прогрессирование ЭГ вовлечены разнообразные
патогенетические механизмы, сложный комплекс которых рассматривается в
рамках концепции сердечно-сосудистого континуума [Hayashidani S. et al.,
2013; Cao X. et аl., 2014; Virdis A. et аl., 2016; Cheng C. et al., 2016].
Эссенциальная гипертензия является мульфакториальным заболеванием, за
развитие которого отвечают модифицируемые (особенности питания,
физическая активность, вредные привычки и др.) и немодифицируемые (пол,
возраст, генетические факторы, этническая принадлежность) факторы риска
[Niu L. еt al., 2014; Chistiakov D.A. et al., 2015; Islam S.M. et al., 2015; Thebault
J.L. et al., 2015; Zambrana R.E. et al., 2016; Patel S.A. et al., 2016].
Исследования последних лет демонстрируют несомненную роль в
формировании ЭГ и ее осложнений генетических факторов [Яхонтов Д.А. и
др., 2014; Конради А.О, 2015; Гаврилюк Н.Д. и др., 2015; Баранова Е.И. и др.,
2015; Цырлин В.А. и др., 2016; Малюгин В.И. и др., 2016; Gomez I.M. et al.,
2014; Роlonikov A.V. et аl., 2014; Korkmaz K.S. et al., 2014; Ratnaparkhe V. еt
al., 2015; Okayama M. еt al., 2016; Mao S.Q. еt al., 2017]. Отечественными и
зарубежными исследователями выявлены ассоциации с возникновением ЭГ
более 150 генов-кандидатов, среди которых важное значение имеют гены
гомеостатической, ренин-ангиотензин-альдостероновой, фибринолитической,
кинин-брадикининовой, NO-синтезирующей систем, гены липидного
метаболизма, воспаления, пролиферации и ангиогенеза, молекулярных
сигнальных путей и др.[Hamedian A.A. et al., 2012; Liu X. et al., 2013; Lathen
C. еt al., 2014; Anthony D. et al., 2014; Роlonikov A.V. et аl., 2015; Hejduk P., et
al., 2015; Mааttа K.M. et al., 2015; Zhuang L. et al., 2015; Zhao X. et al., 2016;
LiW. еt al., 2016; Hanukoglu I. et al., 2016; Higasa K. et al., 2017]. Недавние
исследования свидетельствуют о несомненной роли в развитии
эссенциальной гипертензии генов матриксных металлопротеиназ (ММР) [Коломейчук С. Н. и др., 2014; Гаврилюк Н.Д. и др., 2015; Zeng R. et al., 2014; Morris D.R. et al., 2014; Miao S. et al., 2015; Luizon M.R. et al., 2016; ChangT.J. et al., 2016; Del Porto F. et al., 2017]. Это группа ферментов с широким спектром биологических функций, которые отвечают за гидролиз всех компонентов внеклеточного матрикса и участвуют во всех патологических событиях сердечно-сосудистого континуума [Bonnans C. еt al., 2014; Saratzis A. et al., 2015; Yang W. et al., 2015; Fields G.B. et al., 2016].
В ряде работ зарубежных исследователей демонстрируется
вовлеченность полиморфизмов генов ММР в формирование эссенциальной гипертензии и ее осложнений [Bahrehmand F. et al., 2012; Lacchini R. et al., 2012; Wu H.D. et al., 2013; Sakowicz A. et al., 2013; Qintao C. et al., 2014; SriManjari K. et al., 2014; HaoY. еt al., 2015; Abd El-Aziz T. еt al., 2016; Arning A. et al., 2016; Rodriguez-Pеrez J.M. et al., 2016; Kim E.A. et al., 2017]. В России подобные исследования единичны и фрагментарны [Коломейчук С. Н. и др., 2014; Гаврилюк Н.Д. и др., 2015]. Кроме того, полученные результаты отличаются в разных популяциях и не всегда согласуются между собой, что может объясняться как различиями в дизайне исследований, так и патогенетическими особенностями возникновения и течения ЭГ у лиц с разной этнической принадлежностью [Sinha N. et аl., 2015; Liu K.Z. et al., 2016]. Это диктует необходимость проведения дальнейших исследований патогенетической роли полиморфизмов генов ММР в формировании эссенциальной гипертензии и ее осложнений в различных российских популяциях.
Работа выполнена в рамках гранта Российского фонда
фундаментальных исследований «Исследование вовлеченности генетических полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ в формирование инсульта на фоне гипертонической болезни у населения Центрального Черноземья России» (№16-34-00114).
Цель исследования: Изучить вклад генетических полиморфизмов матриксных металлопротеиназ в формирование эссенциальной гипертензии и ее осложнений у населения Центрального Черноземья России.
Задачи:
1. Исследовать ассоциации полиморфных генетических маркеров
rs11568818 MMР-7, rs1320632 MMР-8, rs11225395 MMР-8, rs1799750 MMР-1,
rs3025058 MMР-3, rs652438 MMР-12, rs243865 MMР-2, rs17577 MMР-9 с
развитием эссенциальной гипертензии у русского населения Центрального
Черноземья Российской Федерации.
2. Провести анализ ген-генных взаимодействий полиморфных локусов
ММР, вовлеченных в формирование ЭГ.
3. Изучить генно-средовые взаимодействия полиморфизмов
матриксных металлопротеиназ с наиболее значимыми средовыми факторами,
оказывающими модифицирующее влияние на характер ассоциаций генов-
кандидатов при развитии ЭГ.
4. Установить пол-специфические эффекты полиморфных локусов
матриксных металлопротеиназ, определяющих подверженность к
эссенциальной гипертензии.
5. Оценить вклад молекулярно-генетических маркеров ММР в
формирование показателей артериального давления.
6. Проанализировать ассоциации полиморфизмов ММР, их ген-генных
и генно-средовых взаимодействий с развитием ишемического инсульта на
фоне эссенциальной гипертензии.
Научная новизна. Впервые установлены ассоциации генетических
полиморфизмов rs11568818 MMР-7, rs1320632 MMР-8, rs11225395 MMР-8,
rs1799750 MMР-1, rs3025058 MMР-3, rs652438 MMР-12, rs243865 MMР-2,
rs17577 MMР-9 с развитием эссенциальной гипертензии у русского населения
Центрального Черноземья Российской Федерации. Определены генетические
варианты ММР, вовлеченные в формирование ЭГ с поправкой на средовые
факторы риска развития ЭГ. Впервые изучены эпистатические
взаимодействия между полиморфными вариантами генов ММР и определен
их вклад в формирование генетической компоненты подверженности
эссенциальной гипертензии. Установлены пол-специфические особенности
ассоциаций изучаемых генов-кандидатов с восприимчивостью к ЭГ.
Проанализирован вклад полиморфизмов генов ММР в формирование
показателей артериального давления. Продемонстрировано важное
модифицирующее влияние курения и употребления алкоголя на характер ассоциаций молекулярно-генетических маркеров ММР с развитием гипертензии и ее осложнений. Установлены генетические полиморфизмы ММР, их межгенные и генно-средовые взаимодействия, вовлеченные в формирование ишемического инсульта на фоне ЭГ. Получен патент РФ на изобретение №2624480 от 04.07.2017 «Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ».
Научно-практическое значение. Результаты проведенного
исследования расширяют современные представления о молекулярно-
генетических основах этиопатогенеза эссенциальной гипертензии. Данные,
полученные в ходе исследования, могут использоваться для формирования
среди пациентов с ЭГ групп повышенного риска развития ишемического
инсульта. Полученные результаты могут использоваться на курсах
повышения квалификации медицинских работников и при чтении
специальных курсов по медицинской и клинической генетике, неврологии,
кардиологии в вузах медицинского профиля. Результаты работы
используются в учебном процессе в ФГАОУ ВО «Белгородский
государственный национальный исследовательский университет» и в
практической деятельности сотрудников неврологического и
кардиологического отделений Белгородской областной клинической
больницы Святителя Иоасафа.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфные маркеры rs11568818 MMР-7, rs1320632 MMР-8, rs11225395 MMР-8, rs1799750 MMР-1, rs3025058 MMР-3, rs652438 MMР-12,
rs17577 MMР-9 ассоциированы с развитием эссенциальной гипертензии у русского населения Центрального Черноземья Российской Федерации.
2. В формирование ЭГ существенный вклад вносят ген-генные
взаимодействия полиморфизмов матриксных металлопротеиназ rs1320632
MMР-8, rs11225395 MMР-8 и rs11568818 MMР-7 и их генно-средовые
взаимодействия с курением.
-
Вовлеченность генетических полиморфизмов ММР в формирование ЭГ характеризуется половым диморфизмом.
-
Вклад генов-кандидатов ММР в развитие ишемического инсульта на фоне ЭГ наиболее значим у мужчин, и важное модифицирующее значение при этом имеет злоупотребление алкоголем.
Апробация работы. Основные результаты диссертационного
исследования доложены и обсуждены на: IX-X-XI Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2014, 2015, 2016); всероссийской научной конференции молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2014); X научной конференции НИИ Медицинской генетики СО РАМН «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014); VII съезде Российского общества медицинских генетиков (Санкт-Петербург, 2015); VI Международном биомедицинском конгрессе «SHBC-2015: Advancing Healthcare Into The Future: Innovate, Improve, Integrate» (Сингапур, 2015); XVIII Международной медико-биологической конференции молодых исследователей, посвященной двадцатилетию медицинского факультета СПбГУ «Фундаментальная наука и клиническая медицина: человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2015); Региональной научно-практической конференции молодых исследователей «Перспективные инновационные разработки молодых исследователей Белгородской области – развитию региона» (Белгород, 2015); 81-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых учных с международным участием посвящнной 81-летию КГМУ «Молоджная наука и современность» (Курск, 2016), II Международной научной конференции «Постгеномные технологии в медицине: от теории к практике», (Воронеж, 2016), VIII Международном конгрессе «Кардиология на перекрестке наук» (Тюмень, 2017).
Личный вклад автора. Соискатель принимал участие во всех
подготовительных и основных этапах работы. Автором лично
проанализированы и обобщены литературные данные по исследуемой
тематике, разработаны методические подходы для решения поставленных
цели и задач исследования, проведено типирование молекулярно-
генетических маркеров, осуществлена обработка данных методами генетико-
эпидемиологического анализа, обобщены полученные результаты. По итогам
проведенного исследования соискателем подготовлены основные
публикации, проведена апробация результатов, написана и оформлена рукопись.
Публикации. По итогам диссертационного исследования опубликовано 18 печатных работ, в том числе 5 в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ. Получен патент на изобретение.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список литературы и приложения. Диссертационная работа изложена на 230 страницах машинописного текста и содержит 53 таблицы и 30 рисунков. Библиографический список используемой литературы включает 436 источников, из которых 396 зарубежные.
Матриксные металлопротеиназы, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
Эти цинк-зависимые эндопептидазы секретируются в межклеточное пространство и обладают протеолитической активностью в отношении всех компонентов внеклеточного матрикса – коллагенов, эластина, гликозаминогликанов, фибронектина, протеогликанов, ламининов, энтактина [Siefert S. et al., 2012; Fields G.B. et al., 2016]. За синтез и секрецию матриксных металлопротеиназ отвечают множество клеток, в том числе гладкомышечные клетки, эндотелиоциты и макрофаги [Nissinen L. et al., 2014]. ММР-опосредованная деградация внеклеточного матрикса индуцирует клеточную пролиферацию и гипертрофию сосудов [Tummalapalli C.M. et al., 2011]. Подобные эффекты, наряду с гемодинамическим перенапряжением, воспалительной реакцией и гипоксией, приводят развитию ригидности сосудов и стойкому повышению артериального давления [Duvall W.L., 2015; Чистяков Д.А. и др., 2016].
Важную патофизиологическую роль в возникновении и течении ЭГ играет ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РААС). Основным биологически активным агентом РААС является ангиотензин II (АТ II), который вовлечен в каждый из этапов сердечно-сосудистого континуума и отвечает за сужение сосудов, ремоделирование сердца и сосудов, воспаление, тромбоз, разрыв бляшек, синтез тканями активных форм кислорода (АФК) и усиление оксидантного стресса [Leenen F.H., 2014; Sriramula S. et al., 2013]. Кроме того, АТ II стимулирует выработку факторов роста в гладкомышечных клетках сосудов, индуцирует экспрессию и высвобождение матриксных металлопротеиназ и модулирует миграцию и пролиферацию эндотелиоцитов [Лупач Н.М. и др., 2010; Rodriguez J. et al., 2007]. Совместно с брадикинином, ангиотензин II отвечает за формирование протромбинового/фибринолитического состояния сосудов и способствует атерогенезу [Nikolic S. B. et al., 2014].
Неотъемлемым процессом, сопровождающим формирование и развитие ЭГ, является воспаление. В ответ на постоянное травмирование эндотелия продуцируется хемокины, в результате чего в сосудистую стенку проникают моноциты, трансформирующиеся в макрофаги, и, в дальнейшем, в ксантомные («пенистые») клетки [Chamarthi B. et al., 2011; Wu K.L. et al., 2012]. Накопление «пенистых» клеток в толще сосуда является признаком формирования атеросклеротической бляшки, разрыву которой способствуют продуцируемые макрофагами матриксные металлопротеиназы [Турна А.А. и др., 2009; Полякова А. В. и др., 2011]. Исследования последних лет показали, что маркером и посредником воспаления является С-реактивный белок, к функциям которого относятся индуцирование синтеза молекул клеточной адгезии, активация системы комплемента, инициирование проникновения моноцитов в сосудистую стенку, стимуляция поглощения макрофагами липопротеинов низкой плотности [Wei S.G. et al., 2015].
Эндотелиальными и поддерживающими клетками секретируются ангиогенные факторы роста, такие как факторы роста фибробластов a и b, трансформирующие факторы роста и , фактор роста эндотелия сосудов, ангиогенин и другие [Behl T. et al., 2015; Gaffney J. et al., 2015]. Показано, что в плазме крови пациентов с артериальной гипертензией значительно повышаются уровни целого ряда факторов ангиогенеза, что, несомненно, указывает на вовлеченность последнего в патогенез ЭГ [Хаишева Л.А. и др., 2012].
Ангиогенез является мощным физиологическим процессом, который запускается в организме при уменьшении кровоснабжения жизненно важных органов в результате стеноза или окклюзии сосудов, что наблюдается при эссенциальной гипертензии [Ganss R., 2015; Ferroni P. et al., 2015]. Maulik N. установил, что снижение функциональности и сокращение количества капилляров сопряжено с увеличением общего периферического сопротивления при гипертензии [Maulik N., 2016]. Генерация капилляров из уже существующих сосудов является инвазивным процессом, сопровождающимся деградацией и ремоделированием базальной мембраны между эндотелием и перицитами, а также внеклеточного матрикса сосуда и ткани-мишени [Thijs A.M. et al., 2013; Liu Q. et al., 2015]. Протеолитическое расщепление внеклеточного матрикса, а также активация и модификация факторов роста, цитокинов и их рецепторов, индуцирование специфических ингибиторов, выполняются матриксными металлопротеиназами [Rohde L.E. et al., 2014]. Экспериментальные исследования доказали, что нормальный ангиогенез требует строгого соблюдения баланса между протеолитической активностью и ингибированием матриксных металлопротеиназ [Турна А.А. и др., 2009].
На сегодняшний день растет число данных, подтверждающих, что неконтролируемый процесс протеолиза служит одним из ключевых звеньев сердечно-сосудистого континуума и вовлечен в формирование ЭГ [Schmid-Schnbein G.W., 2011; Sinha N. et аl., 2015; Liu K.Z. et al., 2016]. Очевидно, что аномальная и неконтролируемая протеолитическая активность отрицательно сказывается на тканях сосуда, вызывая изменения в его структуре и нарушая функции [Liu Q. et al., 2015]. Nagai Y. и Kitagawa K. выяснили, что повышенная активность ферментов внеклеточного матрикса вызывает разрушение базальной мембраны и патологическое истончение сосудистой стенки, что ведет к появлению микроаневризм и, как следствие, возникновению инсультов [Nagai Y. et al., 2016].
Вовлеченность генов матриксных металлопротеиназ в формирование эссенциальной гипертензии и ее осложнений
Ученые центра генома человека (г. Токио) проанализировали вовлеченность двух SNP-полиморфизмов ММP-2 (rs243847 и rs243865) в формирование внутричерепной аневризмы у пациентов с эссенциальной гипертензией. Показано, что данные полиморфизмы являются факторами риска (р=0,00086 и р=0,00090, соответственно) развития сердечнососудистой патологии в японской популяции [Low S.K. et al., 2011].
Исследование вовлеченности полиморфного маркера rs243865 ММP-2 в патогенез ишемической болезни сердца у пациентов с ЭГ, проведенное китайскими учеными, показало, что замена дикого аллеля С на мутантный аллель Т не влияет на восприимчивость к данной патологии у населения Китая [Hua Y. et al., 2009; Chen W. et al., 2014].
Hao Y. и его коллеги изучали связь между полиморфным маркером rs243865 гена ММP-2 и развитием ишемического инсульта у больных эссенциальной гипертензией в китайской популяции. Многофакторный логистический регрессионный анализ не выявил ассоциаций между исследуемым полиморфизмом и возникновением данной патологии [Hao Y. et al., 2015].
Несколько работ зарубежных исследователей посвящено изучению вклада в развитие сердечно-сосудистой патологии полиморфизмов гена ММP-3. Наибольшее внимание уделяется rs3025058 и rs35068180 [Morris D.R. et al., 2014; Hao Y. et al., 2015; Abd El-Aziz T. et al., 2016]. Sakowicz A. и его коллегами исследована вовлеченность полиморфизма промоторной области ММP-3 (rs3025058) в развитие атеросклероза у польского населения.
Установлено, что генетический вариант 6А коррелирует с прогрессированием сужения просвета и ассоциируется с острым инфарктом миокарда у больных с ЭГ в исследовании случай-контроль (OR=1,568, 95% СI=1,201-2,048, р=0,008) [Sakowicz A. et al., 2013]. Проспективное исследование связи полиморфизма rs3025058 MMP-3 с аневризмой аорты на фоне эссенциальной гипертензии, проведенное группой австралийских ученых, показало, что полиморфный вариант 6А ассоциирован с повышенным АД и разрывом аорты у больных с ЭГ (OR=1,48; 95% СI=1,23-1,78, р=3,9510-5) [Morris D.R. et al., 2014]. Учеными американского общества клинической патологии было показано, что у пациентов с эссенциальной гипертензией с генотипом 5А/5А по локусу rs3025058 ММP-3 (-1612 5A/6A) риск развития осложнений после острого инфаркта миокарда в пять раз выше, чем у носителей генотипа 6А/6А [Abd El-Aziz T. et al., 2016]. В работе J.M. Rodriguez-Perez et al. не было установлено ассоциаций полиморфизма ММP-3 rs3025058 с развитием инфаркта миокарда у пациентов с артериальной гипертензией в мексиканской популяции (р 0,05) [Rodriguez-Perez J.M. et al., 2016].
Данные об ассоциации генетического полиморфизма rs3025058 ММP-3 с развитием эссенциальной гипертензии не подтверждаются и при изучении популяции Китая. Многофакторный логистический регрессионный анализ показал отсутствие корреляции между изучаемым полиморфизмом и возникновением ЭГ [Hao Y. et al., 2015].
Исследовательская группа Мельбурнского университета (Австралия) определяла риск возникновения сердечно-сосудистой патологии с учетом генотипа по локусу rs35068180 MMP-3 (-1171 5А/6А). Установлено, что уровень экспрессии гена у гетерозигот 5A/6A ММP-3 оптимален для ремоделирования и поддержания эластичности сосудов, что снижает риск возникновения сердечно-сосудистой патологии в группе носителей данного генотипа [Medley, T. L. et al., 2013].
Канадскими исследователями проведено исследование, в ходе которого установлено, что больные с ЭГ, гомозиготные по аллелю 6А rs35068180 ММР-3 характеризуются более быстрым прогрессированием атеросклероза коронарных сосудов по сравнению с пациентами с генотипами 5А/5А и 5А/6А [Richardson, P. D. et al., 2014].
Рядом исследователей проводится анализ вовлеченности гена ММР-7 в развитие ЭГ, активно изучаются SNР-полиморфизмы rs11568818 и rs11568819 [Jormsj S. et al., 2011; Mishra A. et al., 2012; Sri Manjari K. et al., 2014]. В работе швейцарских ученых показано, что носители генотипа GG по локусу rs11568818 MMP-7 (-181A/G) и носители генотипа ТТ по локусу rs11568819 ММP-7 (-153 C/T) предрасположены к возникновению сердечнососудистых заболеваний, в частности, к эссенциальной гипертензии и атеросклеротическому поражению сосудов [Jormsj S. et al., 2011].
Исследование мексиканской популяции показало, что однокуклеотидный полиморфизм rs11568818 MMP-7 (-181 A/G) не ассоциирован с генетической предрасположенностью к инфаркту миокарда у больных с ЭГ (р 0,05) [Pеrez-Hernаndez N. et al., 2012].
В исследовании A. Mishra и его коллег (Индия) проведен анализ ассоциаций между полиморфизмом rs11568818 ММP-7 и возникновением эссенциальной гипертензии, который также не выявил достоверной разницы между группами больных и контроля (р 0,05) [Mishra A. et al., 2012].
Однако, другой группой индийских ученых показано, что G аллель полиморфизма rs11568818 ММP-7 и Т аллель полиморфизма rs11568819 ММP-7 обеспечивают более высокую транскрипционную активность гена in vitro. Носительство мутантных аллелей по указанным локусам коррелирует с размером коронарной артерии у пациентов с эссенциальной гипертензией в индийской популяции [Sri Manjari K. et al., 2014].
Молекулярно-генетические методы
Уровень липопротеидов высокой плотности, напротив, выше в контрольной группе по сравнению с группой больных (р 0,001). Уровень лейкоцитов и скорость оседания эритроцитов достоверно выше в группе больных по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что у 32,91% больных ЭГ зарегистрирован сахарный диабет, а у 26,62% – ишемическая болезнь сердца. Также установлено, что в группе больных эссенциальной гипертензией удельный вес индивидуумов, имеющих отягощенный семейный анамнез по сердечно-сосудистым заболеваниям, вдвое выше (р 0,001), чем в группе контроля.
Общеизвестно, что в отношении восприимчивости к возникновению эссенциальной гипертензии и характера ее течения наблюдается половой диморфизм. В связи с этим, представлялось значимым оценить медико-биологические, клинические и клинико-лабораторные характеристики обследуемых групп в зависимости от пола. Сравнение мужчин с ЭГ с мужчинами контрольной группы и женщин с ЭГ с женщинами контрольной группы по патогенетически значимым признакам и факторам риска эссенциальной гипертензии показало, что среди них соблюдаются те же тенденции, которые были выявлены и при сравнении групп больных и контроля в целом (приложения 1, 2). Как в группе мужчин, так и в группе женщин, среди больных с ЭГ, по сравнению с контрольной группой, выше индекс массы тела (р 0,001) и более высокий удельный вес индивидуумов с ожирением I, II, III степени (в 2-17 раз, р 0,001). Уровни привычного артериального давления и АД при поступлении (р 0,001), показатели холестерина, триглицеридов, ЛПНП, гликемии, лейкоцитов и СОЭ (р 0,001) достоверно выше в группе больных с ЭГ по сравнению с индивидуумами без сердечно-сосудистой патологии, как среди мужчин, так и среди женщин. Следует отметить, что отягощенный семейный анамнез по ССЗ зарегистрирован у 61,52% мужчин с ЭГ (что в 2,2 раза выше, чем среди мужчин в группе контроля, р 0,001) и у 69,87% женщин с ЭГ (что в 1,5 раза выше по сравнению с группой женщин без ЭГ, р 0,001).
Таким образом, резюмируя полученные данные, следует отметить, что пациенты с эссенциальной гипертензией имеют более высокие показатели привычного АД и АД при поступлении, уровни лейкоцитов, СОЭ, глюкозы, холестерина, триглицеридов, ЛПНП и повышенные значения индекса массы тела. Среди больных с ЭГ значительно выше (в 2,2-32,5 раз) удельный вес индивидуумов с ожирением по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем, в группе больных наблюдаются более низкие показатели ЛПВП. Среди пациентов с ЭГ значительно выше удельный вес индивидуумов с патологией сердечно-сосудистой и эндокринной систем (в том числе, сахарным диабетом), а также индивидуумов с отягощенным семейным анамнезом.
Выявленные особенности наблюдаются и при стратифицированном анализе обследованных групп по полу. Установлено, что удельный вес индивидуумов с ожирением в 5,2 раза выше среди мужчин и в 3,2 раза выше среди женщин с эссенциальной гипертензией по сравнению с контрольной группой. Среди больных с эссенциальной гипертензией как у мужчин, так и у женщин, отмечаются более высокие значения ИМТ, а также уровней привычного АД и АД при поступлении, триглицеридов, холестерина, ЛПНП, гликемии, лейкоцитов и СОЭ (р 0,001). Мужчины и женщины с ЭГ чаще (в 2,2 и в 1,5 раза соответственно), чем индивидуумы контрольной группы, имеют отягощенный семейный анамнез, причем доля женщин с наследственной отягощенностью несколько выше, чем мужчин (69,87% и 61,52% соответственно, р 0,05).
В настоящем разделе исследования представлены результаты изучения вклада полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ rs11568818 MMР-7, rs1320632 MMР-8, rs11225395 MMР-8, rs1799750 MMР-1, rs3025058 MMР-3, rs652438 MMР-12, rs243865 MMР-2, rs17577 MMР-9 в развитие ЭГ.
Для всех генетических маркеров в исследуемых выборках больных с ЭГ и контроля эмпирическое распределение генотипов находится в соответствии с теоретически ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (р 0,05) (таблица 9). Наблюдаемая гетерозиготность в контрольной группе изменялась в диапазоне от Н0=0,09 для rs652438 MMP-12 до Н0=0,51 для rs3025058 MMP-3. В группе больных эссенциальной гипертензией Н0 варьировала от 0,12 для rs652438 MMP-12 до 0,49 для rs3025058 ММР-3 и rs11568818 ММР-7.
Проведен анализ частот генотипов исследуемых генов-кандидатов. В качестве референсного (ref) избирался наиболее частый гомозиготный генотип. Применительно к референсному генотипу производился расчет отношения шансов и 2 по генотипам, соответствующим гетерозиготам и гомозиготам по минорному аллелю.
При оценке ассоциаций генетических вариантов ММР с развитием ЭГ в связи с тем, что по каждому локусу мы рассматривали три группы сравнения в соответствии с количеством изучаемых генотипов, статистически значимым уровнем считали р 0,017 (вводилась поправка Бонферрони, равная трем). Установлено, что частота генотипа ТТ rs11225395 MMP-8 достоверно ниже среди больных эссенциальной гипертензией (20,41%) по сравнению с контрольной группой (25,76%). Данный генотип имеет протективное значение при формировании ЭГ (ОR=0,66 95% СI 0,48-0,92, р=0,01, ррerm=0,013, мощность – 73%). Также по данному локусу выявлены различия и в частотах аллелей (таблица 10): в контрольной группе наблюдается более высокая частота аллеля T rs11225395 MMP-8 (49,89%) по сравнению с группой пациентов с ЭГ (44,66%, p=0,01, ррerm=0,011, мощность – 83%). Таким образом, минорный аллель Т является протективным фактором при развитии гипертензии (ОR=0,81 95% СI 0,69-0,95).
Значение индекса массы тела и дислипидемий в характере ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием эссенциальной гипертензии
Примечательно, что полиморфные маркеры rs1320632 ММР-8 и rs1799750 MMP-1, обнаруживающие эпистатическое взаимодействие при анализе в двухлокусных моделях, демонстрируют связь с развитием ЭГ и в трехфакторной модели в комбинации с курением у мужчин (р=0,01).
Таким образом, в ходе изучения роли средовых факторов риска в характере ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с развитием эссенциальной гипертензии установлено: 1. Полиморфный маркер rs11568818 MMP-7 вовлечен в развитие ЭГ в рамках аддитивной модели с учетом всех рассмотренных кофакторов (ИМТ, дислипидемия, средовые факторы риска) в общей выборке (ОR=0,73 рperm=0,012), а также при стратифицированном по полу анализе у женщин (OR=0,78, рperm=0,016). 2. С развитием эссенциальной гипертензии ассоциированы гаплотипы AА, AАСА и AАСАТ локусов rs11568818 ММР-7, rs1320632 ММР-8, rs11225395 ММР-8, rs1799750 ММР-1, rs3025058 ММР-3 (рperm=0,001-0,04). При этом у мужчин с формированием ЭГ ассоциирован только гаплотип AАСА, а у женщин – гаплотипы AАСА, AАСАТ, а также гаплотипы AАС (rs11568818 ММР-7, rs1320632 ММР-8, rs11225395 ММР-8) и АС (rs1320632 ММР-8, rs11225395 ММР-8), которые не демонстрировали ассоциаций с ЭГ при анализе общей выборки. Все выявленные гаплотипы являются факторами риска развития ЭГ у их носителей при коррекции на все кофакторы (OR 1). 3. Локусы rs1320632 ММР-8 и rs1799750 MMP-1, эпистатически взаимодействуя, повышают риск развития эссенциальной гипертензии (OR=2,05-2,08). 4. Установлены трехлокусные модели межгенных взаимодействий при развитии ЭГ, включающие полиморфизмы rs11568818 ММР-7, rs1320632 ММР-8, rs11225395 ММР-8 (OR=2,12-2,22) и 4 четырехфакторные модели генно-средовых взаимодействий при формировании ЭГ, в состав которых входят статус курение и полиморфизмы rs1320632 ММР-8, rs11225395 ММР 8, rs11568818 ММР-7, rs17577 MMP-9, rs3025058 MMP-3, rs652438 MMP-12.
У мужчин с развитием ЭГ ассоциирована модель курениеrs1799750 MMP 1rs1320632 MMP-8 (OR=2,07), а у женщин – модели курениеrs1799750 MMP-1rs3025058 MMP-3rs11225395 MMP-8 (OR=3,51) и курениеrs11568818 MMP-7rs11225395 MMP-8 (OR=2,13). Уровень артериального давления (АД) является главным диагностическим критерием при постановке диагноза эссенциальной гипертензии и в значительной степени определяет клиническую картину данного заболевания [Islam S.M. et al., 2015; Thebault J.L. et al., 2015; Gu T. еt al., 2016; Mao S.Q. et al., 2017]. Количественный вклад генетических факторов в дисперсию АД оценивается около 30% [Saeed A.A. et al., 2016; Ozturk M.T. et al., 2017]. На данном этапе исследования нами проанализирована вовлеченность полиморфизмов матриксных металлопротеиназ в формирование уровня артериального давления в объединенной выборке больных ЭГ и контроля (n=1405) с учетом ковариант, в рамках двух моделей – модели 1 (коварианты наличие ЭГ, пол, возраст, ИМТ, уровни холестерина, триглицеридов, ЛПВП, ЛПНП, злоупотребление алкоголем, курение) и модели 2 (коварианты наличие ЭГ, пол, возраст, ИМТ, уровни холестерина, триглицеридов, ЛПВП, ЛПНП, злоупотребление алкоголем, курение, низкая физическая активность, частые стрессы, редкое употребление овощей и фруктов, предпочтение к жирной пище, предпочтение к соленой пище).
Наблюдаемое распределение генотипов в исследуемой выборке находится в соответствии с теоретически ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга (р 0,05) (таблица 34).
Анализ соответствия распределения генотипов полиморфизмов ММР теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга в исследуемой выборке Наблюдаемая гетерозиготность варьировала в диапазоне от Н0=0,11 для rs652438 MMP-12 до Н0=0,50 для rs3025058 MMP-3. Ввиду несоответствия показателей САД и ДАД нормальному распределению (раздел 3.1), была проведена их логарифмическая трансформация и уже эти трансформированные значения использовались при дальнейшем генетико-эпидемиологическом анализе. Исследование проводили в рамках трех генетических моделей (аддитивной, доминантной, рецессивной), с помощью программного обеспечения Plink. Ложноположительные результаты исключали проведением адаптивного пермутационного теста и вычислением рperm. Дополнительно вводили поправку Бонферрони равную 3 (в соответствии с числом рассматриваемых генетических моделей), после чего статистически значимым считали рperm 0,017. Результаты линейного регрессионного анализа вовлеченности полиморфизмов ММР в формирование показателей артериального давления представлены в таблице 35. Установлено, что полиморфизм rs11568818 MMP-7 вовлечен в формирование уровня систолического АД в рамках доминантной (=-0,04; р=0,01, ррerm=0,011) и аддитивной (=-0,03,-0,02; р=0,001, ррerm=0,004) моделей.
Выявленные ассоциации остаются статистически значимыми и при введении в исследование в качестве ковариант средовых факторов, характеризующих особенности питания, уровень физической активности и подверженность стрессам (модель 2). Полиморфный маркер rs11568818 MMP-7 оказывает протективное влияние, понижая уровень систолического артериального давления (0). Примечательно, что данный локус ранее демонстрировал значимые ассоциации и с развитием эссенциальной гипертензии, также оказывая протективный эффект (OR=0,59-0,73, разделы 3.3-3.4). Уровень ДАД не ассоциирован с исследуемыми генетическими полиморфизмами ММР.